La fabricación de una memoria de forma "Auto-ajuste" basado en PCL Bioactivos, Polymer Andamios

Summary

Son de interés los andamios capaces de caber dentro de los defectos óseos craneomaxilofaciales (CMF) mientras exhiben osteoconductividad y bioactividad. Este protocolo describe la preparación de un andamio con memoria de forma basado en diacrilato de policaprolactona (PCL-DA) utilizando un método de lixiviación de partículas de fundición con solvente (SCPL) que emplea una plantilla de sal fundida y la aplicación de un recubrimiento de polidopamina bioactivo.

Abstract

La ingeniería de tejidos ha sido explorada como una estrategia alternativa para el tratamiento de defectos óseos cráneo-maxilofaciales (CMF) de tamaño crítico. Esencial para el éxito de este enfoque es un andamio que sea capaz de encajar conformemente dentro de un defecto irregular y, al mismo tiempo, tener la biodegradabilidad, la interconectividad de poros y la bioactividad necesarias. Por la naturaleza de sus propiedades de recuperación de forma y fijeza, los andamios de polímero con memoria de forma (SMP) podrían lograr defectos "autoajustables". De esta manera, después de la exposición a solución salina caliente (~60 ºC), el andamio SMP se volvería maleable, lo que permitiría que se presionara a mano en un defecto irregular. El enfriamiento posterior (~37 ºC) devolvería el andamio a su estado relativamente rígido dentro del defecto. Para cumplir con estos requisitos, este protocolo describe la preparación de andamios SMP preparados mediante el curado fotoquímico de diacrilato de policaprolactona biodegradable (PCL-DA) utilizando un método de lixiviación de partículas de fundición con solvente (SCPL). Se utiliza una plantilla de sal fundida para lograr la interconectividad de poros. Para lograr la bioactividad, se aplica un recubrimiento de polidopamina a la superficie de las paredes de los poros del andamio. También se describe la caracterización de los comportamientos de autoajuste y memoria de forma, la interconectividad de poros y la bioactividad in vitro.

Introduction

Actualmente considerado el estándar de oro de cráneo-maxilofacial (CMF) tratamientos de defectos de hueso, el trasplante de injertos autólogos recolectados se ve obstaculizado por procedimientos de injerto complejos, morbilidad del sitio donante y la disponibilidad ^limitada de 1. Una dificultad particular se perfila y se fija el autoinjerto rígida firmemente en el defecto a fin de obtener la oseointegración y para evitar la reabsorción del injerto. La ingeniería de tejidos se ha investigado como una estrategia alternativa al autoinjerto y sustitutos óseos sintéticos (por ejemplo, cemento óseo) ^2,3. Fundamental para el éxito de un enfoque de la ingeniería de tejidos es un andamiaje con un conjunto específico de propiedades. En primer lugar, a fin de lograr la osteointegración, el andamio debe formar un estrecho contacto con el tejido óseo adyacente ^4. El andamio también debe ser osteoconductiva, permitiendo la migración celular, difusión de nutrientes ^y 4,5 deposición neotejido. Este comportamiento se consigue generalmente con sca biodegradablesffolds exhiben una morfología de poro altamente interconectado. Por último, el andamio debe ser bioactivo con el fin de promover la integración y la unión con el tejido óseo circundante ^5.

A continuación, presentamos un protocolo para preparar un andamio ingeniería de tejidos con estas propiedades. Es importante destacar que este andamio exhibe la capacidad de "auto-ajuste" en defectos irregulares CMF debido a su comportamiento de memoria de forma ^6. Polímeros con memoria de forma termosensible (SMPS) se sabe que someterse a cambio de forma cuando se expone al calor ^7,8. SMP se componen de "NETPoints" (es decir, químicas o reticulaciones físicas) que determinan la forma permanente y "segmentos de conexión" que mantienen la forma temporal y recuperan la forma permanente. Los segmentos de conmutación presentan una temperatura de transición térmica (T _trans) que corresponde a cualquiera de la transición vítrea _(Tg) o se funden de transición _(Tm) del polímero. ComoEn consecuencia, las SMP puede ser secuencial deforma en una forma temporal en T> T _trans, fijo en forma temporal en T trans, y se recuperó a la forma permanente en T> T _trans. Así, un andamio de SMP podría lograr "auto-ajuste" dentro de un defecto recurrente de la siguiente ^6. Después de la exposición al calor de solución salina (T> T _trans), un andamio de SMP se convertiría maleable, permitiendo un andamio cilíndrica genéricamente preparado para estar en un defecto irregular presionado a mano, con la recuperación de la forma promover la expansión del andamio hasta el límite del defecto. Después de la refrigeración (T trans), el andamio volvería a su estado relativamente más rígida, con forma de fijeza mantener su nueva forma temporal dentro del defecto. En este protocolo, un andamio SMP se prepara a partir de policaprolactona (PCL), un polímero biodegradable estudió extensivamente para la regeneración de tejidos y otras aplicaciones biomédicas ^9-11. Para memoria de forma, THe T _m de PCL sirve como el T _trans y varía entre 43 y 60 ºC, dependiendo del peso molecular de la PCL ^12. En este protocolo, el T _trans (es decir _Tm) del andamio es 56,6 ± 0,3 ºC ^6.

A fin de lograr osteoconductividad, se desarrolló un protocolo para hacer andamios SMP basados ​​en PCL con poros interconectados altamente basa en un método de fundición a presión de partículas de disolvente-lixiviación (SCPL) ^6,13,14. Diacrilato de policaprolactona (PCL-DA) (M _{n =} ~ 10.000 g / mol) se utilizó para permitir el rápido, la reticulación fotoquímica y se disolvió en diclorometano (DCM) para permitir disolvente a presión sobre la plantilla sal. Después de cura fotoquímica y evaporación del disolvente, la plantilla sal se separó por lixiviación en agua. El tamaño medio de la sal regula el tamaño de los poros del andamio. Es importante destacar que la plantilla de la sal se fusionó con agua antes de disolvente de fundición a presión para lograr interconnectivi de porodad.

La bioactividad se imparte al andamio SMP por la formación in situ de un recubrimiento polydopamine en paredes de los poros ^6. La bioactividad es a menudo introducido en andamios por la inclusión de vidrio o de cerámica de vidrio rellenos ^15. Sin embargo, estos pueden dar lugar a propiedades mecánicas frágiles no deseados. La dopamina se ha demostrado para formar una capa adherente polydopamine, delgada sobre una variedad de sustratos ^16-19. En este protocolo, el andamio SMP se sometió a una solución ligeramente básica (pH = 8.5) de la dopamina para formar un recubrimiento de nanothick polydopamine en todas las superficies de pared de poro ^6. Además de mejorar la hidrofilia de la superficie para mejorar la adhesión celular y la propagación, polydopamine ha demostrado ser bioactivo en términos de formación de hidroxiapatita (HAp) tras la exposición a fluido corporal simulado (SBF) ^18,20,21. En un último paso, el andamiaje recubierto se expone a un tratamiento térmico a 85 ºC (T> T _trans) which conduce al andamio densificación. El tratamiento térmico se señaló anteriormente a ser esencial para el comportamiento de memoria de forma de andamio, tal vez debido a dominios cristalinos PCL reorganizar a mayor proximidad ^14.

Tenemos, además, describen los métodos para caracterizar el comportamiento de auto-ajuste dentro de un defecto modelo irregular, moldear el comportamiento de memoria en términos ensayos de compresión mecánica cíclica térmicos de deformación controlada (es decir, recuperación de la forma y la forma de fijeza), poro morfología, y en la bioactividad in vitro. También se presentan estrategias para adaptar las propiedades de andamios.

Protocol

1. Sintetizar PCL-DA Macrómero

1. Ejecute la reacción acrilación.
   1. Pesar 20 g de PCL-diol (M _{n =} ~ 10.000 g / mol) en un matraz de 250 ml de fondo redondo equipado con una barra agitadora magnética de teflón cubierto.
   2. Disolver el PCL-diol en DCM.
      1. Añadir 120 mLlof DCM al matraz (concentración = 0,17 g / ml).
      2. Colocar un tapón de caucho de manera suelta en el cuello del matraz a fin de evitar la acumulación de presión mientras que también la prevención de la evaporación del DCM.
      3. Solución del Stir por ~ 30 min a ~ 250 rpm para disolver completamente el polímero.
   3. Añadir ~ 6,6 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) a la solución y se disuelve con agitación.
   4. Colocar un tapón de caucho firmemente en el cuello del matraz. Deje que la solución para continuar la agitación.
   5. A través del tabique de caucho, purgar suavemente el matraz con _N2 durante ~ 3 min utilizando una _entrada de N2 aguja de presión positiva y una aguja abiertacomo una salida.
   6. Retire la entrada y la salida N _2.
   7. Añadir 0,56 ml (4,0 mmol) de trietilamina (Et ₃ N) gota a gota mediante una jeringa de vidrio equipado con una aguja insertada a través del septo de caucho.
   8. Añadir 0,65 ml (8,0 mmol) de cloruro de acriloílo gota a gota mediante una jeringa de vidrio equipado con una aguja insertada a través del septo de caucho.
   9. Devolver la entrada de N ₂ al matraz y permiten que el contenido en agitación bajo presión positiva de N ₂ ~ 30 min.
   10. Pre-calentar un baño de aceite a 55 ºC.
   11. Después de que el asignado ~ 30 min, retire la entrada de N ₂ y sustituir el septum con un condensador.
   12. Sumergir el matraz en el baño de aceite precalentado.
   13. Permitir que el contenido del matraz en agitación durante 20 h.
   14. Después del 20 hr asignado, retire el matraz del baño de aceite y permiten que los contenidos se enfríen a temperatura ambiente.
   15. Usando un evaporador rotatorio, retire DCM disolvente del matraz.
2. Purify el producto PCL-DA crudo.
   1. Al matraz, añadir ~ 135 ml de acetato de etilo y se disuelve el crudo PCL-DA.
   2. Gravedad filtrar la solución a través de papel de filtro en un matraz de fondo redondo de 250 ml limpio. (Nota: La solución puede espesar en el papel de filtro, que no pasa fácilmente a través de ser así, aplicar cuidadosamente calor templado, con una pistola de calor..)
   3. Usando un evaporador rotatorio, retire acetato de etilo disolvente del matraz.
   4. Al matraz, añadir ~ 140 ml de DCM y se disuelve el crudo PCL-DA.
   5. Transferir contenido a una de 500 ml embudo de separación.
   6. Para el embudo, añadir 13,5 ml de 2 M de carbonato de potasio (K ₂ CO _3).
   7. Tape el embudo. Mezclar suavemente las dos capas invirtiendo el embudo y se agita suavemente una o dos veces, teniendo cuidado para liberar la presión a través de la llave de paso. Repita 3 veces.
   8. Vuelva a colocar la tapa con una capa de Parafilm y permitir que la mezcla se separe O / N (~ 12 h).
   9. Recoge la parte inferior, ocapa ganic en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
   10. Añadir ~ 5 g de sulfato de magnesio anhidro _(MgSO4) al matraz y agitar suavemente.
   11. Gravedad filtrar la mezcla a través de papel de filtro cualitativo y en un lugar limpio 250 ml matraz de fondo redondo.
   12. Usando un evaporador rotatorio, retire DCM disolvente del matraz.
   13. Seca bajo alto vacío para eliminar DCM residual. (Nota: PCL-DA debe guardarse lejos de la luz.)
   14. Confirme acrilación con ^{1H NMR 22,23.}

2. Preparación de la SMP Andamios (Figura 1)

1. Preparar la plantilla de sal fundida.
   1. Utilice un tamiz de 425 micras para obtener cloruro de sodio (NaCl) partículas ~ 460 ± 70 m de diámetro. (Nota: El tamaño promedio de partícula puede ser confirmado por microscopía electrónica de barrido [SEM] imágenes con el software ImageJ.) ¹⁴
   2. Para un vial de vidrio 3 ml (ID = 12.9 mm), añadir 1,8 g del NaCl previamente tamizada.
   3. Se añade lentamente, en cuatro porciones, 7,5% en peso (basado en el peso de sal) de agua DI (0.146 g) al vial. Mezclar con una espátula de metal después de la adición de cada porción de agua.
   4. Tapar el frasco, envuelva en el tejido y colocarlo verticalmente en un tubo de centrífuga. Centrifugar durante 15 min a 3220 x g.
   5. Retire la tapa y dejar que se seque al aire O / N (~ 12 h).
2. En un nuevo vial de vidrio, preparar una "solución de macrómero" combinando 0,15 g de PCL-DA por ml de DCM. (Nota:. Por un andamio, ~ 1 ml de solución deben estar preparados) tapa y mezcle la solución a alta velocidad en un mezclador de vórtice de ~ 1 min.
3. En un nuevo vial de vidrio de 3 ml, preparar una "solución de fotoiniciador" basado en 10% en peso de 2,2-dimetoxi-2-fenil acetofenona (DMP) en 1-vinil-2-pirrolidinona (NVP). Combine 0,115 g de DMP en 1 ml de NVP. (Nota: Por un andamio, ~ 180 l se requiere.) Cap, envolver en papel de aluminio (para bloquear la luz) y mezclar la solución a alta velocidad en un mezclador vortexpara ~ 1 min. (Nota: Si se prepara con antelación, la solución debe ser refrigerado y protegido de la luz.)
4. Envolver el frasco que contiene la solución de macrómero (excluyendo la tapa) con papel de aluminio (para bloquear la luz) y se añade mediante una pipeta 15 vol% (basado en el volumen total de la solución de macrómero) de la solución de fotoiniciador. Tapar y mezclar la solución a alta velocidad en un mezclador de vórtice de ~ 1 min.
5. Envolver el frasco que contiene la plantilla de sal fundida (excluyendo la tapa) con papel de aluminio (para bloquear la luz) y se añade mediante una pipeta la solución de macrómero / fotoiniciador preparado anteriormente (~ 0,6 ml o hasta que la plantilla está completamente cubierto).
6. Tapar el frasco, envuelva en el tejido y colocarlo verticalmente en un tubo de centrífuga. Centrifugar durante 10 min a 1.260 xg para distribuir la solución de macrómero en toda la plantilla.
7. Quite el papel de aluminio, destape el frasco y exponer a la luz UV (365 nm, 25 W) durante 3 min. O Aire seco / N.
8. Retire la "scaffol contiene sald "del vial con pinzas después de anotar y fractura de la parte superior de la ampolla de vidrio.
9. En un vaso de precipitados de 400 ml, ~ preparar 200 ml de una mezcla agua / disolvente de etanol (1: 1 vol: vol).
10. Mantener el andamio sumergido en el agua / disolvente de etanol durante 4 días con cambios de disolvente diarias.
11. Retire el andamio desde el disolvente y secar al aire O / N.

3. La aplicación de Polydopamine Revestimiento de SMP Andamios (Figura 1)

1. En 400 ml vaso de precipitados equipado con una barra de agitación de teflón cubierto, preparar ~ 200 ml de una solución de clorhidrato de dopamina (2 mg / ml en 10 mM de tampón Tris, pH = 8,5, 25 ºC). Se agita a ~ 150 rpm.
2. Coloque una aguja desechable (longitud = 40 mm; galga = 20) en el armazón, ~ mitad de la distancia a través del andamio. Envuelva un alambre alrededor de la base de la aguja.
3. Sumergir el andamio (con el cubo de la aguja por encima de la superficie de la solución) en la solución de agitar la dopamina mediante el anclaje del cable para el borde del vaso de precipitados.
4. Desgasificar la andamio colocando una jeringa en el cubo de la aguja y su uso para extraer el aire fuera del andamio. (Nota: La desgasificación se completa cuando no más de aire se puede retiró y la solución se ha infiltrado completamente el andamio.)
5. Mantener el andamio sumergida en la solución de la dopamina de agitar durante 16 hr.
6. Retire el andamio de la solución y quitar la aguja. Enjuague con agua DI y seca en un horno de vacío a temperatura ambiente durante 24 horas.
7. Coloque el andamio en un horno 85 ºC durante 1 hora.
8. Deje que el andamio se enfríe a temperatura ambiente. El andamio cilíndrica final será ~ 6 mm de diámetro x ~ 5 mm de altura.

4. Evaluar el comportamiento "Auto-ajuste"

1. Prepare un "modelo irregular defecto CMF" usando una hoja de plástico rígido cuyo espesor es ~ 5 mm. Use un taladro para crear un vacío dentro de la lámina de plástico con un diámetro medio ligeramente menor que ~ 6 mm, como se demuestra en la Figura 2A.
2. En abEAKER, agua DI de calor (que representa el uso clínico de la solución salina) a una temperatura de 60 ºC ~.
3. Coloque el andamio en el vaso de ~ 60 ºC agua. Utilice pinzas para empujar el andamio por debajo de la superficie del agua, la exposición de todas las áreas para el agua. Continuar por unos 2 minutos o hasta que el andamio se suavizó notablemente (Figura 2B).
4. Retire el andamio desde el vaso de precipitados y pulse inmediatamente (a mano) en el defecto del modelo.
5. Dejar enfriar a temperatura ambiente (~ 5.10 min) (Figura 2C).
6. Retirar del defecto para observar la nueva forma temporal, fijo y el regreso del estado relativamente más rígida (Figura 2D).

5. Pruebas de comportamiento con memoria de forma

1. El uso de un analizador mecánico dinámico (DMA; por ejemplo, un TA Instruments Q800 como se utiliza aquí), ejecutar una prueba mecánica cíclica térmica cepa controlado por compresión en un andamio durante dos ciclos (N) para determinar la fijeza de forma (R _f) ydar forma a la recuperación (R _r) (Figura 3).
   1. Equilibrar a 60 ° C (T _alta) durante 5 min.
   2. Comprimir a una deformación máxima _(m ε = 50%) a 50% / min.
   3. Retener en ε _m (5 min).
   4. Enfriar a 25 ° C (T _baja) y mantener durante 10 minutos para fijar la forma temporal.
   5. Retire la carga.
   6. Mida la tensión máxima en el estado libre de estrés (ε _u).
   7. Vuelva a calentar a 60 ° C (T _alta) y mantener durante 10 min para recuperar la forma permanente.
   8. Mida la cepa recuperado (ε _p).
   9. Mientras todavía estaba en 60 ° C (T _alta), iniciar el ciclo de ^nd 2 (N = 2) mediante la compresión del andamio a 50% de la altura recuperada después del ciclo ^st 1 (N = 1).
   10. Repita 5.1.3-5.1.8 Para N = 2.
   11. Calcular R _{f r} y R para N = 1 y 2 usando las siguientes ecuaciones:
       R _{f (N)} = [ε _{u (N)} / ε _m] R _r (N) = _[m ε - ε _{p (N)]} / _[m ε - ε _{p (N} -1)]

6. Visualización Tamaño de poro y la interconectividad de los poros

1. Usando microscopía electrónica de barrido (SEM; por ejemplo, un FEI Quanta SEM tal como se utiliza en el presente documento), observar el tamaño de poro y la interconectividad de los poros.
   1. Usando las pinzas para sostener el andamio SMP, sumergirse en _N2 líquido durante 1 minuto.
   2. Remover de N ₂ líquido y la fractura a lo largo de la mitad del andamio con una hoja de afeitar limpia.
   3. Con cinta de carbono, colocar una de las mitades de andamios SMP sobre la muestraen escena con la superficie fracturada hacia arriba.
   4. Pulverización catódica abrigo con Au-Pt (~ 4 nm).
   5. Capturar la imagen SEM a un voltaje de aceleración recomendada del 10-15 kV (Figura 4A).

7. Ensayos de bioactividad in vitro

1. En un tubo de centrífuga de 50 ml, añadir ~ 30 ml de 1X SBF ^24.
2. Obtener un andamio en su forma permanente original, cilíndrica moldeado. Cortar el andamio a la mitad (a lo largo del borde circular) usando una hoja limpia.
3. Coloque una media andamio individuo en el tubo de centrífuga preparado y gorra.
4. Mantener el tubo a 37 ° C en un baño de agua en condiciones estáticas sin cambios SBF.
5. Después de 14 días, retire el andamio desde el SBF y aire seco durante 24 horas.
6. Con cinta de carbono, colocar el andamio en el escenario de la muestra con la superficie fracturada hacia arriba.
7. Pulverización catódica abrigo con Au-Pt (~ 4 nm).
8. Capturar la imagen de SEM en una reelogiado voltaje de aceleración de 10 hasta 15 kV (Figura 4B).

Results

El andamio SMP basados ​​en PCL resultante es capaz de auto-ajuste en un modelo CMF defecto (Figura 2). Después de una breve exposición a calentar solución salina (~ 60 ° C), el andamio cilíndrica suaviza permitiendo que el andamio para ser presionado manualmente en y expandir dentro del defecto modelo. Después de enfriar a RT, el andamio se fija en su nueva forma temporal que se retiene después de la retirada del defecto.

El comportamiento de memoria de forma de un andamio ...

Discussion

Este protocolo describe la preparación de un andamio a base de PCL polydopamine recubiertos cuya auto-ajuste de la conducta, así como osteoinductividad y bioactividad, hace que sea de interés en el tratamiento de defectos óseos irregulares CMF. Aspectos del protocolo pueden ser alterados para cambiar varias características de andamios.

El protocolo comienza con acrilación de un PCL-diol para permitir la cura UV. En el ejemplo se informó, el ​​PCL-diol M _n es de ~ 10.000 g / mol. S...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Popoliceprolactona-diol (Mn ~ 10.000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
diclorometano (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Secado sobre tamices moleculares
4A 4-dimetilaminopiridina (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Trietilamina (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Cloruro de acriloilo	Sigma-Aldrich	A24109
Acetato de etilo	Sigma-Aldrich	319902
Carbonato de potasio (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Sulfato de magnesio anhidro (MgSO4)	Fisher	M65
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimetoxi-2-fenil acetofenona (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-vinilo-2-pirrolidinona (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Etanol	Sigma-Aldrich	459844
Clorhidrato de dopamina	Sigma-Aldrich	H8502
Tampón Tris (2mol/L)	Fisher	BP1759	Utilizado a una concentración de 10 mM, pH = 8,5
Tamiz	VWR	47729-972
Transiluminador UV (365 nm, 25 W)	Centrífuga UVP	95-0426-02
	Eppendorf	5810 R
Analizador Mecánico Dinámico (DMA)	TA Instruments	Q800
Recubridor de pulverización catódica de alta resolución	Cressington	208HR
Microscopio electrónico de barrido (SEM)	FEI	Quanta 600