El agotamiento selectivo de la microglía de cerebeloso gránulos Cultivos Celulares El uso de L-leucina metil éster

Resumen

Microglia puede influir en las neuronas y otras glías en cultivo mediante varios mecanismos autónomos no celulares. Aquí, presentamos un protocolo para agotar selectivamente la microglía a partir de cultivos neuronales primarios. Este método tiene el potencial de dilucidar el papel de las interacciones microglial-neuronales, con implicaciones para las enfermedades neurodegenerativas en las que la neuroinflamación es una característica distintiva.

Resumen

Microglia, las células inmunocompetentes residentes del SNC, desempeñan funciones multifacéticas en la modulación y el control de la función neuronal, así como en la mediación de la inmunidad innata. Los modelos de cultivo primario de células de roedores han avanzado enormemente nuestra comprensión de las interacciones neuronales-gliales, pero solo recientemente se han utilizado métodos para eliminar específicamente la microglía de los cultivos mixtos. Una de estas técnicas, descrita aquí, es el uso del éster metílico de L-leucina, un agente lisotropico que es internalizado por los macrófagos y la microglía, en el que causa disrupción lisosomal y posterior apoptosis^13,14. Los experimentos con éster metílico de L-leucina tienen el poder de identificar la contribución de la microglía al entorno celular circundante en diversas condiciones de cultivo. Utilizando un protocolo optimizado en nuestro laboratorio, describimos cómo eliminar la microglía del cultivo de células granulosas cerebelosas de roedores P5. Este enfoque permite evaluar el impacto relativo de la microglía en los datos experimentales, así como determinar si la microglía desempeña un papel neuroprotector o neurotóxico en modelos de cultivo de afecciones neurológicas, como el accidente cerebrovascular, la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.

Introducción

El cerebro humano comprende un estimado de 85 mil millones de neuronas y otras 85 mil millones de células no neuronales incluyendo glia ^1. Para la mayor parte de los últimos 100 años los neurocientíficos se han centrado principalmente en la población de células neuronales, creyendo células gliales a ser poco más que las células de apoyo pasivos que proporcionan soporte estructural para las neuronas - de ahí la etimología griega de 'glia' traducida al Inglés como "pegamento". Recientemente, sin embargo, se ha vuelto cada vez más evidente que las interacciones neuronales glial pueden ser mucho más fundamental a los aspectos básicos de la neurobiologí....

Protocolo

Todos los experimentos descritos en este documento se realizaron de acuerdo con las Unido Animales Unidas (procedimientos científicos) Act de 1986.

1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo, y platos

1. Prepare dos tijeras de disección de laboratorio de acero inoxidable y dos pinzas de laboratorio de acero inoxidable. Autoclave todos los instrumentos y lugar en una campana de cultivo O / N bajo la luz (UV) ultravioleta para la esterilización.
2. Hacer 500 ml de (MEM) medio de cultivo medio esencial mínimo (10% de suero bovino fetal [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO _3, 30 mM D-glucosa, 2 mM L-glutamina, 100 U ....

Resultados

La capacidad de esta técnica para eliminar selectivamente microglia de CGC y / o cultivos mixtos se basa en la posterior capacidad del investigador para identificar y diferenciar microglia de sus células circundantes con precisión. Esto se puede lograr usando una máquina de célula microglial-específico, como isolectina-B4, como se ilustra en la Figura 1. Como se demuestra en la Figura 2, no se registraron cambios observables a los astrocitos y la densidad y morfología neuronal con respe.......

Discusión

Los pasos más importantes para garantizar la eliminación selectiva de éxito de la microglia de CGC y / o cultivos mixtos son: 1) el mantenimiento de una cultura CGC estéril y saludable; 2) Filtro de esterilizar el medio que contiene LME-y devolver la solución a pH 7,4; 3) mantenimiento de los medios de comunicación CGC retenidas y LME-que contiene los medios de comunicación a 37 ° C para evitar el choque térmico; y 4) que trabajan rápidamente para reducir el tiempo las células se mantienen fuera de la incub.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinzas	Sigma-Aldrich	F4142	El extremo curvo facilita la extracción del cerebelo
Tijeras de microdisección	Sigma-Aldrich	S3146	La punta recta y afilada facilita la disección de roedores P4-7
Clorhidrato de éster metílico de L-leucina	Sigma-Aldrich	7517-19-3
Solución EBSS	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poly-D-lisina	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Cubreabrios 1 día antes de usar
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNasa	Sigma-Aldrich	D5025
Inhibidor de la tripsina de soja	Sigma-Aldrich	T6414
Anticuerpo anti-ED1 para ratones	Abcam	ab31630