Molecular Sonda Optimización para determinar la mortalidad celular en una fotosintética Organismo (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Usando citometría de flujo

Resumen

Las poblaciones microbianas contienen heterogeneidad celular sustancial, que puede dictar el comportamiento general. Análisis de la sonda molecular a través de citometría de flujo puede determinar estados fisiológicos de las células, sin embargo su aplicación varía entre las especies. Este estudio proporciona un protocolo para determinar con precisión la mortalidad celular dentro de una población cianobacteria, sin menospreciar o grabación de resultados falsos positivos.

Resumen

Subpoblaciones microbianos en los estudios de campo y de laboratorio se ha demostrado que mostrar una alta heterogeneidad en los parámetros morfológicos y fisiológicos. Determinar el estado en tiempo real de una célula microbiana va más allá de las categorías vivos o muertos, como los microbios pueden existir en un estado latente, en el que la división celular y las actividades metabólicas se reducen. Teniendo en cuenta la necesidad de detección y cuantificación de los microbios, citometría de flujo (FCM) con sondas moleculares proporciona un método rápido y preciso para ayudar a determinar la viabilidad global de la población. Mediante el uso de SYTOX verde y SYTOX naranja en el modelo de cianobacterias Microcystis aeruginosa para detectar la integridad de membrana, desarrollamos un método transferible para la indicación rápida de la mortalidad de células individuales. Las sondas moleculares utilizados en esta revista se hará referencia a sondas de ácido nucleico como verde o naranja, respectivamente (aunque hay otros productos con longitudes de onda de excitación y emisión similares que tienen unos modos comparables de action, nos referimos específicamente a la palestra mencionó sondas). Protocolos utilizando sondas moleculares varían entre especies, que difieren principalmente en la concentración y el tiempo de incubación. Siguiendo este protocolo establecido en M. aeruginosa la sonda de ácido nucleico verde se optimizó en concentraciones de 0,5 M después de 30 minutos de incubación y la sonda de ácido nucleico naranja en 1 M después de 10 min. En ambas sondas concentraciones inferiores a la óptima indicado conducido a un bajo notificación de células con daño de la membrana. Por el contrario, 5 M concentraciones y superior en ambas sondas mostraron un tipo de tinción no específica, mediante el cual las células 'en vivo' producen una fluorescencia de destino, lo que lleva a una representación más del número de células "no viables". Los controles positivos (con el calor mató), siempre biomasa muerta comprobable, aunque la adecuación de la generación de control sigue siendo objeto de debate. Al demostrar una secuencia lógica de pasos para la optimización de las sondas de ácido nucleico verde y naranja de nosotrosmonstrate cómo crear un protocolo que se puede utilizar para analizar el estado fisiológico de cianobacterias con eficacia.

Introducción

La célula es un sistema complejo, que responde constantemente con el medio ambiente mediante la modificación de parámetros fisiológicos y alterar su función. La dinámica poblacional de las poblaciones microbianas isogénicas tanto en la naturaleza y el laboratorio se ven afectados por el desarrollo de las subpoblaciones, ocurriendo incluso en relativamente constantes las condiciones ambientales ^{1 - 3.} La variabilidad de las comunidades microbianas naturales surge debido a la naturaleza altamente variable de condiciones ambientales. Estos procesos estocásticos veces posteriormente producen subpoblaciones que son muy diferentes a la medi....

Protocolo

1. Preparación de la sonda Molecular y citómetro de flujo

1. Diluir las soluciones madre de las sondas de ácido nucleico, que se suministran en forma de solución 5 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) a alícuotas de las concentraciones requeridas en ultrapura filtrada _H2O
2. Guarde las sondas de ácido nucleico en condiciones de oscuridad entre -5 ^{° C y} - 25 ^{° C} hasta su uso.
3. Encienda el citómetro de flujo y el paquete de software de carga (ver tabla de Materiales / Equipo para especificaciones FCM).
4. Coloque un tubo de hemólisis vacía (12 x 75 mm) en la sonda de inyección de muestra (SIP), haga clic en desta....

Resultados

Dispersión frontal de luz (FSC) y salidas de luz lateral de dispersión (SSC) a partir de un cultivo discontinuo M. aeruginosa en fase exponencial proporciona información sobre el tamaño celular (diámetro) y granularidad interna, respectivamente (Figura 1). FSC puede discriminar las células que son demasiado grandes y / o pequeños para ser M. aeruginosa. Esta discriminación o compuerta se puede hacer mediante los datos de refinación entre determinados pu.......

Discusión

El aumento del número de publicaciones utilizando sondas moleculares indican que los datos fiables e informativas se pueden obtener ^{5,6,8 - 15,19,22,23.} Hasta el momento no hay ninguna mancha perfecta para la viabilidad celular que puede ser eficaz en todas las especies con la misma concentración y tiempo de incubación ^6,10. Incluso el mismo tipo de sonda con emisiones de fluorescencia alteradas muestra una necesidad de establecer la concentración y tiempo de incubación correc.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios de cianobacterias	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Solución concentrada de agua dulce (dilución x50)
Fluido de descontaminación	BD Biosciences	653155	Ejecute durante 2 minutos cuando las salidas sean más de 12 eventos por segundo en rápido o un caudal de 66 &; l/min.  Seguido de 2 min de la funda H2O.
Citómetro	de flujo BD Biosciences	bajo pedido	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Tinción de ácido nucleico – Solución de 5 mM en DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Tinción de ácido nucleico – Solución de 5 mM en DMSO