Diseño personalizado basado en láser máquinas de calentamiento para lanzamiento disparada de cisplatino de termosensible liposomas con Resonancia Magnética Orientación Imagen

Resumen

Un aparato de calentamiento basado en láser de diseño personalizado compatible con MRI ha sido desarrollado para proporcionar calentamiento local de tumores subcutáneos con el fin de activar la liberación de agentes a partir de liposomas termosensibles específicamente a la región del tumor.

Resumen

Los liposomas se han empleado como sistemas de administración de fármacos para atacar tumores sólidos a través de la explotación de la permeabilidad mejorada y retención (EPR) efecto resultante en reducciones significativas en la toxicidad sistémica. Sin embargo, la liberación insuficiente del fármaco encapsulado de liposomas ha limitado su eficacia clínica. Liposomas sensibles a la temperatura han sido diseñados para proporcionar una liberación específica de sitio de la droga con el fin de superar el problema de la biodisponibilidad del fármaco tumor limitado. Nuestro laboratorio ha diseñado y desarrollado una formulación activado por calor termosensible de liposomas de cisplatino (CDDP), conocido como HTLC, para proporcionar la liberación desencadenada de CDDP en tumores sólidos. Suministro de calor activado in vivo se logró en modelos murinos utilizando un aparato de calefacción basado en láser hecha a la medida que proporciona un patrón de calentamiento conformal en el sitio del tumor según lo confirmado por MR termometría (MRT). Un dispositivo de monitorización de la temperatura de fibra óptica se utilizó para medir la temperatura en tiempo realdurante todo el periodo de calentamiento con ajuste de línea de suministro de calor por la alternancia de la potencia del láser. El suministro de fármacos se optimizó con resonancia magnética (MR) de guiado por imagen por la co-encapsulación de un agente de contraste MR (es decir, gadoteridol) junto con CDDP en los liposomas termosensibles como un medio para validar el protocolo de calentamiento y para evaluar la acumulación de tumor. El protocolo de calentamiento consistió en un período de precalentamiento de 5 min antes de la administración de HTLC y 20 min de calentamiento post-inyección. Este protocolo de calentamiento resultó en la liberación efectiva de los agentes encapsulados con el cambio más alto de la señal MR observado en el tumor se calienta en comparación con el tumor sin calefacción y el músculo. Este estudio demostró la aplicación exitosa del aparato de calentamiento basado en láser para el desarrollo preclínico liposoma termosensible y la importancia de la validación guiada por RM del protocolo de calentamiento para la optimización de la administración de fármacos.

Introducción

La fisiopatología de los tumores sólidos resultados en la permeabilidad mejorada y retención (EPR) de los sistemas de nanoescala. Esto ha llevado al desarrollo de muchos sistemas de administración de fármacos que se aprovechan de este efecto para apuntar el tejido tumoral, mientras que se minimizan los efectos secundarios sistémicos ^1. Tecnologías de entrega liposomal han sido ampliamente investigados por sondas de drogas o de imagen ^2. Aunque los liposomas han reducido significativamente la toxicidad sistémica en comparación con la quimioterapia convencional, ha habido pocas mejoras en ^3,4 eficacia clínica. Los estudios han demostrado que la eficacia es limitada debido a la falta de liberación del fármaco desde el soporte de ^4,5. Como resultado, el desarrollo de liposomas que se activan para liberar el fármaco encapsulado en respuesta a estímulos externos ha atraído una atención considerable. La hipertermia se ha empleado durante décadas como una modalidad de tratamiento relativamente seguro para los pacientes de cáncer ^6. Por tanto, el desarrollo deción de liposomas termosensibles con el calor como un disparador externo ha sido una combinación lógica con un potencial significativo para la traducción clínica. De hecho, la formulación que contiene lisolípido-liposoma termosensible de la doxorrubicina, conocido como LTSL-DOX, ha llegado ahora a la evaluación clínica ^7.

Datos clínicos recientes con LTSL-DOX ha demostrado que el protocolo para la entrega de calor es un factor crítico que puede influir fuertemente en los resultados del paciente ^8. En los seres humanos, los transductores de radiofrecuencia, microondas, láser y ultrasonido se utilizan para aplicar la hipertermia local en los sitios tumorales ^9. En los estudios preclínicos que requieren calentamiento de tumores subcutáneos, catéteres calefacción ^10,11 y baños de agua ^12,13 más a menudo se emplean. En este manuscrito, presentamos un nuevo método para calentar tumores subcutáneos utilizando una configuración de calefacción basado en láser diseñado a medida, lo que permite un calentamiento más de conformación del volumen tumoral. Usando ma compatible MRteriales, la configuración es lo suficientemente pequeño como para caber dentro de la perforación de un pequeño generador de imágenes MR animal, lo que permite la monitorización en tiempo real de los cambios en la temperatura del tejido durante el calentamiento de láser.

El agente de contraste MR, gadoteridol (Gd-HP-DO3A), fue co-encapsulado con CDDP en una formulación de liposoma termosensible de CDDP (HTLC), conocido como D-os-HTLC, en tiempo real el seguimiento y evaluación de calor guiado por imagen de RM activado por la liberación del fármaco y la validación del protocolo de calentamiento. Nuestros resultados demuestran que el aparato de calentamiento basado en láser de manera eficiente activa la liberación de los agentes encapsulados de la formulación de Gd-HTLC mientras se supervisa a través de la RM.

Protocolo

1. Preparación de liposomas

1. Disolver los lípidos de 1,2-sn -glicero Dipalmitoyl--3-fosfocolina (DPPC), 1-estearoil-2-hidroxi-sn-glicero-3 fosfatidilcolina (MSPC o S-liso-PC) y N - (carbonilo metoxipolietilenglicol 2000) -1,2-sn -glicero distearoyl--3-fosfoetanolamina (mPEG ₂₀₀₀ DSPE) en cloroformo. Por ejemplo, para la preparación de 10 ml de HTLC, pesar 314,4 mg de DPPC, 39,4 mg MSPC, y 83,9 mg mPEG _2.000 DSPE en un vial de vidrio ámbar. A continuación, se disuelven los lípidos en 2 ml de cloroformo y calentar el vial durante 30 segundos en un baño de agua 60 ° C.
2. Eliminar el cloroformo utilizando un evaporador rotatorio. Coloque la película lipídica resultante bajo alta presión de vacío O / N.
3. Para 10 ml de HTLC, hidratar la película lipídica con 5 ml 0,1 N tampón Tris (pH 7.4) durante 1 h. Al mismo tiempo, pesar 162,4 mg de 1,2-sn -glicero dipalmitoyl--3-fosfoglicerol (DPPG) de lípidos y 100 mg de polvo de hidrato de CDDP y wITH 5 ml 0,1 N tampón Tris que contiene 30% de etanol (pH 7,4) durante 1 hora.
4. Para la formulación de Gd-HTLC, pesar la misma cantidad de DPPG lípidos y 10 mg polvo CDDP, y luego hidratar con una solución de 2,5 ml de D-os-HP-DO3A (279,3 mg / ml) más 2,5 ml 0,1 N tampón Tris que contiene 30% de etanol ( pH 7,4) durante 1 hr. Durante la hidratación, las mezclas se deben mantener en viales de color ámbar y se colocan en una placa caliente a 70 ° C con agitación constante y vórtex cada 10 min.
5. Combinar la mezcla de lípidos y la mezcla de lípidos de drogas, y de nuevo hidratar durante 1 hr. Vortex cada 15-20 min.
6. Montar la extrusora de 10 ml con dos pilas de 200 filtros de policarbonato nm. Conectar el thermobarrel de la extrusora a un baño de agua circulante a 70 ° C, y conectar el extrusor a un tanque de nitrógeno comprimido.
7. Inmediatamente después de la hidratación, la transferencia de la mezcla en la cámara de extrusor. Abra el flujo de nitrógeno (ajustar la presión a 200 psi) para extruir los liposomas a través de las membranas. Recoger el LiposomES en un tubo de 50 ml. Mantenga el tubo en un baño de agua caliente (70 ° C) en todo momento durante el proceso de extrusión. Repita este proceso 5 veces.
8. Desmontar la extrusora y el cambio a dos pilas de 100 filtros de policarbonato nm. Volver a montar la extrusora y ajustar la presión de 400 psi. Repita el paso 5, excepto la extrusión de los liposomas 10 veces. Recoger la muestra de la extrusión final en un tubo de 15 ml.
9. Enfriar los liposomas a RT, y centrifugar a 1000 xg durante 3 min para precipitar CDDP insoluble.
10. Se dializa los liposomas O / N contra 0,9% de solución salina en un tubo de diálisis con un corte de peso molecular 15.000 (MWCO) en condiciones estériles.
11. Diluir 10 l de los liposomas en 990 l de agua destilada. Utilice dispersión dinámica de luz para medir la distribución del tamaño de HTLC y Gd-HTLC. Realizar 3 mediciones con 10 carreras cada uno.
12. Diluir 40 l de los liposomas en 3.960 l de agua destilada. Hacer 5-6 soluciones estándar de platino y gadolinioen el intervalo de concentración de 0,1 a 20 mg / ml. Medir las concentraciones de platino y gadolinio usando acoplado inductivamente espectrómetro de emisión atómica de plasma (ICP-AES) en 3 longitudes de onda diferentes. Realizar 3 mediciones en cada longitud de onda para el resultado de la media.
13. Determinar el gel a la temperatura del líquido fase cristalina de transición (T _m) de la formulación de liposomas HTLC usando un calorímetro de barrido diferencial (DSC). Cargar 5-10 mg de HTLC en una bandeja de DSC y el uso de una bandeja vacía como referencia. Utilice una velocidad de barrido de 5 ° C / min hasta la rampa encima de la temperatura de 0 ° C a 60 ° C.
14. Envuelva los liposomas en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz y se almacena a 4 ° C.

2. La liberación in vitro a partir de liposomas

1. Preparar columnas de centrifugación.
   1. Incubar 50 g de perlas de filtración en gel en 400 ml 0,9% de solución salina a temperatura ambiente durante 3-4 h. Enrolle un pedazo de lana de vidrio, mojado con 0,9% de solución salina y colóquelo en la punta de una jeringa de 1 ml. Pulse la lana de vidrio para llenar aproximadamente 0,05 hasta 0,1 ml de la jeringa. Usar una pipeta de vidrio para añadir gradualmente alrededor de 1 ml de medio de filtración en gel en la jeringa.
   2. Coloque la jeringa en un tubo de 15 ml y centrifugar a 1000 xg durante 3 min. Retire la columna de centrifugación y colocarlo en un tubo de 15 ml.
2. Muestra de 400 l de HTLC o Gd-HTLC en 8 viales de vidrio de 1 dram e incubar en un baño de agua a temperatura controlada, ya sea en 37 ° C o 42 ° C. Extraer un vial en cada punto de tiempo (es decir, 5, 15, 30 y 60 min) e inmediatamente colocar en hielo.
3. Añadir 100 l de 0,9% de solución salina en la columna de centrifugación preparado, a continuación, añadir 100 l de HTLC o Gd-HTLC antes de la incubación (control) o después de la incubación en el baño de agua en la columna de centrifugación. Centrifugar a 1000 xg durante 3 min. Retire la jeringa del tubo y diluir la solución en el tubo para el análisis de ICP-AES.

3. Implantación de xenoinjerto subcutáneo del cuello uterinoTumor

1. Se realizaron todos los estudios con animales de acuerdo a los protocolos de uso de animales aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Red de Salud de la Universidad (UHN).
2. Realizar todos los estudios de animales en un gabinete de bioseguridad (BSC). Autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de cualquier cirugía. Después de cada operación, limpie las herramientas quirúrgicas con etanol al 70% y esterilizar de nuevo utilizando un esterilizador de cuentas caliente.
3. Para la eutanasia, colocar al animal en una cámara aislada de CO _2, a continuación, realizar la dislocación cervical.
4. Para la anestesia general utilizando 100% de oxígeno, utilizar 5% isofluorano para la inducción y el 2% para el mantenimiento. Para asegurar la profundidad de la anestesia, aplique presión con pinzas a la superficie palmar de la almohadilla plantar de observar la respuesta animal. Aplicar lubricante ocular para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
5. Para un animal que ha sido sometido a cirugía, coloque el animal en una jaula limpia sin la compañía de otros animales. Monitorear hasta que se recuperó el conocimiento suficiente.
6. Culturalas células ME-180 en medio esencial mínimo alfa (α-MEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y antibióticos.
7. Recoger las células y mantener las células en medio completo antes de la inoculación. Contar las células utilizando un hemocitómetro.
8. Inocular cada ratón donante que soportar una inyección intramuscular (im) ME-180 (células de cáncer cervical humano) tumor.
   Nota: El crecimiento en el sitio de im ha sido seleccionado con el fin de asegurar el desarrollo de tumores bien vascularizados. Compra ratones SCID hembra (edades 6-8 semanas, aproximadamente 20 g) de una instalación de cría en el local.
   1. Anestesiar un ratón SCID hembra e inyectar 1 x 10 ⁶ células ME-180 en el músculo gastrocnemio de la extremidad posterior usando una aguja de 27 G.
   2. Medir el tamaño del tumor usando un calibrador hasta que los tumores han alcanzado 9 hasta 12 mm en su dimensión más larga. Terminar el estudio si el tumor ha superado 12 mm, o si la masa tumoral compromete comportamiento, ambulación, alimentos y agua ingesta normal.
9. Piezas de tumor de implantes de ratones donantes en los ratones receptores.
   1. Anestesiar un ratón donante utilizando 5% isofluorano. La eutanasia el ratón por dislocación cervical bajo anestesia. Retire el tumor donante del ratón donante. Cortar el tumor en fragmentos cúbicos de 2-3 mm ^3.
   2. Anestesiar el ratón receptor utilizando 5% isofluorano. Inyectar 100 l de 0,5 mg / ml de meloxicam por vía subcutánea antes de la cirugía. Aplique una solución de yodo quirúrgica matorrales, luego etanol al 70%, y la solución de yodo, por último, a la piel afeitada. Afeitarse la extremidad posterior izquierda del ratón receptor. Hacer una incisión a nivel de la piel. Inserte un donante pieza tumoral por vía subcutánea a través de la incisión. Cierre la incisión utilizando 1-2 pinza (s) herida.
   3. Retire los clips de 3-5 días después de la implantación. Se requiere tumor subcutáneo para el uso de la configuración de calefacción basado en láser.
   4. Permitir que los tumores crezcan durante 2-3 semanas antes del tratamiento de calentamiento.

4. Diseño, AssemCalibración blea y de un Conformal Laser Entrega iluminador En Vivo Calefacción

1. Lograr el calentamiento del tejido usando un láser de diodo de 763 nm acoplado a un iluminador conformal utilizando una fibra óptica.
   1. El iluminador proporciona uniforme iluminación láser superficial del tumor de xenotrasplante. Se compone de un mm bloque de material altamente reflectante que contiene tres luz contiguo integración de esferas de cámara con una cámara en el medio (16 mm de diámetro) y 2 pequeñas cámaras a cada lado (16 mm de longitud y 5 mm 30 x 20 x 17 de diámetro) (Figura 1).
   2. A fin de que la luz pase desde una cámara a la otra, dos agujeros de pequeño diámetro 5 mm se cortaron entre las pequeñas cámaras exteriores y la cámara central más grande. Light se entrega desde el láser en las cámaras exteriores utilizando una fibra de corte de extremo 400 micras conectado al láser que se pasa a la cámara a través de un agujero 600 m de diámetro.
   3. Debido a la naturaleza de la luz interaction con las paredes de la cámara, luz entregado en una de las pequeñas cámaras es espacialmente homogeneizada a continuación, pasa a través de los puertos interiores en la cámara más grande donde es más espacialmente homogeneizada. Light entonces sale del puerto de diámetro 10 mm en la cámara intermedia.
2. Calibrar el suministro de luz iluminador con respecto al ajuste de la potencia del láser utilizando un NIST calibrado 50 mm esfera de integración para medir la potencia suministrada.
   1. Calcular la distribución de la luz en el tumor utilizando simulaciones de Monte Carlo en base a una geometría simplificada del tumor. Generar el código de Monte Carlo en un algoritmo personalizado escrito con un paquete comercial de software computacional y la base en el código estándar de Monte Carlo modelación de transporte de la luz en los tejidos de múltiples capas de Jacques et al. ^14.
   2. Modelar el tumor como un hemisferio acostado en una línea de la piel plana con un diámetro que coincida con el tumor dimensión media de 7 mm en la superficie de la piel y un élvuelo de 5 mm. Iluminación homogénea Modelo de la superficie con el lanzamiento al azar fotones en todo el hemisferio expuesto y directa en el centro de la esfera.
   3. Utilice las propiedades ópticas incluyendo la absorción, mu _una dispersión = 0.025 mm ^-1,, μ _{s =} 10 mm ^-1, el factor de anisotropía, g = 0,9 y el índice de refracción, n = 1,4. Utilice un millón de fotones en el cálculo.
   4. Realizar estas medidas antes de cualquier experimentos de calentamiento in vivo sin modificaciones adicionales después de la calibración inicial.

5. Conforme Calefacción del tumor usando diseñada personalizada Configuración Cámara Láser

1. Conectar un extremo de una fibra de láser para el dispositivo láser y el otro extremo a la iluminador.
2. Anestesiar el animal usando 5% isofluorano. Inserte un G catéter de inyección 27 en la vena lateral de la cola del ratón. Insertar un catéter de 22 G en el centro del tumor. Coloque una temperatura pr fibra ópticaobe en el catéter hueco para monitorear los cambios de temperatura.
3. Cubrir todo el tumor con el iluminador (Figura 2). En primer lugar establecer el poder de 0,8-1 W. Encienda el láser y esperar a que la temperatura aumente. Mantener la temperatura del tumor a 42 ° C ajustando manualmente la potencia del láser entre 0,1 a 0,8 W.

6. Temperatura Distribución evaluada a través de la RM termometría (MRT)

1. Medir la distribución de la temperatura del tumor se calienta utilizando la configuración de calentamiento a base de láser a través de cambio de frecuencia de resonancia de protones (PRF-shift) MRT en un sistema de formación de imágenes MR preclínica 7 Tesla ¹⁵ en conjunción con las mediciones de la sonda de temperatura de fibra óptica.
2. Adquirir imágenes de termometría a intervalos de 10 seg utilizando una secuencia de pulsos 2D-FLASH (tiempo de eco 4,5 mseg; tiempo de repetición 156,25 mseg) con 312 x 312 micras en el plano de resolución y 2 mm grosor de corte en una sola rebanada en el nivel de la fibra óptica pro temperaturaser.

7. MR Monitoreo de Agente de lanzamiento

1. Realizar _T1-ponderada de imágenes antes y 20 minutos después de la administración de Gd-HTLC.
2. Implante dos tumores, uno en cada una de las extremidades traseras, de un ratón SCID hembra utilizando el método descrito anteriormente en la Sección 3 para la implantación. Precalentar el tumor en la extremidad posterior izquierda durante 5 min a 42 ° C antes de la inyección de Gd-HTLC a una dosis de 66,3 mg / kg Gd-HP-DO3A y 1,4 mg / kg de CDDP, a continuación, calentar el tumor para un adicional de 20 min después de la inyección. Realizar la inyección durante el tratamiento de calentamiento. Utilice el tumor en la extremidad posterior derecha como un control sin calefacción.
3. Adquirir imágenes dinámicas MR (36 x 20 mm campo de visión, 200 x 200 micras en el plano de resolución, grosor de corte 2 mm; MR protocolo de secuencia) para supervisar la liberación Gd-HP-DO3A a intervalos de 12 seg para toda la 20 min después de la administración de Gd-HTLC, comenzando 30 segundos antes de la inyección.
4. El contorno del tumor (con calefacción y sin calefacción) y los volúmenes musculares.Calcular la media de la señal MR de todos los voxels dentro de cada volumen contorneada.

Resultados

Los liposomas HTLC se fabrican utilizando métodos comunes, incluyendo la formación de película de lípidos, la hidratación, la extrusión y la diálisis. Durante los pasos que implican CDDP, se debe tener cuidado de no exponer CDDP a cualquier material de aluminio, como CDDP se desactiva a través de la formación de un depósito negro. Una ilustración de HTLC se muestra en la Figura 3. Las propiedades físico-químicas de HTLC se resumieron en un manuscrito publicado recientemente en ...

Discusión

Los liposomas se desarrollaron por primera vez en la década de 1960 como vehículos de administración de fármacos que transportan fármacos hidrófilos en su volumen acuoso interno y fármacos hidrofóbicos en su bicapa lipídica ^2. Además de utilizar en aplicaciones terapéuticas, los liposomas han sido exploradas para aplicaciones de diagnóstico cuando están marcados con radionucleidos o cargado con agentes de contraste de formación de imágenes ^17. En los últimos años, teranóstica y pares-terapéuticos d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Evaporador rotativo	Heidolph Instruments GmbH & Co.KG	Laborota 4000
Extrusora de alta presión	Northern Lipids Inc.	T.001	Termobarril de 10 ml
Termotermostato	VWR International LLC.	11305	Conectado a la extrusora
Filtro de membrana de policarbonato	Whatman 110605	;
Calorímetro diferencial de barrido (DSC)	TA Instruments	Q100
Espectrómetro de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES)	PerkinElmer	Optima 7300DV
Zetasizer	Malvern Instruments Ltd.	Incubadora de células Nano-ZS
	NuAire Inc.	NU-5800
Aplicador de pinzas para heridas Autoclip	Becton Dickinson	427630
Removedor de pinzas para heridas	Autoclip Becton Dickinson	427637
Pinzas para heridas	Becton Dickinson	427631	9 mm
763 nm Dispositivo láser	Biolitec	Ceralas CD 403 láser
Sonda láser	Thorlabs Inc.	FT400EMT	Con conectores SMA y de hendidura plana
Spectralon (iluminador)	Labsphere Inc.	FAST-SL-5CMX5CM
		CSTM-SL-5CMX5CM
7 Tesla sistema de imágenes de resonancia magnética (RM) prelinal	Bruker Corporation	Biospec 70/30
Sensor de temperatura de fibra óptica	LumaSense Technologies Inc.	Luxtron FOT Lab Kit
Esfera integradora	Newport Corporation	819C
Medidor de potencia óptica	Newport Corporation	1830-R