Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Resumen

De la lipogénesis de novo y la oxidación de ácidos grasos β-constituyen vías metabólicas claves en los hepatocitos, las vías que son perturbados en varios trastornos metabólicos, incluyendo la enfermedad de hígado graso. Aquí se demuestra el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón y describimos cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β-y la lipogénesis.

Resumen

El metabolismo de los lípidos en el hígado es complejo. Además de importar y exportar lípidos a través de lipoproteínas, los hepatocitos pueden oxidar lípidos a través de la oxidación de ácidos grasos o, alternativamente, sintetizar nuevos lípidos a través de lipogénesis de novo. La suma neta de estas vías está dictada por una serie de factores, que en ciertos estados de enfermedad conducen a la enfermedad del hígado graso. La acumulación excesiva de lípidos hepáticos se asocia con la resistencia a la insulina en todo el cuerpo y la enfermedad coronaria. Las herramientas para estudiar el metabolismo lipídico en hepatocitos son útiles para comprender el papel del metabolismo lipídico hepático en ciertos trastornos metabólicos.

En el hígado, los hepatocitos regulan la descomposición y síntesis de ácidos grasos a través de la oxidación β-grasa y la lipogénesis de novo, respectivamente. La cuantificación del metabolismo en estas vías proporciona información sobre el manejo de los lípidos hepáticos. A diferencia de la cuantificación in vitro, en la que se utilizan hepatocitos primarios, la realización de mediciones in vivo es un reto técnico y requiere muchos recursos. Por lo tanto, la cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β y la lipogénesis de novo en hepatocitos de ratón cultivados proporciona un método sencillo para evaluar el manejo de lípidos de los hepatocitos.

Aquí describimos un método para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón, y demostramos la cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β y la lipogénesis de novo, utilizando sustratos radiomarcados.

Introducción

La enfermedad del hígado graso no alcohólico es una de las principales causas de enfermedad hepática en las culturas occidentalizadas^1,2. La acumulación de lípidos en el hígado se asocia con muerte celular, fibrosis e insuficiencia hepática a través de mecanismos aún desconocidos^3-6. En la enfermedad del hígado graso, la oxidación de ácidos grasos β mediada por hepatocitos y la lipogénesis de novo son determinantes importantes de la acumulación neta de lípidos^7,8. Por lo tanto, este artículo se centrará en el aislamiento de hepatocitos, seguido de la cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β y la lipogénesis de novo.

Se han desarrollado numerosas metodologías para interrogar el metabolismo de los lípidos de los hepatocitos. Aunque es posible medir el metabolismo de la grasa in vivo utilizando isótopos estables^9,10, estos métodos son costosos y requieren un gran número de animales. Además, la capacidad de investigar el efecto de los productos químicos exógenos es limitada debido a la naturaleza de la experimentación in vivo. Por el contrario, el aislamiento de hepatocitos primarios a partir del hígado de ratón proporciona una vía asequible para perseguir¹¹. Además, el estudio de los hepatocitos en cultivo permite a los investigadores estudiar los efectos de diversos productos químicos en el procesamiento de lípidos, al tiempo que sortean las dificultades de la experimentación in vivo. Por último, los hepatocitos aislados evitan cualquier confusión debido a la variación genética, ya que se derivan del hígado de un solo animal.

Aquí aislamos y cultivamos hepatocitos, y medimos la oxidación de ácidos grasos β y la lipogénesis de novo, utilizando palmitato radiomarcado. El protocolo que se detalla a continuación es sencillo, eficaz y reproducible.

Protocolo

Toda la experimentación con animales debe llevarse a cabo de acuerdo con las regulaciones locales y federales y con la aprobación de una administración institucional IACUC y seguridad radiológica.

1. Preparación

1. Varios días antes del ensayo, descongelar la botella 500 ml de hígado Recopilación Medio (LDM) y vuelva a congelar ~ 35 ml alícuotas en tubos de 50 ml cónicos. Almacenar a -20 ° C hasta que se necesite.
2. Un día antes del ensayo, pre-esterilizar herramientas de disección limpia por autoclave.
3. En el día del ensayo, el tratamiento de la cantidad necesaria de placas de cultivo de 24 pocillos con colágeno.
   1. Mezclar 1 parte de 3 mg / ml de colágeno de cola de rata con 50 partes de PBS. Añadir aproximadamente 500 l a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se incuba durante 3-5 min a temperatura ambiente (RT). Retire el colágeno y permitir que la platina se seque al aire en el capó. Repetir al menos una vez adicional.
      Nota: recubrimiento de colágeno se puede realizar hasta una semana en anuncioVance y placas almacenadas a 4 ° C sellado en una envoltura de plástico.
4. Preparar LDM para el ensayo: LDM Descongelar y calentar a 37 ° C y ajustar el pH a 7,4 utilizando 1 N de KOH. Filtrar utilizando filtro de jeringa de 0,2 micras y el lugar en una recirculación de 42 ° C baño de agua.
5. Caliente 25 ml de hígado de perfusión del medio a 42 ° C en baño de agua de recirculación.
6. Preparar 90% de sílice coloidal recubierto con una solución de polivinilpirrolidona: Añadir 1 ml de 10x DPBS a 9 ml de sílice coloidal recubierto con polivinilpirrolidona. Ajustar el pH a 7,4 usando HCl 0,1 N. Filtro con un filtro de jeringa de 0,2 micras estéril. Guarde a temperatura ambiente.
7. Cálido Medio Chapado a 37 ° C.

2. El aislamiento de hepatocitos primarios de ratón

1. Configurar bomba peristáltica, tubos, y mesa de disección: Esterilizar tubo por el lavado con etanol 5 ml 70% en agua destilada, seguido de 10 ml de agua estéril. Coloque la tubería en el hígado de perfusión del medio y de la bomba funcionar para llenartoda la longitud del tubo.
2. Sacrificio del ratón por el método institucionalmente aprobado.
3. Diseccionar abierta la cavidad abdominal: Rocíe el abdomen del ratón liberalmente con etanol al 70%. Con unas tijeras sin filo, hacer una incisión en la línea media a través de la dermis de la longitud del abdomen y reflejar lateralmente. Haga una incisión similar en el peritoneo para exponer las vísceras.
   1. El uso de un instrumento romo, desplazar suavemente los intestinos para exponer la vasculatura abdominal Localizar la vena cava inferior abdominal (IVC) y colocar una sutura por debajo de la de los vasos sanguíneos, distal a la vena renal
4. Distal a la sutura, colocar una aguja y catéter en la vena cava inferior, avanzando más allá del nivel de la sutura. Con la aguja todavía en su lugar, ate la sutura alrededor del catéter para mantenerlo en su lugar. Retire con cuidado la aguja. Si se hace correctamente, la sangre con el flujo a través del catéter.
5. Usando una pipeta, llenar el área restante en el catéter con medio de perfusión, asegurandoque el aire no está presente. Con mucho cuidado, coloque el tubo al catéter.
6. Diseccionar abierta la cavidad pulmonar: reflejar suavemente los lóbulos hepáticos superiores para exponer el diafragma. Perfore cuidadosamente el diafragma con tijeras afiladas de punta, a continuación, hacer una incisión lateral para exponer la cavidad pleural, teniendo cuidado de evitar la vesícula biliar y la vasculatura pleural. Coloque una pinza bulldog alrededor de la vena cava inferior torácica proximal a la vena hepática.
7. Cortar la vena porta y encienda la bomba a los 3 - 4 ml / min. Perfundir el hígado con hígado de perfusión del medio durante 5 minutos utilizando aproximadamente 20 ml de medio de perfusión.
   Nota: El hígado debe cambiar inmediatamente de rojo a gris / marrón. Si las porciones del hígado siguen siendo rojo, esto probablemente indica mala perfusión, y la probabilidad de éxito en el aislamiento está muy disminuido. Durante la perfusión, tenga cuidado para asegurar el medio no se ejecuta y que no queden burbujas entran en el tubo.
8. Después de la incubación de 5 min, se detienela bomba y la transferencia de la tubería al hígado Digesto Medio. Reinicie la bomba y la perfusión del hígado durante otros 10 - 15 min (hasta que el medio se ha agotado).
9. Al final de la perfusión, parar la bomba. El hígado debe tener un tono rosado y parecen algo ampliada. Extirpar el hígado por disección cuidadosa. Eliminar la vesícula biliar y el hígado para transferir 10 cm placa de cultivo tisular.
10. En un gabinete de bioseguridad, añadir 10 ml de Revestimiento del Medio (Tabla 1) para el hígado. Raspar suavemente el hígado utilizando fórceps o un bisturí para eliminar los hepatocitos. Filtrar la suspensión utilizando un filtro de células de 100 micras y la transferencia a un tubo cónico de 50 ml. Lavar la placa con un adicional de 10 ml de Revestimiento del Medio y piscina en el tubo cónico de 50 ml.
11. Sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 350 xg, 4 ° C.
12. Medio Aspirar y pellet se resuspende en 10 ml de Revestimiento del medio y agregar 10 ml de 90% de sílice coloidal recubiertas con polyvinylpyrrolidone. Mezclar suavemente y centrifugar como en el paso 2.11. Después de la centrifugación, una capa de células muertas estará flotando en la parte superior de la mezcla, mientras que las células vivas se sedimenten en el fondo.
13. Aspirar las células muertas y medio. Lavar 2 veces con 20 ml de Revestimiento del Medio, centrífuga como en 2.11.
14. Resuspender las células en 10 ml de Revestimiento del Medio. Contar las células con un hemocitómetro y coloque 9 x 10 ⁴ células / pocillo en 24 y placas de cultivo de colágeno tratados. Incubar en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos durante 2 h. Cada placa se puede utilizar ya sea para el ensayo de oxidación de ácidos grasos o en el ensayo lipogénesis.
15. Opcionalmente, cambie pozos para Mantenimiento Medio (Tabla 1) y la cultura a 37 ° C. Las células pueden ser cultivadas durante 2 - 3 días sin afectar a los resultados del ensayo.

3. Ensayo de oxidación de ácidos grasos

Advertencia: El uso de la radiactividad puede ser peligroso. Todas las compras, el almacenamiento, la manipulación, y dishecho de material radiactivo debe llevarse a cabo de acuerdo con, estatales y las regulaciones y directrices federales institucionales.

1. 16 a 20 hr antes del ensayo, lavar las células 2 veces con PBS caliente. Cambiar las células a suero libre de suero inanición Medio (Tabla 1) con 20 nM de glucagón e incubar durante la noche a 37 ° C.
   Nota: Debido a que el suero fetal bovino contiene una concentración desconocida de hormonas metabólicas (por ejemplo, insulina, glucagón), suero de hambre las células para eliminar cualquier efecto de confusión que esto puede tener en el ensayo. Las células son viables en suero inanición Medio durante> 24 h. Tratamiento con glucagón se utiliza para estimular la oxidación de ácidos grasos dentro de los hepatocitos.
2. En la mañana del ensayo, preparar la pre-incubación Medio: Resuspender una cantidad apropiada de palmitato de sodio en agua ultrapura para preparar una solución 100 mM y se calienta a 70 ° C durante 10 min. Mientras tanto, preparar la cantidad requerida (0,5 ml por pocillo de una placa de 24 pocillos)de DMEM con 25 mM HEPES, 1% BSA Fracción V, y 20 nM de glucagón. Calentar a 37 ° C.
   1. Una vez solubilizado, palmitato de añadir a una concentración final de 250 mM al medio. Cambie los hepatocitos de pre-incubación medio y se incuba a 37 ° C durante 2 horas. Reserve algún Pre-Incubación Medio a 37 ° C para su uso posterior.
3. Durante la incubación, se seca una cantidad apropiada de ¹⁴ C-palmitato (0,5 Ci / pocillo) por evaporación bajo gas nitrógeno.
   1. Por ejemplo, para medir 24 muestras en una placa de 24 pocillos, transferir 120 l de 0,1 Ci / ml ¹⁴ C-palmitato a un tubo de 1,5 ml. Poco a poco se evapora el disolvente etanol soplando gas nitrógeno sobre la solución desde una distancia de 3-5 cm en una campana de humos. El disolvente debe evaporarse en aproximadamente 30 - 40 min, dejando seco ¹⁴ C-palmitato en la parte inferior del tubo.
4. Aproximadamente 15 minutos antes del final de la incubación, resuspender el ¹⁴C-Palmitato en NaOH 0,1 N (12,5 l / Ci). Incubar a 70 ° C durante 10 min. Añadir tres volúmenes de tibia Pre-Incubación Medio y mezclar pipeteando arriba y abajo.
5. Pico cada pocillo con 25 l de diluirse ¹⁴ C-palmitato. Mezclar agitando suavemente la placa e incubar a 37 ° C durante 90 minutos. Esta es la placa de ensayo.
6. Durante la incubación, preparar la placa de papel de filtro (Figura 1).
   1. Retire la tapa de una placa de 24 pocillos estéril. Coloque un 2 cm x 2 cm trozo de papel de filtro en la parte inferior de cada uno de los pozos. Superposición de la placa con una pieza de 4 "x 7" parafina.
   2. El uso de un objeto rectangular grande, tal como una caja punta de micropipeta, frotar la parafina en los pozos para perforar la parafina en las aberturas y así crear un sello sobre el resto de la placa. Retire los círculos perforados de parafina ahora cubren los pozos. La placa debe ahora estar bien cubierto con parafilm en todas las áreas, excepto el o bienpenings.
7. 10 min antes del final de la incubación, añadir 200 l de NaOH 3 N a cada pocillo de la placa de papel de filtro, asegurándose de que el papel de filtro absorbe todo el líquido.
   1. Opcionalmente antes de la congelación, transferir el medio de una placa de 24 pocillos fresco. Después de lavar una vez con PBS, lisar las células restantes en HCl 0,1 N y calcular el contenido de proteína mediante ensayo BCA.
8. Al final de la incubación, complemento congelar la placa de ensayo en nitrógeno líquido. Tenga cuidado para asegurar así cada uno está completamente congelado antes de proceder.
9. Añadir 100 l de 70% ácido perclórico a cada pocillo de la placa de ensayo. Inmediatamente cubrir con el plato de papel de filtro. Coloque las placas en un agitador orbital y el rock a la velocidad orbital de 80 rpm a temperatura ambiente durante 2 horas.
10. Después de la incubación, procesar las muestras:
    1. Para medir la fracción de CO _2, la transferencia de los cuadrados de papel de filtro a 4 ml de fluido de centelleo líquido en un centelleovial y la medida ¹⁴ de la señal C.
    2. Para medir el material soluble ácido, transferir 400 l de medio a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a máxima velocidad durante 10 min. Añadir 100 l del sobrenadante resultante a 500 l de 2: 1 cloroformo-metanol (v / v), y agitar brevemente.
       1. Añadir 250 l de agua a la mezcla, y agitar de nuevo. Centrifugar las muestras durante 10 min a 3000 x g. Transferencia de 200 l de la fase superior a 4 ml de fluido de centelleo líquido en un vial de centelleo y medir ¹⁴ la señal C.

4. lipogénesis Ensayo

1. La noche antes de comenzar el ensayo, se lavan las células 2 veces con PBS caliente. Cambie los hepatocitos a suero inanición Medio con 100 nM de insulina. Incubar durante la noche a 37 ° C.
   Nota: Debido a que el suero fetal bovino contiene una concentración desconocida de hormonas metabólicas (por ejemplo, insulina, glucagón), Suero de comer a las células para eliminar cualquier efecto de confusión que esto puede tener en el ensayo. Las células son viables en suero inanición Medio durante> 24 h. La insulina se usa en este ensayo para estimular la lipogénesis.
2. Hacer lipogénesis Medio: Suero inanición medio con 100 nM de insulina, 10 mM de acetato de frío y 0,5 Ci ³ H-Acetato por pocillo. Cambie células a lipogénesis Medium y se incuba a 37 ° C durante 2 hr. Incluir todos los compuestos de interés para ser probados.
3. Después de que el período de incubación, lavar las células 2 veces con PBS. Células Lyse por raspado en 120 l de HCl 0,1 N. Reserva 10 l para el ensayo de proteínas (evaluar por ensayo BCA), y la transferencia de 100 l a tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Lípidos extracto por adición de 500 l de 2: 1 cloroformo-metanol (v / v). Vortex brevemente e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 250 l de agua, vortex e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar las muestras 10 min a 3.000 xg, RT. Cuidadosamentetransferencia de fase inferior a 4 ml de fluido de centelleo líquido en un vial de centelleo y medir la actividad ³ H.

Resultados

Aislamientos de hepatocitos suelen dar en 1 - 3 x 10 ⁷ células totales. Después de la incubación durante la noche, las células van a aparecer hexagonal, muchos de los cuales se binucleadas (Figura 2). Las células sanas deben estar desprovisto de granulaciones o vesículas, que son indicativos de la muerte celular.

En general, el ensayo de oxidación de ácidos grasos se ejecuta en tres o cuatro repeticiones por compuesto de ensayo. Condes de las CO _{2 muestras}

Discusión

El tiempo desde el sacrificio a la perfusión debe ser inferior a 3 min para la perfusión ideal y digestión con colagenasa del hígado. Una vez que se inicia la perfusión con perfusión del medio, el hígado debe cambiar inmediatamente la apariencia de de rojo a pálido. Después de aproximadamente 10 minutos de incubación con LDM, el hígado aparecerá hinchada y de color rosa. En el caso de que la perfusión es insuficiente, el hígado no puede exhibir estos cambios, y esto normalmente dará como resultado un rendimiento de hepa...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tecnologías de vida media de perfusión hepática	17701038
Tecnologías de vida	media de digestión hepática	17703034	alícuota y almacenamiento a -20 & grados; C
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
Tecnologías de Vida de Colágeno		A1048301
Sílice coloidal recubierta con polivinilpirrolidona	GE Life Sciences	17-0891-01
Piruvato de sodio	Cellgro	25-000-CI
Penicilina / Estreptomicina	Cellgro	30-001-CI
Insulina	Sigma	I0516-5ML
Dexametasona	Sigma	D2915-100MG
Albúmina (BSA), Fracción V	MP Biomedicals	103703
plato de cultivo de 24 pocillos	Corning Falcon	353047
Tubo Tygon S3	Cole Parmer	06460-34
Bloqueo de Leur Macho a 200 Conectores	Cole Parmer	45518-00
Catéter de 24 G x 3/4"	SurFlo	SROX2419CA
Sutura de seda de mano permanente	Ethicon	683G
células	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Baño de agua recirculante	Fisher	13-874-3
MasterFlex C/L Bomba Peristáltica MasterFlex		HV-77122-24
Microclamp	Roboz	RS-7438	Preesterilizar en autoclave
5" Tijeras de operación rectas, romas-romas	Roboz	RS-6810	Preesterilizar en autoclave
24 mm Hoja recta de 24 mm Tijeras de microdisección de punta afilada	Roboz	RS-5912	Preesterilizar en autoclave
" 0.8 mm Punta Pinza de microdisección	Roboz	RS-5130	Preesterilizar en autoclave
" 0.8 mm Punta de curva completa Pinzas de microdisección	Roboz	RS-5137	Preesterilizar en autoclave
Jeringa de 60 ml	Becton Dickinson	309653
tubos cónicos de 50 ml	Corning Falcon	352070
BCA Ensayo de proteínas	Thermo Scientific	23225
Cabina
CO2 Incubadora
Serológico pipetas
1.000, 200, 20 μ l pipeta y puntas