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Artículo de método

El agotamiento selectivo de la microglía de cerebeloso gránulos Cultivos Celulares El uso de L-leucina metil éster

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DOI:

10.3791/52983

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7 de julio de 2015

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Washington, 2Therapeutic Innovation Group, School of Life and Medical Sciences, University College London, 3Department of Neuroinflammation, University College London

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Microglia puede influir en las neuronas y otras glías en cultivo mediante varios mecanismos autónomos no celulares. Aquí, presentamos un protocolo para agotar selectivamente la microglía a partir de cultivos neuronales primarios. Este método tiene el potencial de dilucidar el papel de las interacciones microglial-neuronales, con implicaciones para las enfermedades neurodegenerativas en las que la neuroinflamación es una característica distintiva.

Resumen

Microglia, las células inmunocompetentes residentes del SNC, desempeñan funciones multifacéticas en la modulación y el control de la función neuronal, así como en la mediación de la inmunidad innata. Los modelos de cultivo primario de células de roedores han avanzado enormemente nuestra comprensión de las interacciones neuronales-gliales, pero solo recientemente se han utilizado métodos para eliminar específicamente la microglía de los cultivos mixtos. Una de estas técnicas, descrita aquí, es el uso del éster metílico de L-leucina, un agente lisotropico que es internalizado por los macrófagos y la microglía, en el que causa disrupción lisosomal y posterior apoptosis13,14. Los experimentos con éster metílico de L-leucina tienen el poder de identificar la contribución de la microglía al entorno celular circundante en diversas condiciones de cultivo. Utilizando un protocolo optimizado en nuestro laboratorio, describimos cómo eliminar la microglía del cultivo de células granulosas cerebelosas de roedores P5. Este enfoque permite evaluar el impacto relativo de la microglía en los datos experimentales, así como determinar si la microglía desempeña un papel neuroprotector o neurotóxico en modelos de cultivo de afecciones neurológicas, como el accidente cerebrovascular, la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.

Introducción

El cerebro humano comprende un estimado de 85 mil millones de neuronas y otras 85 mil millones de células no neuronales incluyendo glia 1. Para la mayor parte de los últimos 100 años los neurocientíficos se han centrado principalmente en la población de células neuronales, creyendo células gliales a ser poco más que las células de apoyo pasivos que proporcionan soporte estructural para las neuronas - de ahí la etimología griega de 'glia' traducida al Inglés como "pegamento". Recientemente, sin embargo, se ha vuelto cada vez más evidente que las interacciones neuronales glial pueden ser mucho más fundamental a los aspectos básicos de la neurobiología, la neurofisiología, y la génesis y progresión de muchas enfermedades neurodegenerativas. Células granulares del cerebelo (CGC), el más abundante población neuronal homogénea en el cerebro humano, dominan el cerebelo y constituyen más del 90% de sus componentes celulares. En consecuencia, estas células se han utilizado ampliamente in vitro como un sistema modelo para tque estudian el desarrollo neuronal, la función y patología 2-6.

Sin embargo, los cultivos de CGC aún contienen microglia y otra glía en proporciones posiblemente significativas. Como resultado, los datos CGC que muestran supuestamente respuestas neuronales directos a diferentes tratamientos con células pueden, de hecho surgir - en parte o en total - a partir de la respuesta secundaria indirecta de la glía vecino en el cultivo. Para evaluar esto, hemos eliminado selectivamente microglial de CGC cultivos neuronales con la ayuda de éster metílico de L-leucina (LME). LME es un agente lysomotropic originalmente usado para destruir selectivamente los macrófagos 7, y desde entonces ha sido utilizado también para agotar selectivamente microglia desde neural, astrocitos, y los cultivos gliales mixtos 8,9,10. LME es internalizado por los macrófagos y microglia, en el que se provoca la interrupción lisosomal y la posterior apoptosis 13,14. Los macrófagos y microglia son característicamente rico en lisosomas, haciendo que sea particularly vulnerables a la exposición a un tratamiento de LME. Este protocolo proporciona una forma potente, pero simple y fácil de determinar la contribución de la microglia en experimentos que utilizan CGC y otros sistemas de cultivos neuronales / gliales.

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Protocolo

Todos los experimentos descritos en este documento se realizaron de acuerdo con las Unido Animales Unidas (procedimientos científicos) Act de 1986.

1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo, y platos

  1. Prepare dos tijeras de disección de laboratorio de acero inoxidable y dos pinzas de laboratorio de acero inoxidable. Autoclave todos los instrumentos y lugar en una campana de cultivo O / N bajo la luz (UV) ultravioleta para la esterilización.
  2. Hacer 500 ml de (MEM) medio de cultivo medio esencial mínimo (10% de suero bovino fetal [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-glucosa, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 g / ml de estreptomicina y 6 mg / ml de ampicilina) y esterilizar filtro. Almacenar a 4 ° C durante meses.
  3. Preparar 24 placas de cultivo de pocillos que contenían 14 mm, número 1 cubreobjetos espesor. Autoclave los cubreobjetos y capa en 100 mg / L de poli-D-lisina (PDL) como se describe previamente 3. Luz UV esterilizar O / N.

2. Preparación de Soluciones CGC Cultura

  1. Preparar 'solución A' (100 ml) en autoclave, luz UV tratada, dH 2 O estéril que contiene 250 mg de glucosa, 300 mg de albúmina de suero bovino [BSA], 955 mg de solución salina tamponada con fosfato [PBS] (Ca 2+ y Mg + gratis), y 1 ml de 3,8% MgSO4 · 7H 2 O.
  2. Preparar 'solución B' (10 ml) que contiene 1 ml de 5 mg / ml de tripsina diluido en 9 ml de solución A.
  3. Preparar 'solución C' (10 ml) que contienen 1,000 unidades de ADNasa, 0,5 mg de inhibidor de tripsina de soja, 100 l de 3,8% MgSO4 · 7H 2 O, se diluyó a 10 ml con solución A.
  4. Preparar 'solución D' (20 ml) que contiene 3,2 ml de solución C, se diluyó a 20 ml con solución A.
  5. Prepare la solución de BSA / Earle solución salina equilibrada (EBSS) que contiene EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO4 · 7H 2 O, y4% de BSA, pH 7,4, como se ha descrito previamente 3.
  6. Preparar LME añadiendo puro LME en 5 ml de medio de cultivo MEM para dar una concentración final de 150 mM LME, devolver la solución a pH 7,4 usando un medidor de pH de sobremesa, y el filtro de esterilizar usando un poliéter sulfona 28 mm (PES) 0,2 micras jeringa filtro.

3. El cultivo de las CGC

  1. Recoger cerebelo 4-7 días de edad crías de rata como se describe anteriormente 3. Coloque inmediatamente en placa de Petri que contiene 5 ml de la solución A en hielo.
  2. Vierta el exceso de solución de cerebelo y el lugar del tejido en el plato tapa Petri.
  3. Picar finamente tejido con una cuchilla de afeitar así flameado-en al menos tres direcciones diferentes.
  4. Añadir tejido picado a la solución B (enjuague placa de Petri con solución para asegurar el tejido limitada se pierde) y colocar en baño de agua a 37 ° C durante 5 min. Agite suavemente cada par de minutos.
  5. Añadir solución D (20 ml) al tubo para neutralizar la tripsina, agitar y cientorifuge a 65 xg durante 5 min.
  6. Retirar el sobrenadante.
  7. Resuspender en 4 ml de solución C. Se tritura pocillos (aproximadamente 10 veces cada uno) con tres pipetas de vidrio flameado de diámetro decreciente, hasta que la suspensión es tan homogénea como sea posible.
  8. Lenta y suavemente añadir unas gotas de este homogeneizado en la parte superior de la BSA / EBSS. Si comienza a hundirse a través de la BSA / EBSS, triturar más y / o añadir un poco más de la solución C. El homogeneizado debe sentarse en una capa en la parte superior de la BSA / EBSS. No agite. Girar a 100 xg durante 5 min.
  9. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet (suave) en 1 ml de medio MEM.
  10. Contar las células utilizando un hemocitómetro y placa a 800.000 células / cubreobjeto en 500 l de medio MEM. Coloque en una incubadora a 37 ° C con 6% de CO 2.
  11. Cambie el medio al día siguiente (24 a 36 horas después de la preparación). Hacer una solución de medio MEM que contiene 10 M del ciclo celular citidina arabinofuranosil inhibidor (AraC).
    1. Para cadacubreobjetos, retener 250 l de medio de edad en una placa de 24 frescos, aspirar el resto, añadir 250 l de medio normal MEM y aspirar este para lavar las células, a continuación, añadir los 250 l de medio de edad de nuevo a las células y recarga con 250 l de medio que contenía AraC.
      Nota: Las células se pueden usar desde los 6 días in vitro (DIV).

4. selectiva que agotan la microglía (realizado a las 6 DIV)

  1. Añadir LME pura a 5 ml de una alícuota separada de medio MEM para dar una concentración final de 150 mM LME.
  2. Devolver la solución a pH 7,4 y esterilizar utilizando un filtro de poliéter sulfona 28 mm (PES) filtro de 0,2 micras jeringa.
  3. Diluir la solución a una concentración de 50 mM (2 x LME) en medio MEM y colocar en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos, junto con medio normal MEM para cultivos de control.
  4. Retire la mitad (250 l) el medio MEM a partir de cultivos de CGC y retener a 37 ° C.
  5. Tratar a las célulascon medio MEM que contiene 2 x LME (250 l), es decir, diluido 1: 1 dando una concentración bien de 25 mM, o con medio de pre-calentado MEM sin ​​LME (250 l) para los cultivos de control.
  6. Se incuban las células a 37 ° C en una atmósfera húmeda con un 6% de CO 2 durante 1 hora.
  7. Lavar las células dos veces en medio precalentado fresca MEM para eliminar medios LME-que contienen, y luego reemplazar el medio de cultivo retenido y un volumen igual de medio precalentado fresca MEM a los pocillos correspondientes.
  8. Culturas Regreso a la incubadora (humidificado con 6% de CO 2 a 37 ° C) y dejar reposar durante 24 horas antes de cualquier tratamiento adicional.

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Resultados

La capacidad de esta técnica para eliminar selectivamente microglia de CGC y / o cultivos mixtos se basa en la posterior capacidad del investigador para identificar y diferenciar microglia de sus células circundantes con precisión. Esto se puede lograr usando una máquina de célula microglial-específico, como isolectina-B4, como se ilustra en la Figura 1. Como se demuestra en la Figura 2, no se registraron cambios observables a los astrocitos y la densidad y morfología neuronal con respe...

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Discusión

Los pasos más importantes para garantizar la eliminación selectiva de éxito de la microglia de CGC y / o cultivos mixtos son: 1) el mantenimiento de una cultura CGC estéril y saludable; 2) Filtro de esterilizar el medio que contiene LME-y devolver la solución a pH 7,4; 3) mantenimiento de los medios de comunicación CGC retenidas y LME-que contiene los medios de comunicación a 37 ° C para evitar el choque térmico; y 4) que trabajan rápidamente para reducir el tiempo las células se mantienen fuera de la incub...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por una beca de doctorado de Aims2Cure, Reino Unido y UCL Impact Award para JMP y una beca de doctorado en Demencia de MRC Capacity Building para JMP.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pinzas Sigma-AldrichF4142El extremo curvo facilita la extracción del cerebelo 
Tijeras de microdisecciónSigma-AldrichS3146La punta recta y afilada facilita la disección de roedores P4-7 
Clorhidrato de éster metílico de L-leucinaSigma-Aldrich7517-19-3
Solución EBSS Sigma-AldrichE7510-500 ml
Poly-D-lisinaSigma-Aldrich27964-99-4Cubreabrios 1 día antes de usar 
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA9418
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4417
DNasaSigma-AldrichD5025
Inhibidor de la tripsina de soja Sigma-AldrichT6414
Anticuerpo anti-ED1 para ratones Abcamab31630

Referencias

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