Las técnicas presentadas para la recolección de hígado, la canulación y la perfusión utilizando nuestro dispositivo patentado permiten sofisticadas configuraciones de perfusión para mejorar los experimentos de descelularización y recelularización en hígados de rata.
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Artículo de método
Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión
En este artículo
Resumen
Resumen
La descelularización y recelularización de órganos parenquimatosos puede permitir la generación de órganos funcionales in vitro, y ya se han publicado varios protocolos para la descelularización del hígado en roedores. Nuestro objetivo fue mejorar el proceso de descelularización mediante la construcción de un dispositivo de perfusión patentado que permitiera la perfusión selectiva a través de la vena porta y/o la arteria hepática. Además, se buscó realizar la perfusión bajo condiciones de presión circundante oscilante para mejorar la homogeneidad de la descelularización. La homogeneidad de la descelularización de la perfusión ha sido un factor subestimado hasta la fecha. Durante la descelularización, las áreas dentro del órgano que están mal perfundidas aún pueden contener células, mientras que la matriz extracelular (MEC) en las áreas bien perfundidas ya puede estar afectada por detergentes alcalinos. Los cambios de presión oscilantes pueden imitar los cambios de presión intraabdominal que ocurren durante la respiración para optimizar la microperfusión dentro del hígado. En el estudio que aquí se presenta, se analizaron matrices hepáticas de rata descelularizadas mediante tinción histológica, análisis de contenido de ADN y fundición por corrosión. La perfusión a través de la arteria hepática mostró resultados más homogéneos que la perfusión venosa portal. La aplicación de condiciones de presión oscilante mejoró la efectividad de la descelularización de la perfusión. Los hígados perfundidos a través de la arteria hepática y en condiciones de presión oscilante mostraron los mejores resultados. Las técnicas presentadas para la extracción, canulación y perfusión del hígado utilizando nuestro dispositivo patentado permiten configuraciones de perfusión sofisticadas para mejorar los experimentos de descelularización y recelularización en hígados de rata.
Introducción
Descelularización y recelularización pueden permitir la generación de órganos funcionales, trasplantables in vitro 1. Mediante la eliminación de las células y material antigénico (por ejemplo., ADN, los epítopos alfa-gal) de un órgano, la matriz extracelular no o menos inmunogénico (ECM) se puede obtener. Esta matriz conserva la microanatomía tridimensional de un órgano y puede servir como la biomatriz ideal para repoblación con células de un origen diferente, posiblemente xenogénico 2. Por lo tanto, una matriz de hígado de rata descelularizado podría ser repoblado con células de hígado humano. Este micro-hígado humanizado podr....
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Protocolo
Los animales se mantuvieron en el Centro de Medicina Experimental (FEM, Charité, Berlín, Alemania), y todos los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por la Oficina Estatal de Sanidad y Locales (LAGeSo, Berlín, Alemania; Reg. No. O 0365 / 11).
Cosecha 1. Hígado
- Preparación prequirúrgica
- Utilice una placa de corcho para la fijación. Ponga un paño médica en el plato. Utilizando cuatro agujas, fijar una máscara de inhalación en la placa de corcho para la narcosis por inhalación intraoperatoria.
- Predisposición del Portal venosa cánula
- Conecte un catéter venoso periférico (G 2....
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Resultados
La homogeneidad y por lo tanto la efectividad de diferentes protocolos de descelularización se evaluaron por observación macroscópica, el análisis histológico, y el análisis del contenido de ADN restante dentro de matrices de hígado descelularizados. Además, se realizó la colada de corrosión para visualizar la microanatomía de los hígados intactos después de descelularización.
Macroscopía
Durante descelularización, hígados convierten lucent, lo que indica la elim.......
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Discusión
Aunque la técnica presentada para la cosecha de hígado de rata y descelularización es fácilmente reproducible, hay ciertos pasos críticos a considerar:
Durante la preparación para la cosecha del hígado, es importante para evitar el sangrado grave porque va a activar la coagulación de la sangre y puede conducir a la formación de coágulos de sangre dentro del hígado. En nuestra opinión, es ventajoso incisión en la aorta abdominal directamente antes de la canulación de la vena porta para evitar.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens y Katharina Struecker por su ayuda durante este proyecto.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cánula arterial autoconstruida | |||
| Portex Tubo de Polietileno No Estéril | SIMS Portex | REF 800/110/100 | 0.28 mm ID 0.61 mm OD |
| Portex Tubo de Polietileno No Estéril | SIMS Portex | REF 800/110/200 | 0.58 mm ID 0.96 mm |
| OD Venodrop Catéter de mariposa seguro | Fresenius Kabi | 3275851 | 21 G |
| cánula de vena | |||
| porta Catéter Venoso periférico | BD 393224 | BD Venflon Pro 20G | |
| Llave de paso de tres vías | smiths medical | 888-101RE | |
| cirugía Cotton Sticks | Hecht-Assistent | 4302 | |
| Almohadillas de algodón | Shaoxing Zhengde Apósito quirúrgico | 13H118-03 | |
| Vendaje de gasa | Hubei Haige Instrumentos Médicos | 14388 | |
| Solución Ringer | Fresenius Kabi | 13 HKP022 | 1000 ml |
| 10 ml Jeringa | Braun | 4606108V | 10 ml/ Luer Solo |
| 5 ml Jeringa | Braun | 4606061V | 5 ml /Luer Solo |
| Suture (Seda 6/0) | Resorba | H1F | LOT 105001.81 |
| paño médico | Shaoxing Zhengde Apósito quirúrgico | D0613011 | |
| surgical | |||
| portaagujas | para instrumentos Geuder | 17570 | |
| micropinzas | Inox-Electronic | 91150-20 | |
| microtijeras | Martin | 11-740-11 | |
| micropinzas | S& T | ||
| Abrazadera | Aesculap | BH111R | |
| tijeras | F S T | 14501-14 | |
| pinza quirúrgica | Aesculap | BD 557 | |
| Respirador de descelularización | |||
| Resmed | 14.24.11.0004 | SmartAIR ST | |
| Dispositivo de perfusión | Charite, laboratorio de ingeniería médica | dispositivo a medida dispositivo de | descelularización |
| bomba peristáltica ismatec reglo ICC | IDEX | ISM4408 | 4 canales |
| Extensión Heidelberger 75 cm | Fresenius Kabi | 2873 | 75 cm |
| MS/CA segmento de bomba | IDEX | IS 3510 | MS/CA/click'n'go/POM-C |
| Tubo de 2 tapones CA | Trampa | Pharmed BPT NSF-51 | |
| hecho a medida | |||
| Conector de manguera Luer Lock | Neolab Nº | 02-1887 | |
| Detergentes | |||
| SDS pellets | Carl Roth | CN30.4 | 2,5 kg |
| Tritón X-100 | Carl Roth | 3051.1 y nbsp; | 10 L |
| PBS | Gibco | 14190-094 | DPBS |
| tinción | |||
| Eosina 1% | Morphisto | 10177 | |
| Mayer hematoxilina | AppliChem | A4840 | |
| tinción gomori | Morphisto | 11104 | |
| AlcainBlue-PAS tinción | Morphisto | 11388 | |
| Rojo Directo 80 | Sigma Aldrich | 365548 |
Referencias
- Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials
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Reimpresiones y permisos
