Artículo de método

Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad

DOI:

10.3791/52989

⸱

18 de agosto de 2015

 ,  , 
1Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los macrófagos hepáticos, llamados células de Kupffer, son responsables de la captura de las nanopartículas circulantes. Describimos aquí un método, de alta pureza y rendimiento celular, para el aislamiento de células de Kupffer. El ensayo de LDH modificado se utiliza aquí para medir la toxicidad inducida por los nanotubos de carbono en las células de Kupffer.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La gran mayoría de los estudios in vitro nanotoxicological han utilizado líneas celulares inmortalizadas por su practicidad. Sin embargo, los resultados de las pruebas de toxicidad de nanopartículas en líneas celulares inmortalizadas o células primarias han mostrado discrepancias, destacando la necesidad de extender el uso de células primarias de ensayos in vitro. Este protocolo describe el aislamiento de los macrófagos del hígado del ratón, las células de Kupffer con nombre, y su uso para estudiar la toxicidad de nanopartículas. Las células de Kupffer son la población de macrófagos más abundante en el cuerpo y constituyen parte del sistema retículo-endotelial (RES), responsable de la captura de las nanopartículas de circulación. El método de aislamiento de células Kupffer informó aquí se basa en un método de perfusión de 2 pasos, seguido de purificación en gradiente de densidad. El método, basado en la digestión de colagenasa y centrifugación de densidad, es una adaptación del protocolo original desarrollada por Smedsrød et al. diseñado para la rata isolatio células hepáticasn y proporciona un alto rendimiento (hasta 14 x 10 6 células por ratón) y alta pureza (> 95%) de las células de Kupffer. Este método de aislamiento no requiere equipo sofisticado o caro y por lo tanto representa un compromiso ideal entre la complejidad y el rendimiento celular. El uso de ratones más pesados ​​(35-45 g) mejora el rendimiento del método de aislamiento sino que también facilita notablemente el procedimiento de canulación de la vena porta. La toxicidad de los nanotubos de carbono funcionalizados f -CNTs se midió en este modelo por el ensayo de LDH modificado. Este método evalúa la viabilidad celular mediante la medición de la falta de integridad estructural de la membrana de las células de Kupffer después de la incubación con -CNTs f. Inducida por -CNTs f toxicidad puede medirse constantemente utilizando este ensayo, destacando que las células de Kupffer aisladas son útiles para las pruebas de toxicidad de las nanopartículas. La comprensión global de nanotoxicología podría beneficiarse de este tipo de modelos, por lo que la selección de nanopartículas para la traducción clínica más eficiente.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El campo de la investigación nanotoxicología pretende caracterizar el efecto biológico de las nanopartículas. Los estudios toxicológicos sobre la base de las investigaciones in vivo siguen siendo los métodos más precisos. Sin embargo, su uso está limitado por sus requisitos de coste, tiempo y trabajo 1. Como los ensayos de alternativas, in vitro se han utilizado debido a su simplicidad y la posibilidad de desarrollar de alto rendimiento en plataformas de pruebas in vitro 2 - así se amplía el número de condiciones ensayadas. La mayoría de los estudios nanotoxicological se realizan usando ensayos in vitro con líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, hay preocupaciones con respecto a la extrapolación de estos resultados experimentales in vivo a los efectos toxicológicos 3. De hecho, las propiedades de las líneas celulares inmortalizadas pueden ser significativamente diferentes de los tejidos que se derivan de, por ejemplo, la transformación genética 4, el deterioro de las características morfológicas principales5, la pérdida de la polaridad celular 6 y alteraciones funcionales tales como la regulación de los mediadores de la inflamación 7.

Las células de Kupffer son la población de macrófagos más abundante en el cuerpo y están directamente en contacto con la sangre por el forro de la pared de los sinusoides hepáticos. Como parte del sistema retículo-endotelial (RES), estos macrófagos son responsables de la captura de las nanopartículas de circulación y por lo tanto, constituyen un modelo muy adecuado para estudiar la toxicidad de nanopartículas. In vivo 8 e in vitro 9 estudios de respuestas inflamatorias asociadas con las células de Kupffer expuestos a nanopartículas se han publicado en otros lugares. Las células de Kupffer también se han involucrado en la patogénesis de las enfermedades hepáticas como la enfermedad alcohólica del hígado 10, fibrosis hepática o hepatitis viral 11 12. Se informó de que las células de Kupffer aisladas proporcionan información útil para describir los mecanismos celulares involved en la interrupción del hígado 13,14.

Varios métodos han sido reportados para aislar y purificar las células de Kupffer. Aislamiento de la célula puede resultar de la mecánica o enzimática de disociación 15. Digestión con colagenasa muestra la ventaja de conservar la integridad funcional de las células de Kupffer, mientras que lleva a rendimiento celular de alta Kupffer 16. Muchos enfoques experimentales, que varían en complejidad y los costes, se han utilizado para separar las células de Kupffer de otras poblaciones de células de hígado. Por ejemplo, la pureza de células Kupffer se puede lograr por inmunoafinidad 17, electroforesis de flujo 18, 16 adhesión selectiva o mediante técnicas centrífugas 16, que seleccionan las células en función de su tamaño y densidad. Una combinación de estos métodos puede ser elegido para aumentar la pureza de la población 16. No hay consenso sobre el método ideal para el aislamiento de células de Kupffer, ya que depende principalmente de la aplicación y equipamiento disponiblest. Sin embargo, en el caso de los ensayos de toxicidad de nanopartículas, la simplicidad y de alto rendimiento de la técnica asociada con la conservación funcional de las células de Kupffer parecían ser más adecuado para esta aplicación.

El método de aislamiento de células Kupffer informó aquí se basa en un método de perfusión de 2 pasos, seguido de purificación en gradiente de densidad. El método se modificó a partir del protocolo original desarrollado por Smedsrød et al. 16 diseñado para el aislamiento de células de hígado de rata. La mayoría de los estudios informaron y describen el aislamiento de las células de Kupffer de hígado de rata. En este documento, se describe un método para aislar células de Kupffer de hígado de ratón, con un alto rendimiento y pureza. El uso de ratones reduce el coste experimento y permite el procesamiento de varios hígados para obtener grandes cantidades de células de Kupffer para las pruebas de toxicidad de las nanopartículas.

En el siguiente protocolo, las células de Kupffer se incubaron con nanotubos de carbono funcionalizados (f -CNTs). Las propiedades físico-químicas únicas de CNTs - es decir, de alta relación de longitud a diámetro y gran área de superficie, han hecho CNTs candidatos interesantes como vectores para fines de terapia y el diagnóstico. Sin embargo, han surgido preocupaciones con respecto a la toxicidad de los nanotubos de carbono 19, y el desarrollo de nuevos ensayos in vitro tiene por objeto aumentar la comprensión del efecto biológico CNT. Toxicidad en células de Kupffer se asocia con una falta de integridad estructural de la membrana celular. Esto se mide por la pérdida de la enzima LDH citoplásmica de la célula en el sobrenadante. El principio de este método, por lo tanto, es eliminar cualquier LDH liberada y medir lo que queda en las células 20. Esto se realiza con preferencia a la medición de la LDH liberada en el sobrenadante debido a la presencia de nanotubos de carbono en el sobrenadante interfiere con el ensayo 21.

Proponemos el uso de este simple y rentable metho aislamiento de células Kupfferd aislar alto número de células de Kupffer funcionales. Esto permite el cribado de toxicidad de una gama de nanopartículas, en un modelo de macrófagos primaria pertinente.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices pertinentes, los reglamentos y las agencias reguladoras. El protocolo que se demostró fue realizado bajo la dirección y aprobación del reglamento oficina del Reino Unido Inicio

1. Perfusión y Cell Collection (Figura 1)

figure-protocol-1
Figura 1:. Liver perfusión Después de la anestesia del ratón, el tracto digestivo se mueve lateralmente hacia la izquierda del abdomen con el fin de hacer que la vena portal (PV) accesible. El PV se canula utilizando una tasa de flujo lento (1-3 ml / min) de solución de EGTA / HBSS y el Veina cava inferior (IVC) es inmediatamente roto para evitar cualquier exceso de presión dentro del hígado. Dentro de la primera minutos de perfusión, el caudal se incrementa gradualmente a 7 ml / min. La solución de colagenasa se perfunde después a 10 ml / min hasta que se logra su digestión completa.

  1. Prepare recién todos los reactivos descritos en la tabla de material.
  2. Calentar el EGTA (etilenglicol Tetra-ácido acético) / HBSS (solución salina equilibrada de Hank) solución (50 ml por ratón) y la solución de colagenasa (100 ml por ratón) durante 30 min a 40 ° C.
  3. Enjuague el tubo flexible de la bomba primero con etanol al 70%. Verter 40 ml de solución de EGTA / HBSS en un tubo de centrífuga sumergida en el baño de agua y enjuagar el tubo flexible de la bomba con la solución de EGTA / HBSS precalentado.
  4. Realizar la anestesia terminal usando un barbitúrico para producir de forma fiable la inconsciencia antes de la depresión respiratoria y la muerte. Inyectar fenobarbital a 1 mg / kg, ip en un ratón CD1 hembra o macho (35-45 g). Confirme la anestesia mediante pellizcos dedo del pie.
  5. Afeitado pelos abdominales y esterilizar la superficie abdominal con solución de etanol al 70%.
  6. Corte a través de la cavidad abdominal y exponer la vena porta y la vena cava inferior moviendo el intestino lateralmente a la izquierda del abdomen.
  7. Estrellat la bomba a una velocidad de 1-3 ml / min con solución de EGTA / HBSS y canular la vena portal usando una aguja de 23 g mariposa (alas cortadas). Abrazadera de la sección de la vena portal canulado con la aguja 23 G y, a continuación voltear el fórceps serrefine en la superficie del abdomen del ratón abierto. El hígado debe pálido rápidamente dentro de los primeros 30 segundos de la perfusión EGTA Solución / HBSS.
  8. Rápidamente incisión en la parte inferior de la vena cava inferior para evitar edificio exceso de presión en el hígado, y luego aumentar la velocidad de flujo gradualmente a 7 ​​ml / min, sobre la primera minutos de perfusión. El animal muere debido a la hemorragia secundaria a la vena cava punción venosa.
  9. Cuando menos de 5 ml de solución EGTA / HBSS es permanecer en el tubo de centrífuga, llenarlo con colagenasa solución (40-50 ml). Aumentar la tasa de flujo gradualmente a 10 ml / min, durante 30 s.
  10. Hacer que el hígado se inflame mediante la aplicación de presión a la vena cava inferior, usando pinzas, para los intervalos de 5-10 seg. This se puede hacer periódicamente (5-10 veces durante la digestión). Este paso va a mejorar la disociación de células del hígado y reducir el tiempo de perfusión con colagenasa.
  11. Cuando menos de 10 ml de solución de colagenasa se mantiene dentro del tubo de centrífuga, se vierte 40-50 ml de la solución de pre-calentado colagenasa en el tubo de centrífuga.
  12. Después de 10-15 min de perfusión y unos 70-80 ml de solución de colagenasa perfundidos, aplicar una pequeña presión sobre la superficie del hígado con un fórceps. Una impresión de la presión indica que las células hepáticas se disocian.
  13. Retire el hígado de la cavidad abdominal como una sola pieza y colocarla en un tubo de centrífuga que contiene 20 a 30 ml de células Kupffer Aislamiento medio. Mantenga las células del hígado en hielo oa 4 ° C durante un período máximo de 3 horas para no afectar la viabilidad celular hepática.
  14. Repita el procedimiento de perfusión en varios animales si es necesario, manteniendo el hígado perfundido en hielo. Piscina dos y cincuenta y nueve hígados para la purificación y proceder con la etapa 3.

2. Preparación del gradiente de densidad para la centrifugación (Figura 2)

figure-protocol-2
Figura 2:. Preparación del gradiente de densidad Todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones estériles. El SIP se prepara mezclando 15,3 ml de solución de partículas de sílice revestido con 1,7 ml de 10 x PBS. A 5 ml de SIP se mezclan con 15 ml de PBS para hacer una solución SIP 20 ml de 25%. 10 ml de SIP se mezclan con 10 ml de PBS para hacer una solución SIP 20 ml de 50%. Un tubo de centrífuga que contiene la solución de 50% SIP (20 ml) se inclina y la solución SIP 25% (20 ml) se añade lentamente usando una pipeta serológica de 25 ml.

  1. Continúe con los pasos siguientes (artículo 2., 3. y 5.) bajo condiciones estériles y mantener las células en hielo oa 4 ° C. Prepare el SIP (Solución de partículas de sílice recubiertas isotónica) mezclando 15,3 ml de solución de partículas de sílice revestido con 1,7 ml de 10 x PBS.
    2. Para hacer 20 ml de solución de SIP 25%, mezclar 5 ml de SIP con 15 ml de PBS. Para hacer 20 ml de solución de SIP 50%, mezclar 10 ml de SIP con 10 ml de PBS.
  2. Llene un tubo de centrífuga con 20 ml de la solución de SIP 50%. Incline el tubo de centrífuga en un ángulo próximo a 90 ° y se añade lentamente la solución SIP 25% (20 ml) en la pared lateral del tubo utilizando una pipeta serológica de 25 ml, sin tocar la superficie de la capa de SIP 50%. Cuando la adición de la solución SIP 25%, reducir progresivamente el ángulo del tubo. Mantenga el gradiente de densidad en hielo hasta su uso.

3. Kupffer Purificación celular (Figura 3)

figure-protocol-3
Figura 3:. La purificación de las células de Kupffer por centrifugación en gradiente de densidad y la adhesión celular Todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones estériles. (A) Después de la rotura de la cápsula de Glisson, las células del hígado se filtran a través de un 100 micras colador. La suspensión se centrifugó a 50 x g para descartar hepatocitos (pellets) y recoger la fracción de células no parenquimatosas (sobrenadante). Este paso se repite 3 veces. Las células no parenquimatosas se añaden en la parte superior de un gradiente discontinuo isotónica y se centrifugaron a 800 xg durante 15 min. Las células de Kupffer recogidos de la almohadilla SIP 25% se purifican adicionalmente por la selección de la adhesión celular. (B) Las células se sembraron en placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 ° C y 5% de CO2 durante 30 min. Las células no adherentes se lavaron una vez con 500 l de HBSS. Las células de Kupffer muestran su morfología adherente 4 hr después de la siembra, cuando -CNTs f se pueden añadir a las células. La barra de escala representa 25 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Poner un hígado perfundido en un plato de Petri con 15 ml de aislamiento de células Kupffer Medium. Romper la cápsula de Glisson (membrana del hígado) usando tijeras y liberar todas las células hepáticas en el medio de aislamiento de células Kupffer. Filtrar la solución a través de un filtro de células de 100 micras que se recoge en un tubo de centrífuga. Repita el procedimiento de perfusión de hígados perfundidos adicionales y poner en común las células en el mismo tubo de centrífuga (15 ml de un ratón, hasta 45 ml de tres ratones).
  2. Centrifugar la suspensión celular a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Las células del parénquima (hepatocitos) estarán en el sedimento y las células no parenquimatosas (incluyendo células de Kupffer) estarán en el sobrenadante.
  3. Recoger el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio y centrifugar a 50 xg durante 2 min cada una. Repita este paso tres veces más.
  4. Centrifugar a 1350 xg durante 15 min para sedimentar las células no parenquimatosas. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de Kupffer aislamiento de células Medio.
  5. Añadir la solución de células no parenquimatosas en el gradiente isotónico discontinua 25/50% como se describe en 2.3. Centavorifuge a 850 xg durante 15 min sin aceleración o descanso.
  6. Localizar la fracción de células Kupffer enriquecido que aparece turbia dentro de la fracción SIP 25% cerca de la interfaz de SIP 25/50% (Figura 3). Usando una pipeta serológica de 10 ml, aspirado sobre 12 ml de la fracción de células Kupffer enriquecido. La transferencia de células en un tubo de centrífuga que contiene 35 a 40 ml de Kupffer aislamiento de células Medio. Mezclar suavemente y centrifugar a 1350 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar las células.
  7. Deseche las células sobrenadante y resuspender en 5-10 ml de pre-calentado célula Kupffer medio de cultivo. Recuento de células (hemocitómetro) y medir la viabilidad mediante la tinción de azul de tripano.
  8. Placa de las células no parenquimatosas purificadas en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 x 10 5 células / pocillo. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 (Figura 3). Después de 30 minutos, retire con cuidado el medio, lavar con pre-calentado solución salina equilibrada de Hank (HBSS) una vez que vuelva a colocarcon 500 l de fresco y pre-calentado Kupffer Cell Culture Medium (por pocillo).
  9. Deja células de Kupffer durante al menos 4 horas a 37 ° C y 5% de CO 2 antes del tratamiento con nanopartículas, para permitir que adquieran su morfología adherente.

4. Caracterización

  1. Las células de Kupffer Pureza
    1. Preparar fresca solución de PBS / BSA utilizado para mantener la viabilidad de células de Kupffer. Lavar las células una vez con 500 l de solución de PBS / BSA. Retire la solución de PBS / BSA y separar las células de Kupffer en 500 l de solución de PBS / BSA fresca utilizando raspado suave. Cuando las células se sembraron en placas de 24 pocillos, acortar los extremos de las cuchillas raspadoras con tijeras para hacer más fácil el desprendimiento de proceder. Transferencia de células en tubos de citometría de flujo.
    2. Contar las células de Kupffer utilizando un hemocitómetro y centrifugar 1 x 10 5 células a 1350 x g. Resuspender las células de Kupffer en 30 l de F4 / 80 anticuerpo (puro). Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Mantener las células no teñidas (no incubadas con el anticuerpo) en hielo.
    3. Añadir 2 ml de solución de PBS / BSA en células teñidas, se centrifuga a 1350 g durante 5 min y descartar el sobrenadante resultante. Resuspender las células teñidas en 200 l de PBS / BSA.
    4. Para el análisis de citometría de flujo, puerta 10000 sin teñir las células de Kupffer de acuerdo a su tamaño (dispersión hacia adelante) y granularidad (dispersión lateral). Analizar la fluorescencia de las células cerradas en FL-1 canal.
    5. Repita el procedimiento para las células de Kupffer manchadas manteniendo los mismos ajustes utilizados para la citometría de flujo análisis de las células de Kupffer sin teñir. Seleccionar y cuantificar la fluorescencia de las células teñidas para evaluar la pureza de las células de Kupffer.
  2. Kupffer célula fagocítica Actividad
    1. Reemplace los medios con un 0,5% (v / v) perlas fluorescentes en Kupffer Cultivo Celular Medio e incubar durante 4 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
    2. Con el fin de eliminar las perlas no internalizadas, células de Kupffer de centrífuga a 1350 xg, discard las células sobrenadante y resuspender en 500 l de PBS Solución / BSA. Repita este paso 2 veces más.
    3. Raspe células de Kupffer en 500 l de células de la solución y de transferencia de PBS / BSA en un tubo de citometría de flujo.
    4. Centrifugar las células de Kupffer en 1350 xg, descartan las células sobrenadante y resuspender en 200 l de PBS Solución / BSA.
    5. Para el análisis de citometría de flujo, puerta 10000 sin teñir las células de Kupffer de acuerdo a su tamaño (dispersión hacia adelante) y granularidad (dispersión lateral). Analizar la fluorescencia de las células cerradas en FL-2 canal.

5. La incubación de carbono funcionalizados químicamente nanotubos (f -CNTs)

  1. Preparar una dispersión de -CNTs f (1 mg / ml) en agua por tratamiento con ultrasonidos durante 15 minutos antes de su uso. -CNTs F se preparan en la casa 22.
  2. Preparar 2x CNT f- concentrados dispersión en Kupffer Cell Culture Medium. CNT f- sonicado dispersas en un medio para2 min antes de proceder con el paso 5.3).
  3. Para cada bien, sustituya 250 l de edad media con 250 l de 2x dispersión -CNTs f. Pozos sin tratar (250 l de medio acondicionado + 250 l de fresco Kupffer Cell Culture Medium) y los pocillos tratados con 10% de DMSO se utilizan como control negativo y positivo, respectivamente.
  4. Se incuban las células de Kupffer a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 o 72 horas.

6. Evaluación de la toxicidad de -CNTs f en células de Kupffer por la lactato deshidrogenasa (LDH) Ensayo Modificado

  1. Eliminar el sobrenadante.
  2. Añadir 200 l (por pocillo de placa de 24 pocillos) de tampón de lisis y se incuba a 37 ° C durante 30 min-1 hr.
  3. Después de llevar a cabo el pipeteo vigoroso, recoja lisaron las células de Kupffer en tubos de microcentrífuga y se centrifuga a 40.000 xg durante 10 min para sedimentar -CNTs f que fueron tomados por las células y los restos celulares.
  4. Reunir los sobrenadantes (ƒ-CNT gratuita) entubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C o vaya al paso 6.5).
  5. Transferencia de 50 l en una placa de 96 pocillos y añadir un volumen igual de la solución de mezcla de sustrato (kit LDH) a cada pocillo. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 15 min antes de añadir 50 l de la solución de parada (kit LDH). Añadir triplicados de pocillos de blanco que contienen 50 l de tampón de lisis, 50 l de solución de mezcla de sustrato y 50 l de solución de parada.
  6. Leer la absorbancia a 490 nm en un lector de microplacas y utilizar la siguiente fórmula para calcular el (%) la viabilidad celular.

figure-protocol-4

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El número de células parenquimatosas no purificadas era consistente y varió entre 8 y 14 x 10 6 células por ratón (se realizaron 17 aislamientos). Cada aislamiento ratón era suficiente a la placa 16 a 28 pozos. La viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano demostró la viabilidad celular ~ 95%. Las células de Kupffer mostraron una forma redonda dentro de 30 min de incubación a 37 ° C, en relación con su morfología adherente incompletos (Figura 4A). A las 4 horas de incubación y de...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los siguientes pasos son fundamentales para lograr un alto rendimiento y una alta viabilidad de las células de Kupffer. Las condiciones asépticas deben utilizarse para limitar el riesgo de contaminación bacteriana y fúngica. Todos los instrumentos deben ser esterilizados antes de su uso. Los reactivos deben prepararse justo antes de llevar a cabo el procedimiento de aislamiento.

La elección de la colagenasa IV, con baja actividad tríptico, es crucial. Los diferentes lotes del mismo proveedor...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el programa de la Red Marie-Curie de FP7-ITN de la UE, RADDEL. MB y KAJ desean agradecer a Joe Varguese y Rui Serra Maia por su ayuda y sugerencias a lo largo de la optimización del aislamiento de la célula de Kupffer.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Euthatal (pentobarbital sódico)Merial
CD1 ratones CharlesRiver   -El peso del ratón debe variar de 35 a 45 g. Aconsejamos el uso de ratones machos CD1 ya que su peso aumenta rápidamente (por ejemplo un ratón macho CD1 de 7 semanas de edad supera los 35 g de peso). También se aconseja ponerse en contacto con el proveedor de animales con antelación para organizar la entrega de los animales mayores. Alternativamente, los animales pueden estar en casa para alcanzar el peso deseado.
HBSS (Ca2+ y Mg2+ sin , con bicarbonato)   Tecnologías de la Vida   14175-053HBSS debe ser   Ca2+ gratis. 
Sal tetrasódica de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA);Sigma-Aldrich   E8145   También se puede utilizar EDTA, pero EGTA tiene la ventaja de quelar Ca2+ selectivamente.
HEPES (1 M) Tecnologías de la Vida   15630-056 y nbsp;100 ml 
Colagenasa tipo IV Worthington CSL-4 Se recomienda probar diferentes lotes de colagenasa o al menos mencionar al proveedor que el producto debe ser adecuado para el aislamiento de células hepáticas 
  DMEM  Glucosa bajaSigma-Aldrich   D5523 500 ml 
RPMI (con piruvato de sodio y Glutamax) Tecnologías de la Vida   12633-012 500 ml
Penicilina/Steptomycin Tecnologías de la Vida   15140-122100 ml
Suero Fetal Bovino Primer enlace   60-00-850 500 ml 
Solución de azul de tripán Sigma-Aldrich T8154 100 ml 
Solución de partículas de sílice recubierta (Percoll)GE Healtcare   17-0891-02 Percoll® es muy estable y se puede conservar durante varios años 
1x solución salina tamponada con fosfato    Tecnologías de la Vida   10010-023500 ml 
10x solución salina tamponada con fosfato    Tecnologías de la Vida   70011-036500 ml
Dimetilsulfóxido Pescador D/4120/PB08 500 ml 
Kit de LDH (CytoTox 96) Promega G1781 Manténgase protegido de la luz 
DMEM rojo fenol librede Life Technologies   31053-028500 ml 
Anticuerpo F4/80 (Alexa 488)AbD SerotecMCA497A488No diluir, usado solo para la citometría de flujo
Perlas fluorescentesSigmaL2778Perlas de látex, poliestireno modificado con aminas, rojo fluorescente. 1 ml
Nombre de la empresa de materiales Número de catálogo Comentarios/Descripción 
Juego de extracción de sangre de mariposa (tubo de 23 G/305 mm de longitud)   BD 
Filtros de jeringa (0,22 μ m Borde Azul) Minisart 16534-K 
Tubos de centrífuga (tapa azul de 50 ml)  BD Biociencias, Halcón  35 2070 
Placa de Petri (90 x 15 mm) Thermo Fisher Scientific   BSN 101VR20 
100 μ Filtro de células M   BD   352360
Bomba peristáltica Watson Marlow SciQ 300   Enjuague los tubos antes y después de cada uso con PBS estéril y etanol al 70%.
Placas de 24 pocillosCorning   3526
placas de 96 pocillos Corning   3595
Centrífuga Eppendorf5810R Lector de
placasBMG LabtechFLUOstar Pinza Omega
SerrefineHammacher GmbH N.º de art. HSE 004-35 / N.º de cat. 221-0051Las pinzas de serrefine permiten sujetar el vaso canulado con la aguja de 23 G sin necesidad de sujetar las pinzas durante el procedimiento de perfusión. Dirección URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) 
Tubos de citometría de flujoBD Biosciences, Falcon 
Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)Elkay  000-MICR-150
Raspador de célulasBD Biosciences, Falcon353086Corte las extremidades de la hoja con un par de tijeras para raspar células en placas de 24 pocillos.
Nombre de la empresa de reactivos Número de catálogo Comentarios/Descripción 
  Solución EGTA (ácido tetraacético de etilenglicol)/HBSS (solución salina equilibrada de Hank) HBSS que contiene 0,5 mM de EGTA y 25 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.4. Prepare 50 ml para cada hígado para perfundir.  
Solución de colagenasa DMEM bajo en glucosa que contiene colagenasa tipo IV a 100 UI/ml, 15 mM HEPES y 1% de penicllina/estreptamicina (v/v). Ajuste el pH a 7.4. Prepare 100 ml para cada hígado para perfundir. Después de agregar la colagenasa, se recomienda calentar la solución durante 30 minutos antes de usarla. Esto permite que la actividad de la colagenasa sea óptima.
Medio de aislamiento celular Kupffer RPMI contiene, 1% de aminoácidos no esenciales (v/v), 1% glutamax® (v/v) y 1% de penicllina/estreptomicina (v/v). Prepare al menos 100 ml para 1-3 hígados.  
Medio de cultivo celular de Kupffer RPMI que contiene 10% Suero Fetal Bovino, 1% Aminoácidos No Esenciales (v/v), 1% Glutamax® (v/v) y 1% de penicllin/estreptamicina (v/v). Prepare al menos 100 ml para 1-3 hígados.  
SIP (solución de partículas de sílice recubiertas de isotónico)Mezcle 1,7 ml de solución salina tamponada con fosfato 10x con 15,3 ml de Percoll para obtener 17 ml de SIP.
Solución SIP del 25% Mezcle 5 ml de SIP con 15 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato   
Solución SIP al 50% Mezcle 10 ml de SIP con 10 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato 
TampónDMEM medios con solución
PBS/BSAPrepare solución salina tamponada con fosfato fresco pH 7,4 con albúmina sérica bovina al 1 %.
367288352052 de lisis Triton X-100 al 0,9 %

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
  2. Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
  3. Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
  4. Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
  5. Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
  6. Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
  7. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
  8. Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
  9. Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
  10. Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
  11. Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
  12. Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
  13. Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
  14. Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
  15. Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
  16. Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
  17. Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
  18. Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
  19. Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
  20. Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
  21. Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
  22. Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
  23. Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
  24. Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14(2003).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Kupffer Cell IsolationNanoparticle Toxicity TestingMouse Liver MacrophagesCollagenase DigestionDensity Gradient CentrifugationFlow Cytometry AnalysisFunctionalized Carbon NanotubesModified LDH AssayNon Parenchymal CellsPortal Vein Cannulation

Artículos relacionados