Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión

Resumen

Las técnicas presentadas para la recolección de hígado, la canulación y la perfusión utilizando nuestro dispositivo patentado permiten sofisticadas configuraciones de perfusión para mejorar los experimentos de descelularización y recelularización en hígados de rata.

Resumen

La descelularización y recelularización de órganos parenquimatosos puede permitir la generación de órganos funcionales in vitro, y ya se han publicado varios protocolos para la descelularización del hígado en roedores. Nuestro objetivo fue mejorar el proceso de descelularización mediante la construcción de un dispositivo de perfusión patentado que permitiera la perfusión selectiva a través de la vena porta y/o la arteria hepática. Además, se buscó realizar la perfusión bajo condiciones de presión circundante oscilante para mejorar la homogeneidad de la descelularización. La homogeneidad de la descelularización de la perfusión ha sido un factor subestimado hasta la fecha. Durante la descelularización, las áreas dentro del órgano que están mal perfundidas aún pueden contener células, mientras que la matriz extracelular (MEC) en las áreas bien perfundidas ya puede estar afectada por detergentes alcalinos. Los cambios de presión oscilantes pueden imitar los cambios de presión intraabdominal que ocurren durante la respiración para optimizar la microperfusión dentro del hígado. En el estudio que aquí se presenta, se analizaron matrices hepáticas de rata descelularizadas mediante tinción histológica, análisis de contenido de ADN y fundición por corrosión. La perfusión a través de la arteria hepática mostró resultados más homogéneos que la perfusión venosa portal. La aplicación de condiciones de presión oscilante mejoró la efectividad de la descelularización de la perfusión. Los hígados perfundidos a través de la arteria hepática y en condiciones de presión oscilante mostraron los mejores resultados. Las técnicas presentadas para la extracción, canulación y perfusión del hígado utilizando nuestro dispositivo patentado permiten configuraciones de perfusión sofisticadas para mejorar los experimentos de descelularización y recelularización en hígados de rata.

Introducción

Descelularización y recelularización pueden permitir la generación de órganos funcionales, trasplantables in vitro ^1. Mediante la eliminación de las células y material antigénico (por ejemplo., ADN, los epítopos alfa-gal) de un órgano, la matriz extracelular no o menos inmunogénico (ECM) se puede obtener. Esta matriz conserva la microanatomía tridimensional de un órgano y puede servir como la biomatriz ideal para repoblación con células de un origen diferente, posiblemente xenogénico ^2. Por lo tanto, una matriz de hígado de rata descelularizado podría ser repoblado con células de hígado humano. Este micro-hígado humanizado podría servir como un modelo ex vivo para la investigación de enfermedades (por ejemplo., Enfermedades metabólicas congénitas, enfermedades virales o tumores malignos) o para las pruebas farmacéuticas preclínico ^3.

Varios protocolos diferentes para perfusión descelularización hígado de rata ya se han publicado ^4-13. En todos los protocolos, decellularzación se logró mediante la perfusión de detergentes iónicos o no iónicos alcalinas través de la vena portal canulado. A lo mejor de nuestro conocimiento, fuimos el primer grupo reportar rata descelularización hígado por perfusión selectiva a través de la vena porta y / o la rata arteria hepática ^14. Activación de la perfusión selectiva de los diferentes sistemas vasculares en el hígado puede permitir mejores resultados descelularización y, además, pueden desempeñar un papel importante en la repoblación celular.

En el estudio se detalla aquí, los hígados se perfundieron en un dispositivo de perfusión de propiedad a medida, permitiendo la perfusión bajo condiciones de presión oscilantes. Estas condiciones de presión imitan la perfusión respiratoria dependiente fisiológica del hígado: in situ, el hígado cuelga bajo la cópula del diafragma, cuyo movimiento durante la respiración tiene un impacto directo en la perfusión del hígado. La inspiración conduce específicamente a la reducción del diafragma y apretando del hígado, optimizandoflujo de salida hepato-venosa, mientras que la expiración conduce a la elevación del hígado y disminución de la presión intraabdominal para optimizar flujo de entrada venosa ^portal-15.

Nuestro objetivo fue evaluar si oscilantes condiciones de presión tienen un impacto en la homogeneidad de la perfusión descelularización hígado de rata imitando condiciones intraabdominales ex vivo. La homogeneidad del proceso de descelularización puede ser un factor subestimado en descelularización perfusión. Todos los agentes conocidos utilizan para Descelularización hígado causan alteraciones en el ECM. Las células en áreas mal perfundidas permanecen dentro de la ECM, mientras que otras áreas están ya completamente descelularizado. Para disolver las células restantes, la duración de la perfusión o la presión deben ser elevados, causando más alteraciones a las áreas bien perfundidos. Por lo tanto, los detergentes para descelularización deben ser distribuidos de forma homogénea dentro del órgano.

Protocolo

Los animales se mantuvieron en el Centro de Medicina Experimental (FEM, Charité, Berlín, Alemania), y todos los protocolos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por la Oficina Estatal de Sanidad y Locales (LAGeSo, Berlín, Alemania; Reg. No. O 0365 / 11).

Cosecha 1. Hígado

1. Preparación prequirúrgica
   1. Utilice una placa de corcho para la fijación. Ponga un paño médica en el plato. Utilizando cuatro agujas, fijar una máscara de inhalación en la placa de corcho para la narcosis por inhalación intraoperatoria.
2. Predisposición del Portal venosa cánula
   1. Conecte un catéter venoso periférico (G 20) a una llave de tres vías. El catéter venoso debe ser cortado oblicuamente, con una longitud de aprox. 1,5 cm.
   2. De-aire del sistema usando una jeringa de 10 ml llena con solución Ringer. Es muy importante cuidadosamente-air de embolia de gas porque puede afectar negativamente a la descelularización perfusión.
3. Predisposiciónde la cánula arterial
   1. Utilice una cánula de mariposa y cortar la aguja a una longitud de 5 mm. Colocar un tubo de 5 cm (ID 0,58 mm; OD 0.96 mm) a la aguja 5 mm y fijarlo con pegamento. Inserte un tubo de 2 cm de largo (ID 0,28 mm; OD 0.61 mm) en el tubo más grande y fijarlo con pegamento.
   2. Slip otro tubo sobre esta construcción como tope y fijarlo con pegamento. De-aire de la cánula arterial con una jeringa de 5 ml llena con solución Ringer.
4. Anestesia y Analgesia
   1. Inducir narcosis de la rata en la cámara de inducción de la anestesia por 3,5% de isoflurano en oxígeno a una velocidad de flujo de 1,5 L / min.
   2. Para asegurar la analgesia segura durante la operación, inyecte metamizol (100 mg de masa corporal / kg) y dosis bajas de ketamina / medetomidina (10 mg / 0,1 mg por kg de masa corporal) por vía intraperitoneal.
   3. Suministro de 1,5% de isoflurano en 1 L / min de oxígeno a través de la máscara de inhalación para su posterior mantenimiento de la anestesia quirúrgica.
5. Arreglos preoperatorias
   1. Afeitarse el abdomen liberalmente con una máquina de corte eléctrico. Humedecer el sitio de la incisión en el abdomen afeitado con etanol al 70% para la desinfección.
   2. Colocar el animal en posición supina en el plato preparado, inserte la cabeza en la máscara de inhalación y fijar las extremidades con cinta y los pines médica. Retire el exceso de etanol y la piel con una compresa de gasa.
6. Evaluación Anestesia
   1. Evaluar la profundidad de anestesia viendo la frecuencia respiratoria. Cuando la anestesia parece bastante profunda (40 a 60 respiraciones / min), comprobar si la analgesia es suficiente por tratar de desencadenar el reflejo pizca dedo utilizando pinzas quirúrgicas para pellizcar la piel entre los dedos de ambas extremidades posteriores.
7. Enfoque abdominal
   1. Haga una incisión mediana en la pared abdominal caudal por encima de la vejiga. Cortar en este punto a los dos arcos costales laterales en forma en forma de V. Tenga cuidado de no cortar el diafragma. Tire de la pared abdominal cortar sobre el pecho.
   Fijar el xifoides con una pinza Overholt, tire de él craneal y fijarlo con una banda elástica. Use hisopos de algodón mojado para evacuar el intestino. Envuelva el intestino en un vendaje de gasa húmeda. Por otra parte, cubrir todos los márgenes abdominales con vendajes húmedos.
8. Preparación de hígado
   1. Diseccionar el ligamento falciforme. Use un vendaje de gasa húmeda para mantener los lóbulos hepáticos medial y craneal izquierda bajo la cúpula del diafragma. Exponer el ligamento hepatoduodenal y el lóbulo del hígado omental superior.
   2. Utilice dos microforceps y tijeras de primavera para diseccionar cuidadosamente el ligamento unido al lóbulo omental superior hasta el lóbulo es móvil. Mueva el lóbulo usando hisopos de algodón mojado bajo la compresa de gasa, la celebración de los lóbulos medial y dejados en su lugar.
   3. Después de la movilización del lóbulo hepático omental superior, mueva el estómago a la izquierda. Fijar el estómago con una pinza y diseccionar el epiplón menor con microforceps y las tijeras de primavera.
   4. Movilizar el omentos menorl lóbulo hepático hasta que es móvil y posteriormente mover el lóbulo de nuevo en su cavidad. Utilice una abrazadera Backhaus para retener el duodeno. Mueva el duodeno a la izquierda para estirar y exponer el ligamento hepatoduodenal. Circunscribir el conducto biliar común en el ligamento hepatoduodenal estirada.
   5. Diseccionar el conducto de la bilis desde el tejido adiposo y páncreas. Cortar el conducto biliar 1,5 cm de la bifurcación de la vía biliar. Diseccionar la vena portal desde el tejido adiposo circundante. Exponer la vena gastroduodenal.
   6. Ligar la vena gastroduodenal dos veces con seda 6-0 y dividir la vena entre las 2 ligaduras. Diseccionar el tronco celíaco y la arteria hepática común del tejido circundante hasta que toda ramas arteriales se revelan.
   7. Libera la arteria gastroduodenal del tejido circundante. Ate la arteria gastroduodenal dos veces con seda 6-0, con los lazos distantes unos de otros. Diseccionar la arteria gastroduodenal entre las 2 ligaduras.
   8. Libera la arteria esplénicadel tejido circundante. Ate la arteria esplénica dos veces con seda 6-0, con los lazos distantes unos de otros. Diseccionar la arteria esplénica entre las 2 ligaduras.
   9. Libera la arteria gástrica izquierda desde el tejido circundante. Ate la arteria gástrica izquierda dos veces con seda 6-0, con los lazos distantes unos de otros. Diseccionar la arteria entre las 2 ligaduras.
   10. Circunscribir la vena cava inferior entre el riñón derecho y el lóbulo del hígado lateral derecha. Diseccionar la vena desde el espacio retroperitoneal. Exponer la aorta siguiendo el tronco celíaco.
   11. Diseccionar el tejido adiposo retroperitoneal. Inyectar 1000 IE heparina en 1 ml de solución salina en la vena cava inferior. Retirar la cánula y cerrar la incisión con un algodón. Espere 1-2 min para el efecto sistémico de la heparina.
   12. Circunscribir la aorta con pinzas. Diseccionar la aorta y Exsanguinate la rata. Además, diseccionar la vena cava inferior distalmente desde el riñón.
9. Portal venosa Canulación (Use la cánula preparado en la sección 1.2)
   1. Haga una incisión peces aftosa en la vena porta distal. Abra la incisión con fórceps y canular la vena porta. Enjuague el hígado con 20 ml de solución de Ringer hasta que los decolora hígado y fijar la cánula con ligaduras (seda 6-0).
10. Arterial canulación (Use la cánula preparado en la sección 1.3)
    1. Diseccionar la aorta por encima del tronco celíaco. Libera el segmento de aorta desde el espacio retroperitoneal. Cortar el segmento de aorta longitudinalmente para generar un parche aórtico. Inserte la cánula de construcción propia en un soporte estático.
    2. Utilice 2 pinzas para deslizar el parche aórtico sobre la cánula. Ligar la arteria hepática con seda 6-0 sobre la cánula y fijar el parche en el pilar.
11. Explantación Hígado
    1. Abra el diafragma, hacer una incisión circular y diseccionar el hígado a partir de las estructuras circundantes.
12. Almacenamiento
    1. Store el hígado en un tanque de 500 ml estéril lleno de solución 350 ml de timbre hasta su uso.

2. soluciones detergentes

1. 10% de solución de Triton X-100 de stock
   1. Llene una botella de 1000 ml con 900 ml de agua destilada. y añadir 100 ml de Triton X-100 (99,9%). Utilice un agitador para disolver el Triton X-100. Llena la botella con agua destilada. hasta un volumen total de 1.000 ml se alcanza.
2. 1% Triton X-100
   1. Añadir 100 ml de la solución madre (10%) a una botella de 1000 ml. Añadir 900 ml de agua destilada. y agitar la botella dos veces. Filtrar la solución 1% de Triton X-100 a través de un filtro estéril.
3. 10% de SDS de la Solución
   1. Llene una botella de 1000 ml con 900 ml de agua destilada. y añadir 66,99 g de SDS (99,9%, la densidad de 0,67). Utilice un agitador para disolver el SDS. Llena la botella con agua destilada. hasta un volumen total de 1.000 ml se alcanza.
4. 1% de SDS
   1. Añadir 100 ml de la solución madre (10%) a un bot 1000 mltle. Añadir 900 ml de agua destilada. y agitar la botella dos veces. Se filtra la solución de SDS al 1% a través de un filtro estéril.

3. Descelularización

1. Puesta en marcha del dispositivo de perfusión

Figura 1:. Esquema del dispositivo de perfusión para Selectivo arterial y venoso portal perfusión de cuatro hígados de rata bajo oscilantes Condiciones Presión (. Modificado de Struecker et al ¹⁴⁾

1. Enlace el drenaje a una llave de paso de tres vías y una extensión Heidelberger para regular el nivel de llenado y llenar el reactor con 500 ml de NaCl 0,9%.
   

Figura 2:. Esquema de la perfusión set-up link la cámara de perfusión (1,400 cm ³⁾ (1) al extremo distal (4) de la trampa de burbujas (5) a través del acceso venoso portal (2) o a través de la ac arterialproceso (3). La trampa de burbujas (5) debe estar equipado con una obturación (4) en el extremo distal y un orificio de ventilación (6). Conectar la trampa de burbujas (5) a una extensión de Heidelberger (7). Enlazar la extensión Heidelberger al segmento de bomba (8). Además, conectar el segmento de bomba (8) a otra extensión Heidelberger (9). Inserte la última extensión Heidelberger (9) en la botella de solución de detergente (10). Conectar el respirador (11) a la cámara de perfusión (o al distribuidor de presión en el caso de múltiples perfusiones). Para drenar los fluidos del reactor, conecte la salida de la botella de residuos (12).

1. Introduce el segmento de la bomba en la bomba. Arrancar la bomba para llenar el ciclo con PBS, cerrar el extremo distal de la trampa de burbujas y abrir el respiradero. Cuando la parte inferior de la burbuja está cubierto de forma segura con PBS (2-3 cm), cerrar el respiradero y abrir el extremo distal de la trampa de burbujas.
2. Instalación de hígado
   1. Enlazar la llave de tres vías de la cánula de la vena portal para el acceso reactor relacionada. Connect la cánula arterial para el acceso arterial. Tenga cuidado para asegurar que el aire no entra en los sistemas.
3. Aplicación de oscilantes Condiciones Presión
   1. Use un respirador con una frecuencia de 15 lpm y una amplitud de 26 mbar (min. 4 mbar, máx. 30 mbar). Conectar el respirador a la cámara de distribución de la presión y conectar la cámara al reactor. Iniciar la aplicación de presión.
4. Protocolo Descelularización
   1. Realice los pasos de perfusión con un caudal de 5 ml / min. Iniciar la descelularización con la perfusión del hígado con 1% de Triton X-100 durante 90 min. Permitir emanación de residuos a través de la salida del dispositivo de perfusión para mantener el nivel de fluido dentro de la cámara de perfusión constante y por encima del hígado perfundido. Después de 90 min, cambiar el detergente a 1% de SDS.
      
      

Figura 3: Protocolo de perfusión para todos los grupos experimentales.

Resultados

La homogeneidad y por lo tanto la efectividad de diferentes protocolos de descelularización se evaluaron por observación macroscópica, el análisis histológico, y el análisis del contenido de ADN restante dentro de matrices de hígado descelularizados. Además, se realizó la colada de corrosión para visualizar la microanatomía de los hígados intactos después de descelularización.

Macroscopía

Durante descelularización, hígados convierten lucent, lo que indica la elim...

Discusión

Aunque la técnica presentada para la cosecha de hígado de rata y descelularización es fácilmente reproducible, hay ciertos pasos críticos a considerar:

Durante la preparación para la cosecha del hígado, es importante para evitar el sangrado grave porque va a activar la coagulación de la sangre y puede conducir a la formación de coágulos de sangre dentro del hígado. En nuestra opinión, es ventajoso incisión en la aorta abdominal directamente antes de la canulación de la vena porta para evitar...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cánula arterial autoconstruida
Portex Tubo de Polietileno No Estéril	SIMS Portex	REF 800/110/100	0.28 mm ID 0.61 mm OD
Portex Tubo de Polietileno No Estéril	SIMS Portex	REF 800/110/200	0.58 mm ID 0.96 mm
OD Venodrop Catéter de mariposa seguro	Fresenius Kabi	3275851	21 G
cánula de vena
porta Catéter Venoso periférico	BD 393224		BD Venflon Pro 20G
Llave de paso de tres vías	smiths medical	888-101RE
cirugía Cotton Sticks	Hecht-Assistent	4302
Almohadillas de algodón	Shaoxing Zhengde Apósito quirúrgico	13H118-03
Vendaje de gasa	Hubei Haige  Instrumentos Médicos	14388
Solución Ringer	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml Jeringa	Braun	4606108V	10 ml/ Luer Solo
5 ml Jeringa	Braun	4606061V	5 ml /Luer Solo
Suture (Seda 6/0)	Resorba	H1F	LOT 105001.81
paño médico	Shaoxing Zhengde Apósito quirúrgico	D0613011
surgical
portaagujas	para instrumentos Geuder	17570
micropinzas	Inox-Electronic	91150-20
microtijeras	Martin	11-740-11
micropinzas	S& T
Abrazadera	Aesculap	BH111R
tijeras	F S T	14501-14
pinza quirúrgica	Aesculap	BD 557
Respirador de descelularización
	Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
Dispositivo de perfusión	Charite, laboratorio de ingeniería médica	dispositivo a medida dispositivo de	descelularización
bomba peristáltica ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	4 canales
Extensión Heidelberger 75 cm	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA segmento de bomba	IDEX	IS 3510	MS/CA/click'n'go/POM-C
Tubo de 2 tapones CA	Trampa	Pharmed BPT NSF-51
			hecho a medida
Conector de manguera Luer Lock	Neolab Nº	02-1887
Detergentes
SDS pellets	Carl Roth	CN30.4	2,5 kg
Tritón X-100	Carl Roth	3051.1 y nbsp;	10 L
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
tinción
Eosina 1%	Morphisto	10177
Mayer hematoxilina	AppliChem	A4840
tinción gomori	Morphisto	11104
AlcainBlue-PAS tinción	Morphisto	11388
Rojo Directo 80	Sigma Aldrich	365548