Immunfluorescens å overvåke cellulært opptak av menneskelig lactoferrin og tilhørende antiviral aktivitet mot hepatitt C-viruset

Abstract

Immunfluorescens er en laboratorieteknikk som vanligvis brukes til å studere mange aspekter av biologi. Det er vanligvis brukt for å visualisere fordelingen og / eller lokalisering av et målmolekyl i celler og vev. Immunfluorescens er avhengig av spesifisiteten av fluorescensmerkede antistoffer mot deres tilsvarende antigener i en celle. Både direkte og indirekte immunfluorescens tilnærminger kan brukes som baserer seg på bruk av antistoffer forbundet med en fluorokrom. Direkte immunfluorescens er mindre hyppig brukt fordi det gir lavere signal, medfører høyere kostnader og mindre fleksibilitet. I motsetning til dette er indirekte immunfluorescens mer vanlig brukt på grunn av sin høye følsomhet og gir et forsterket signal ettersom mer enn ett sekundært antistoff kan feste til hver primære antistoff. I dette manuskriptet, ble både epifluorescens mikroskopi og konfokal mikroskopi brukes for å overvåke internalisering av human lactoferrin, en viktig komponent i immunsystem, i levercellene. Videre overvåket vi hemmende potensialet av HLF på intracellulær replikasjon av hepatitt C-virus ved hjelp av immunfluorescens. Både fordeler og ulemper forbundet med disse metodene er diskutert.

Protocol

1. Cellene Forberedelse og behandling

1. I en 24-brønners plate, sette et glassdeksel på bunnen av brønnene. Vask hver brønn med fosfatbufret saltvann (PBS).
2. Seed Huh-7-celler som støtter HCV subgenomiske replikon i hver brønn til en tetthet på 5 x 10 ⁴ celler / brønn. Hvis det ikke er noen behandling for å gjøre, kan cellene sådd ut ved en høyere densitet. Dyrkningsmediet er Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 250 mg / ml G-418 (for å opprettholde replikonet).
3. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO _{2. Den neste} dag, behandle cellene med 3 uM av HLF renset fra human melk.

2. Paraformaldehyd / Sukrose preparat (12% PAF og 12% sukrose)

1. Sett 500 ml PBS i et beger og oppvarme det mellom 20 ° C og 30 ° C. Oppløs 60 g sukrose i PBS. Løs opp 60 g paraformaldehyde (PAF) i PBS / sukrose-løsning. Tilsett langsomt 2 N NaOH (3 til 7 ml) inntil en klar oppløsning er oppnådd.
2. Juster pH til 7,4 med HCl. Fullstendig volum til 500 ml med PBS. Filter av tyngdekraften på Whatman filter. Før anvendelse fortynnes løsningen med PBS til en sluttkonsentrasjon på 4% PAF og 4% sukrose (Storage 4 ° C i en uke maksimum).

3. Immunofluorescence

1. Ved ønsket tidspunkt (0 hr, 2 timers eller 24 timers behandling), vaskes cellene to ganger (1 min) med PBS og fest med PBS / 4% PAF / 4% sukrose i 20 minutter ved RT. Cellene er vanligvis ved 30-40% konfluens og 1.5X10 ⁵ celler brukes.
2. Permeabilisere cellene med 0,15% triton X-100 i PBS i 5 min ved RT og blokken i 10% normalt geiteserum (NGS) i PBS i 20 min.
3. Fortynn det primære antistoff av proteinet av interesse i 10% NGS (eksempel: primær mus anti-HLF-antistoff fortynnet 1: 1000). Gjelder det primære antistoff til cellene.
4. Etter 4 timer ved romtemperatur eller O /N ved 4 ° C, vask cellene tre ganger i 5 minutter med 10% NGS. Flekk cellene med sekundært antistoff merket med fluorokrom fortynnet i 10% NGS (eksempel: fluorokrom med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm bundet til et antistoff anti-muse-1: 1000) i 1 time ved romtemperatur i mørket.
5. Vask cellene en gang i 5 minutter med PBS og flekke cellene med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (1 pg / ml) i 15 min ved romtemperatur i mørke.
6. Vask cellene to ganger i 5 min med PBS. Mount dekke briller på SlowFade monteringsmedium før visualisering gjennom mikroskopi. Cellene er nå klar for analyse av epifluorescens eller konfokal mikroskopi.
7. Bruk ulike kontroller for å sikre spesifisiteten av gjenkjenning. For eksempel kan alle antistoffer utelates for å detektere autofluorescens. Det primære antistoff kan utelates for å bestemme ikke-spesifikk farging av det sekundære antistoff. Til slutt, hvis mulig, å kontrollere celler eller vev som ikkeuttrykker molekylet av interesse kan også bli brukt.
8. Visual prøvene ved hjelp av passende fluorescens mikroskop (epifluorescens eller konfokal) og filtersett som passer for fluorescerende etikett brukt. Lysbilder kan også lagres i et lysbilde boks ved <-20 ° C for senere undersøkelse.

4. Fluorescensmikroskopi

1. Hold prøvene i mørket for å unngå fotobleking. Slå på lyskilden av den valgte mikroskop (epifluorescens eller konfokal).
2. Slå på mikroskopet. Slå på kameraet for mikroskopet. Sett lysbildet på mikroskopet for visualisering. Legg nedsenking olje på lysbildet for å øke den numeriske blenderåpning på objektivet.
3. Velg riktige filtre. Juster fokus og riktig mål. Juster skodder for å detektere riktig fluorokrom men hindre fotobleking. Hold indirekte lys av for å minimere bakgrunn lys når man ser på prøven.
4. Endre the filtre for å visualisere forskjellige fluorokromer (f.eks DAPI og for en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm). Ta bilder med kameraet.

Representative Results

Muligheten av hepatisk Huh-7 cellelinje for å internal eksogent tilførte HLF ble overvåket ved hjelp av immunfluorescens på en konfokal miscroscope. HLF ble tilsatt til kulturmediet, og internalisering ble tillatt i 24 timer, hvoretter, ble ekstracellulær HLF vasket med PBS og restmembranbundet HLF ble degradert med en 5 min trypsinbehandling (1 ml). Celler ble sådd på nytt og tillates å gjenholde i 18 timer før immunfluorescens farging. For å skissere de cytoplasmiske grenser, ble cellene farget med membranene hvetekim agglutinin (WGA) fluorokrom av en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm konjugat. Den HLF farging ble oppnådd ved å bruke et anti-HLF primært antistoff og et fluorokrom med en bølgelengde på 633 nm bundet til det sekundære antistoff. For å bestemme den nøyaktige lokalisering av HLF ble celler fotografert følgende sekvensielle 0,5 mikrometer horisontalt tverrsnitt av konfokal mikroskopi. Figur 4 viser en deltaical tverrsnitt svarende til midten av celletykkelsen. Etter tilsetning av eksogen HLF, ble en betydelig mengde av HLF påvises inne i cytoplasmaet av hepatocytter. Ingen HLF ble observert inne i ubehandlede celler ved bruk av identiske instrumentale innstillinger. Sammen bekrefte disse data som hepatocytter har kapasitet til å erverve HLF fra sin ekstracellulære miljøet.

Muligheten av HLF til å inhibere intracellulær replikasjon av HCV ble overvåket ved hjelp av epifluorescens ved mikroskopi. Huh-7 celler som støtter HCV subgenomiske replikonsystemet (uttrykker HCV NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B proteiner) replikering ble behandlet med 3 mikrometer HLF for 0, 2 eller 24 timer. Den doble immunfluorescens-fargingen for HLF og HCV NS5A-proteiner ble analysert ved hjelp av epifluorescens mikroskopi. Disse resultatene tyder på at HCV-replikon subgenomiske farging (som målt ved immunofluorescens av HCV ikke-strukturelt protein 5A) ble redusert i celler behandlet med HLF. Figur 5 trong> avslører en kvalitativ reduksjon på ca 50% i HCV fargeintensitet etter 24 timer av HLF behandling. Dette er en interessant observasjon som dette subgenomiske replikonsystemet mangler HCV E1 og E2 konvolutt glykoproteiner, som er de allment aksepterte farmakologiske mål av HLF. Samtidig med falming av HCV farging, begynte HLF opphopning å bli oppdaget etter 2 timer, og sterk HLF akkumulering ble observert etter 24 timer.

Figur 1. Prinsippet om epifluorescence mikroskopi. I denne type mikroskopi, eksitasjon filtre velge bestemt bølgelengde som kan skape begeistring prøven (Tissus eller celler som fluorescerende merkede antistoffer). Videre er emisjonsfiltre valgt for å passe de spektrale emisjons egenskapene av fluoroforen som brukes til å merke prøven.belastning / 53053 / 53053fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Prinsipp for Konfokalmikroskopi. Denne type mikroskopi anvender en utslipps pinhole å eliminere ut-av-fokus lyssignalet. Siden bare lys produsert av fluorescens svært nær fokusplanet kan oppdages, er den optiske oppløsningen i bildet mye bedre enn for epifluorescens mikroskoper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Skjematisk av den indirekte og direkte immunfluorescens. Direkte immunfluorescens innebærerbare en type antistoff som er merket med et fluorokrom som er spesifikk for molekylet av interesse (primært antistoff). I motsetning til dette involverer indirekte immunfluorescens sekundære antistoffer merket med fluorokromer som er spesifikke for de arter av umerket primære antistoff. Mer enn en sekundær antistoff kan feste til hver primær antistoff som øker fluorescenssignal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. hepatocellulært opptak av eksogene HLF. Huh-7 celler ble behandlet med 0 eller 3 uM uM HLF i 24 timer, vasket to ganger, underkastet en 5 min trypsinbehandling, lov til å følge i 18 timer og utsatt for immunfluorescens. Kjerner ble farget with DAPI (blå kanal), ble plasmamembraner merket med WGA (grønn kanal) og HLF var farget med en anti-HLF antistoff (rød kanal). Bilder ble kjøpt opp av konfokalmikroskopi på en original forstørrelse på 60x. De horisontale optiske tverrsnitt representerer midten av tykkelsen av cellene. Scale bar, 10 mikrometer. Modifisert fra (11). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. HLF behandling reduserer HCV farging. Huh-7 celler som støtter HCV subgenomiske replikon replikasjon ble behandlet med 3 uM HLF for 0, 2, eller 24 timer og underkastet immunfluorescens. Kjerner ble farget med DAPI (blå kanal), ble HCV avslørt av en anti-NS5A antistoff (rød kanal) og HLF var farget med en anti-HLF enntibody (grønn kanal). Bilder ble kjøpt opp av epifluorescence mikroskopi på en original forstørrelse på 60x. Scale bar, 10 mikrometer. Modifisert fra (11). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

HCV-epidemien fortsatt en global trussel, med 80% av nysmittede pasienter som utvikler en kronisk infeksjon, sette dem i fare for skrumplever, leversvikt eller leverkreft. Direktevirkende antivirale midler rettet mot HCV replikering og modning representerer prime anti-HCV midler, som nylig demonstrert av regulatorisk godkjenning av to NS3 N-terminale proteasehemmere (Boceprevir og telaprevir). Den HLF anti-HCV aktivitet er i dag antas å oppføre seg som en viral oppføring inhibitor, innbinding sirkulerende viruspartikler og hindre dem fra å komme inn i deres lever målet. Vår forskning på HLF presenterer en roman intracellulær anti-HCV virkningsmekanisme (forskjellig fra ekstracellulære virus nøytralisering) ^7.

Immunfluorescens kan effektivt benyttes for å visualisere fordelingen og / eller lokalisering av et mål-molekyl i en biologisk prøve. Som finnes i mange andre fluorescens-teknikker, er en av de viktigste proproblemer forbundet med immunfluorescens er fotobleking (fotokjemisk ødeleggelse av fluorokrom) ^8. Dette tap av aktivitet skyldes fotobleking kan omgås ved å anvende enten en mer robust fluorokromer som er mindre utsatt for fotobleking, eller ved å redusere intensiteten eller tidsspenn for lyseksponering. Dessuten, siden antistoffer ikke kan krysse cellemembranen, immunfluorescens er generelt begrenset til fikserte celler. Alternative fremgangsmåter for å overvåke fordelingen / lokalisering av proteiner i levende celler er derfor generelt stole på ekspresjonen av proteiner inneholdende fluorescerende proteindomener som for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP) ^9. Imidlertid er tilsetningen av slike GFP epitoper noen ganger forbundet med en modifikasjon i lokalisering og aktivitet av proteiner. Immunfluorescens kan også brukes på en rekke forskjellige prøver, inkludert vevssnitt, dyrkede cellelinjer, eller individuelle celler det er også ofte brukt for å overvåkelokalisering / fordeling av proteiner, glykaner og små molekyler. De viktigste fordelene med denne teknikken ligge i sin enkelhet og det faktum at den kan anvendes i kombinasjon med andre, ikke-antistoffmetoder fluorescerende flekker (f.eks DNA-farging). Videre kommersielt produsert sekundære antistoffer er relativt billig og tilgjengelig i et stort utvalg av farger.

I denne studien, immunfluorescens for leverceller som støtter en HCV subgenomiske replikon avdekket en kvalitativ reduksjon i HCV fargeintensitet ved behandling med HLF. Dette er en interessant observasjon som dette subgenomiske replikonsystemet mangler HCV E1 og E2 konvolutt glykoproteiner, som er de allment aksepterte farmakologiske mål av HLF. I motsetning til den ekstracellulære virusnøytraliser aktivitet, ville HLF trenger å bli internalisert av HCV-infiserte hepatocytter for å svekke viral replikasjon. Bruken av fuorescence mikros tillatt oss å evaluspiste denne muligheten. Ved pre-inkubasjon på HCV-smittet hepatocytter ble eksogene HLF vellykket internalisert, og vist til svekke intracellulær virusreplikasjon. Forståelsen av denne romanen HLF antiviral aktivitet utgjør et skritt videre i forståelsen av det globale (og sannsynligvis pleiotropisk) mekanisme hemming av dette medfødt immunitet protein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000