Los microelectrodos de dos cañones y concéntricos para la medición de extracelular Ion señales en el tejido cerebral

Resumen

Demostramos la fabricación, calibración y propiedades de dos tipos de microelectrodos selectivos de iones (de doble cañón y concéntricos) para la medición de concentraciones de iones en el tejido cerebral. A continuación, se utilizan en la preparación del corte del hipocampo del ratón para demostrar que la actividad excitatoria cambia las concentraciones extracelulares de potasio y sodio.

Resumen

La actividad eléctrica en el cerebro va acompañada de importantes flujos iónicos a través de las membranas, lo que resulta en cambios complejos en la concentración extracelular de todos los iones principales. Dado que estos desplazamientos iónicos tienen consecuencias funcionales significativas, a menudo se requiere su determinación cuantitativa para comprender la función y la disfunción de las redes neuronales en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. En el presente estudio, demostramos la fabricación y calibración de microelectrodos selectivos de iones de doble cañón, que han demostrado ser excelentes herramientas para tales mediciones en el tejido cerebral. Además, también se describen los llamados microelectrodos selectivos de iones "concéntricos" que, en función de su diseño diferente, ofrecen una resolución temporal mucho mejor de los cambios iónicos rápidos. A continuación, mostramos cómo estos electrodos pueden emplearse en preparaciones agudas de cortes cerebrales del hipocampo del ratón. Utilizando microelectrodos selectivos de potasio de doble barril, se demuestran cambios en la concentración extracelular de potasio ([K⁺]_o) en respuesta a la aplicación exógena de agonistas del receptor de glutamato o durante la actividad epileptiforme. Además, ilustramos las características de respuesta de los electrodos sensibles al sodio, de doble cañón y concéntricos y comparamos su detección de cambios en la concentración de sodio extracelular ([Na⁺]_o) provocados por el baño o la aplicación a presión de fármacos. Estas mediciones muestran que, si bien las amplitudes de respuesta son similares, los microelectrodos de sodio concéntricos muestran una relación señal-ruido y un tiempo de respuesta superiores en comparación con el diseño de doble cañón. En general, los procedimientos demostrados serán fácilmente transferibles a la medición de otras especies de iones, incluidos el pH o el calcio, y también serán aplicables a otras preparaciones.

Introducción

La señalización eléctrica en el cerebro se basa en el flujo de iones a través de las membranas plasmáticas. Los principales movimientos iónicos hacia y desde el espacio extracelular no solo están mediados por el paso a través de canales iónicos dependientes de voltaje, sino también por receptores ionotrópicos postsinápticos, así como por transportadores de iones. Por lo tanto, la actividad neuronal se acompaña de cambios complejos en la concentración extracelular de todos ^{los iones principales}. Por ejemplo, se ha demostrado que la afluencia de sodio a las neuronas durante la actividad excitatoria resulta en una disminución en la concentración extracelular de sodio ([Na⁺]_o) ². Lo mismo ocurre con la concentración de calcio extracelular, ya que los iones de calcio entran rápidamente en las estructuras presinápticas y postsinápticas ³. Al mismo tiempo, el potasio se mueve en sentido contrario y esto media un aumento en la concentración de potasio extracelular ([K⁺]_o) en el rango bajo de mM ^4,5. La actividad sináptica también causa cambios en el pH extracelular que son parcialmente mitigados por flujos concomitantes de la membrana glial que cambian el pH intraglial ^6,7. Estos cambios relacionados con la actividad en las concentraciones de iones extracelulares tienen consecuencias funcionales significativas. Por ejemplo, incluso pequeños aumentos en [K⁺]_o despolarizan las neuronas, así como las células gliales, alterando así la excitabilidad neuronal, y existen varios mecanismos para eliminar el exceso de potasio ⁸. El fracaso de estos puede resultar en la actividad epileptiforme de las neuronas o fenómenos como la propagación de la depresión ¹.

Debido a su importancia crítica, la determinación cuantitativa de las concentraciones de iones extracelulares es a menudo necesaria y requerida para comprender la función y disfunción de las redes neuronales en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Durante décadas, los microelectrodos selectivos de iones de doble cañón han demostrado ser excelentes herramientas para este tipo de mediciones en el tejido cerebral^. Para muchos iones, se dispone de sensores altamente específicos con baja reactividad cruzada para otros iones. Además de los clásicos electrodos de doble cañón, recientemente se han introducido los llamados electrodos concéntricos. Estos últimos proporcionan una resolución de tiempo superior, pero requieren un poco más de tiempo y esfuerzo para construir ¹⁰.

A continuación, describiremos la preparación y calibración de estos dos tipos de microelectrodos selectivos de iones. A continuación, mostramos cómo estos electrodos pueden emplearse en preparaciones de cortes de cerebro para la medición de cambios en [K⁺]_o o [Na⁺]_o inducidos por la actividad excitatoria siguiendo diferentes paradigmas de estimulación, incluyendo el baño y la aplicación de fármacos a presión.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las directrices institucionales de la Universidad Heinrich Heine de Düsseldorf, Alemania, así como la Directiva de la Comunidad Europea del Consejo (86/609 / CEE). Todos los experimentos fueron comunicados y aprobados por la Oficina de Protección de los Animales en el Centro de Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad Heinrich Heine de Düsseldorf, Alemania (número acto institucional: O52 / 05). De acuerdo con la Ley de Protección de los Animales Alemán (Tierschutzgesetz, los artículos 4 y 7), ninguna aprobación adicional formal para la eliminación post-mortem del tejido cerebral era necesario.

1. Preparación de microelectrodos selectivos de iones de cañón doble

1. Preparar dos capilares de vidrio de borosilicato con filamento: una con una longitud de 7,5 cm y un diámetro exterior de 1,5 mm que se utilizará para el cañón sensible a los iones, y uno con una longitud de 6,5 cm y un diámetro exterior de 1,0 mm para la tarde barril de referencia.
2. Limpie la capil laries en acetona durante 12 horas y luego enjuague varias veces con abs. etanol y dejar secar. Los electrodos se pueden almacenar en un desecador.
3. Utilice pegamento de dos componentes o una pequeña franja de papel de aluminio para fijar una larga y una corta capilar juntos en ambos extremos. Se calienta la doble capilar en un horno a 60 ° C durante 1 hr. Esto acelera el proceso de curado. Guarde los electrodos ahora en un desecador.
4. Centre el doble capilar en un extractor vertical con un plato giratorio. Calentar la bobina suavemente hasta que el vidrio es lo suficientemente suave para permitir una rotación horizontal del plato giratorio en 180 °. Durante este paso, evitar el alargamiento del capilar con un calzo bajo la pinza de sujeción.
5. Después de enfriar, retirar la ruptura mecánica y aplicar un segundo protocolo de calentamiento para sacar el capilar, lo que resulta en dos capilares afilados, de dos cañones (Figura 1). El diámetro de la punta de un doble-capilar debe estar cerca de 1 m.

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Figura 1. Arquitectura de microelectrodos selectivos de iones. (A) Fotografía de un microelectrodo de dos cañones. Para fines de ilustración y una mejor visibilidad, se tiñó el líquido dentro del barril de referencia. (B) Fotografía de un microelectrodo concéntrica y el electrodo de referencia correspondiente. La punta de microelectrodos concéntrica se muestra ampliada en su izquierda. En (A) y (B), el espacio ocupado por el sensor de iones en las puntas de las pipetas es post-coloreado. En la parte inferior, la disposición punta de ambos tipos de electrodos se muestra esquemáticamente. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Si un tirador vertical con mandril giratorio no está disponible, prepare un ion-selec doble cañóntiva microelectrodo en un extractor horizontal usando theta vidrio.
   1. Con este fin, tire theta de vidrio (diámetro exterior de 1,5 mm, longitud 7,5 cm) a dar lugar a dos electrodos con dos barriles cada uno. Marque una de ellas para servir como el futuro del barril de referencia. Silanizado la otra similar al procedimiento descrito a continuación para servir como el futuro barril selectivo de iones.
      NOTA: Si bien la preparación de electrodos de dos cañones theta-vidrio es mucho más fácil que la preparación de electrodos de dos cañones retorcidos, son más propensos a la cruzada de acción entre los dos cañones como la delgada pared de cristal de separación entre ellos tiende a ser poroso todo lo posible punta.
      NOTA: Debido a que el cóctel de sensor (véase más adelante) es hidrófobo, la superficie interior del barril sensible a los iones más tarde debe hacerse hidrófobas, así por un proceso llamado silanización. Para ello, hexametildisilazano (HMDS) se utiliza (Figura 2) como se describe en el siguiente paso.

Figura 2. silanización de las pipetas. (A) hexametildisilazano (HMDS) reacciona con los grupos Si-OH de la superficie de vidrio interior y la hace hidrófobo. (B) La fotografía de la izquierda muestra toda la unidad de silanización. Una botella de boca ancha que contiene HMDS se coloca en la parte superior de una placa de calentamiento fijado en 40 ° C. En la parte superior de la botella, un soporte (PH) que lleva los capilares (PAC) está montado. La fotografía de la derecha muestra una ampliación de la titular de la pipeta (PH) que lleva los capilares (PAC). (C) vista lateral esquemática de los titulares de pipeta medida (PH) para (derecha) capilares de dos cañones (izquierda) o concéntricos (PAC), montado en una botella de boca ancha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Justo antes de la PUelectrodos de llenado, llenan aprox. 20 ml de HMDS en una botella de boca ancha. Atención: HMDS es para uso sólo en una campana de humos, vapores son peligrosos para la salud! Cerrar el frasco y lo puso en una placa de calefacción, prefijado a 40 ° C. Precaliente el horno, se coloca debajo de la capilla, así, hasta 200 ° C.
8. Llene el barril de referencia hasta la punta con agua destilada para evitar su silanización durante el siguiente procedimiento.
9. Ponga capilar de dos cañones con su punta para arriba sobre un soporte especial, hecho a medida (Figura 2B, 2C). El extremo abierto romo debe alcanzar libremente a través de la parte inferior del soporte (Figura 2C, izquierda). Después, colocar este soporte en la botella de boca ancha que contiene los HMDS pre-calentado durante 70 min.
   NOTA: Asegúrese de que el vapor de HMDS puede fluir a través de los capilares libremente. Durante un proceso de silanización, los 20 ml de HMDS no se evaporan completamente, y la botella por lo tanto se pueden utilizar varias veces.
10. Después de la guerrads, la transferencia de los capilares a un soporte de metal y en el horno precalentado durante dos horas. Esto se secará dos cañones.
11. Después de silanización, mantener los capilares seco hasta su uso. Mientras que el primero procedimiento requiere alrededor de 3,5 horas en total, los electrodos se pueden almacenar en un desecador durante varias semanas.
12. En el día de su uso experimental, preparar electrodos selectivos de iones rellenando la punta del barril silanizado con desde 1 hasta 2 l del sensor selectivo de iones (Figura 1A). Para microelectrodos sensibles al potasio, utilice el valinomicina portador; y de microelectrodos sensibles al sodio, utilice ETH 157 como portador.
13. Observe que el sensor selectivo de iones es muy viscoso lo que hace difícil para la punta para llenar correctamente.
14. Llenar el barril de referencia con solución salina tamponada con HEPES (ver más abajo).
    Nota: Si bien otros más sencilla solución salina, iso-osmótica se podría utilizar también, se prefiere usar una solución salina cuya composición es esencialmente similar ala solución salina de perfusión (ACSF, ver 3.6.), ya que puede filtrarse y penetrar en el tejido durante los experimentos. Por lo tanto, también es esencial que esta solución salina no contiene una mayor concentración del ion que se determine que el ACSF utilizado.
15. Rellene el sensor con solución salina que contiene una alta concentración del ion a detectar. Por lo tanto, rellenar el sensor con NaCl 100 mM solución salina (por microelectrodos sensibles al sodio) o KCl 100 mM (para microelectrodos sensibles al potasio). Asegúrese de no introducir burbujas de aire adicionales durante este procedimiento.
16. Si la silanización se ha realizado correctamente y el sensor se llena correctamente, observar la superficie del sensor formar una superficie cóncava claramente visibles contra el relleno (Figura 1A). De lo contrario, el sensor puede haber retracción de la pared capilar y la punta no se llena. Tales electrodos no será funcional.
17. Inserte los cables de plata clorados en los dos cañones (tenga cuidado de no tocar el sensor) y sellar cada barril con cera dental (Figura 1).

2. Preparación de Concentric de ion selectivo microelectrodos

1. Para el cilindro exterior, usar capilares de vidrio de paredes delgadas con filamento (diámetro exterior 2,0 mm) y una longitud de 7,5 cm. Para el barril interno, tomar capilares de paredes delgadas con filamento, un diámetro exterior de 1,2 mm y una longitud de 10 cm.
2. Limpie los capilares en acetona durante 12 horas. y luego enjuague varias veces con abs. etanol y dejar secar. Los electrodos se pueden almacenar en un desecador.
3. Rellene aprox. 20 ml de HMDS en una botella de boca ancha. ¡CUIDADO! HMDS es para uso sólo en una campana de humos, vapores son peligrosos para la salud. Cerrar el frasco y lo puso en una placa de calefacción, prefijado a 40 ° C. Precaliente el horno, se coloca debajo de la capilla, así, hasta 200 ° C.
4. Introduzca el capilar de 2,0 mm en un tirador horizontal y tire de él para dar lugar a los capilares con cirios cortos y una Diame puntater de ~ 4 micras (Figura 1B).
5. Ponga capilar 2,0 mm tirado de salida con su punta para arriba sobre un soporte especial hecho a medida (Figura 2B, Figura 2C), de modo que su extremo romo se abre a la cavidad de la botella (Figura 2C, derecha). Luego colocar este soporte en la botella de boca ancha que contiene los HMDS pre-calentado durante 70 min. Asegúrese de que el vapor de HMDS puede fluir a través de todos los capilares.
6. Después, la transferencia de los capilares a un soporte de metal y en el horno precalentado durante dos horas.
7. Después de silanización, mantener los capilares seco hasta su uso. Mientras que el primero procedimiento requiere alrededor de 3,5 horas en total, ahora almacenar los electrodos en un desecador durante varias semanas.
8. Justo antes de su uso, llenar una pequeña cantidad de sensor (0,2 l) en el capilar silanizado (Figura 1B).
9. Para preparar el capilar interior, inserte un pequeño capilar de diámetro en el extractor y saque para dar como resultado de doscapilares con cirios largos y puntas afiladas (Figura 1B). Rellenar con NaCl 100 mM (microelectrodos sensibles al sodio) o 100 mM KCl (microelectrodos sensibles de potasio) salina.
10. Coloque el sensor lleno y el capilar lleno de solución salina directamente en línea con uno al otro en un tapón de generación personalizada hecha de cubreobjetos. Introduzca el capilar más pequeño es un camino corto en el capilar más grande.
11. Fijar los capilares sobre otra cubreobjetos utilizando plastilina, traslado al escenario de un microscopio y visualizar utilizando magnificación de 100x. Con ayuda de una varilla de vidrio que se monta en un micromanipulador y girando la multa de accionamiento de la platina del microscopio, avanzar lentamente el capilar exterior sobre el capilar interior hasta que la distancia entre sus puntas es aproximadamente 5 micras (Figura 1B).
12. Fije el extremo abierto del capilar exterior sobre el capilar interior con cera dental. Por otra parte, aplicar una pequeña gota de cianoacrilato (Crazy Glue) instead de cera.
    NOTA: La adición de una pequeña gota de agua se polimeriza el pegamento y fijar los electrodos en su lugar. Inserte un alambre de plata clorada en el cilindro interior y sellar con cera dental (Figura 1B).
13. Para preparar el electrodo de referencia, tomar un 7,5 cm de longitud capilar con filamento y un diámetro exterior de 1,5 mm y saque con un extractor vertical. Asegúrese de que los consejos son relativamente largo, pero no demasiado fuerte (punta de diámetro ~ 1 m).
14. Deseche la pipeta superior, abra el plato inferior y levante la pipeta inferior en alrededor de 5 mm. Cierre de nuevo la pinza de sujeción y la levante hasta que la punta del electrodo inferior está posicionado alrededor de 5 mm por encima de la bobina de calentamiento. Calentar la bobina y el uso de fórceps para doblar la punta en alrededor de 45 ° a un lado. Baja pipeta de aproximadamente 1-2 mm. Curva de nuevo por unos -45 ° para dirigir la punta hacia atrás en paralelo al eje principal (Figura 1B). Este procedimiento es necesario para permitir el cierre de posicionamiento de la punta de la refereNCE electrodo al electrodo concéntrico.
15. Llene el barril de referencia con solución salina tamponada con HEPES (ver más abajo), inserte un alambre de plata clorada y sellar el barril con cera dental (Figura 1B).

3. Salines

1. Preparar una solución salina para el relleno de los electrodos sensibles al potasio (véase 1.15.) Compuestas de 100 mM KCl. Saline para el relleno de los electrodos sensibles de sodio está compuesto por NaCl 100 mM.
2. Preparar solución salina para el relleno de barriles de referencia (. Solución salina tamponada con HEPES, véase 1.16) se compone de (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _CaCl2, 2 MgSO _4, 1,25 NaH ₂ PO _4, y 25 HEPES, titulada con NaOH para dar lugar a un pH de 7,4.
3. Prepare la solución salina para la calibración de los electrodos sensibles de potasio se componen de 25 mM HEPES y un total de 150 mM NaCl y KCl, pH ajustado a 7,4 con NMDG-OH (N-metil-D-glucamina). Aquí, la calibración se realizó con salines que contiene 1, 2, 4 o 10 mMKCl; ACSF contenía KCl 2,5 mM (Figura 5).
4. Preparar una solución salina para la calibración de electrodos sensibles al sodio de la siguiente manera; (en mM) 25 HEPES, KCl 3, un total de 160 NaCl y NMDG-Cl, pH ajustado a 7,4 con NMDG-OH. Realice la calibración con solución salina que contiene (en mM) 70, 100, 130 o 160 NaCl; ACSF contenía NaCl 152 (Figura 6).
5. Para la determinación de la reacción cruzada del sensor con otros iones, por ejemplo., PH, preparar salines de calibración adicionales con concentraciones de iones fijos, pero variando el pH.
   NOTA: Si bien este procedimiento no se demuestra en el presente estudio, por favor debe referirse a un trabajo anterior abordar esta cuestión (por ejemplo, ^11,12).
6. Preparar cortes de tejido cerebral aguda en solución salina compuesta de (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl _2, 6 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, y 20 glucosa, burbujeado con 95% O ₂ y 5 % de CO _2, dando como resultado un pH de7.4.
7. Realizar experimentos en rodajas de cerebro en el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) formado por (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl _2, 1 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, y 20 glucosa, burbujeado con 95 % O ₂ y 5% de CO2, dando como resultado un pH de 7,4.
8. Para la estimulación de las neuronas y células gliales, preparar soluciones que contienen glutamato mM 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 o 10 mM de L-aspartato disuelta en ACSF. Para la aplicación de presión, disolver el glutamato 10 mM en solución salina tamponada con HEPES.
9. Preparar pipeta de aplicación para la aplicación de presión. Inserte capilares de vidrio de paredes delgadas con filamento (diámetro exterior de 2,0 mm) y una longitud de 7,5 cm en tirador horizontal y tire para dar lugar a un diámetro de la punta de ~ 1 M.
10. Para la inducción de la actividad epileptiforme, preparar ACSF libre de magnesio que contiene 10 mM bicuculina metyoduro.
11. Para inhibir la generación de potenciales de acción, preparar un 10 mM de stock solution de tetrodotoxina (TTX) en agua destilada. Durante los experimentos, TTX se añade directamente a la ACSF para dar lugar a una concentración final de 0,5 mM.
12. Para evitar la activación de los receptores AMPA, preparar una solución madre 50 mM de ciano-nitroquinoxalina-diona (CNQX) en sulfóxido de dimetilo (DMSO). Durante los experimentos, esto se añade directamente a la ACSF para dar lugar a una concentración final de 100 mM.
13. Para bloquear la activación de los receptores NMDA, preparar una solución madre 50 mM de amino-phosphonopentanoate (APV) en 70 mM _NaHCO3. Durante los experimentos, esto se añade directamente a la ACSF para dar lugar a una concentración final de 100 mM.

4. Calibración de microelectrodos selectivos de iones

1. Calibrar microelectrodo selectivo de iones directamente antes y después de cada experimento.
2. Conecte electrodos para micromanipuladores e insertarlos en una cámara experimental ACSF-perfusión, colocado bajo un microscopio estereoscópico (Figura 3 g>, 4). Coloque el electrodo de referencia en la precámara (Figura 4A, B). Encienda la perfusión de baño, asegúrese de que el flujo es de aproximadamente 2 ml / min.

Figura 3. El espacio de trabajo experimental. El equipo de grabación consta de una mesa con amortiguación de vibraciones que lleva la etapa x /-y traslacional con el baño experimental, los micromanipuladores, y un estereomicroscopio con óptica de alta calidad. El microscopio estéreo también está equipado con una cámara CCD para fines de documentación. Además, se utiliza un dispositivo de aplicación de presión para la aplicación focal de drogas. Los electrodos de registro están acoplados a través de la etapa de la cabeza a un amplificador diferencial. Los datos digitalizados (convertidores A / D) se registra con un ordenador. El baño de perfusión se realiza mediante una bomba de micro peristáltica (no se muestra).> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Encienda el convertidor A / D, el amplificador diferencial, y el ordenador e inicie el software de grabación (Figura 3, 4). Debido a la resistencia de los barriles sensibles a iones es muy alta (10-20 GΩ; ver abajo), use un amplificador de electrómetro especial con alta impedancia de entrada (R = 10 _en TΩ) y una corriente de polarización pequeña _(sesgo I = 50 fA - 1 pA).

Figura 4. electrónica y diseño espacial del montaje experimental. (A) vista esquemática de la disposición de grabación. Las puntas de un microelectrodo de dos cañones (azul) y un microelectrodo concéntrica (rojo) están dispuestas en un baño experimental llena de solución salina. El electrodo de referencia baño se indica esquemáticamente. El poten TIAL detectada por los barriles selectivos de iones (V ₁₎ se compone del campo eléctrico de potencial (V _ref) y el potencial de iones _(ion V), mientras que los barriles de referencia (V ₂₎ solamente detectar V _ref. Para aislar _ion V, V _ref se resta de V ₁ por medio de un amplificador diferencial (DA). (B) Topografía de la etapa experimental con un microelectrodo concéntrica en su lugar. El centro de la etapa experimental consiste en el baño experimental que contiene la preparación rebanada. Para conectar a tierra el baño, el electrodo de referencia de baño está sumergido en la pre-cámara, que también recibe la entrada de la perfusión. La etapa en sí está conectada a tierra mediante un conector de tierra separado. El microelectrodo concéntrica y su electrodo de referencia se llevan los titulares de pipeta distintas impulsadas por micromanipuladores. Microelectrodo y electrodo de referencia están acoplados electrónicamente a la etapa de la cabeza del amplificador.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Conecte los cables de plata clorados a las respectivas entradas de la etapa de la cabeza del amplificador diferencial (Figura 4). Determinar las resistencias de electrodo. Asegúrese de que la resistencia del barril de referencia es de 30-100 entre mO y la resistencia del barril sensible a iones es 10-20 GΩ.
5. Ajuste señales de tensión a cero y empezar a grabar.
6. Tenga en cuenta que el potencial detectado por los barriles selectivos de iones (V ₁₎ está compuesto por el campo eléctrico de potencial (V _ref) y el potencial de iones _(ion V), mientras que los barriles de referencia (V ₂₎ sólo detectan V _ref. Para aislar _ion V, V _ref se resta de V ₁ por medio de un amplificador diferencial (DA) (Figura 4A).
7. Después de obtener una línea de base estable,interruptor para salines de calibración que contienen concentraciones definidas de la ion a medir.
   NOTA: La Figura 5A muestra la calibración de un microelectrodo de dos cañones sensibles al potasio. En la Figura 6A, la calibración tanto de una de dos cañones, así como se muestra un concéntrica microelectrodo -sensible Na ^+. Si bien no se describe el procedimiento de aquí, tenga en cuenta que las posibles interferencias con otros iones deben ser probados antes de usar un ionóforo específico (véase también 3.4.).

Figura 5. Calibración de microelectrodos de dos cañones de potasio selectivo. (A) Cambio en la tensión del barril de referencia (V _ref) y del K ^+: posible (V _{+ K)} en respuesta a cambios en la concentración de K ⁺ baño ( [K ^+] _b) como se indica. (B) Mediaparcela -logarithmic de [K ^+] _b frente V _{K +.} Una gráfica lineal de los datos revela una pendiente de aproximadamente 56 mV. Con fines ilustrativos, las huellas fueron suavizadas con un filtro Sawitzky-Golay (ancho 20). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. Determinar la respuesta de tensión del barril selectiva de iones en respuesta a un cambio conocido en la concentración de iones. Datos de trazado en una sola parcela logarítmica (Figura 5B, 6B) y determinar la pendiente. Un sensor ideal sigue una relación descrita por la ecuación de Nernst (véase, por ejemplo ^13):

V: potencial de electrodo medido;
V _0: potencial de electrodo estándar, por ejemplo, para un AgCl hilos a una temperatura de 298,15 K y una presión parcial de 101,325 kPa (absoluto)
R: constante de los gases (8.314 julios / grado Kelvin / mol)
T: temperatura absoluta (en grados Kelvin)
z: carga del ion (+ 1 para el potasio y el sodio)
F: constante de Faraday (96.500 culombios)
c ': concentración de ion extracelular
c '': concentración de ion intracelular

A efectos prácticos, y el logaritmo natural se convierten a la pendiente Nernst s que es válido para un ion y temperatura dadas:

NOTA: Para electrodos de potasio y sodio, una respuesta ideal del voltaje del sensor por lo tanto presenta una pendiente lineal de aproximadamente -58 mV a RT. Algunos desviación de esto puede ser aceptado (Figura 5B, 6B). Es esencial, sin embargo, que las características de respuesta de un electrodo dado no cambian significativamente (en más de un 10%, ver más abajo) antes y después de un experimento.

Figura 6. Calibración de microelectrodos y la comparación de dos cañones con-electrodos concéntricos (A) Top traza en sodio selectiva:. Cambio en el voltaje de los barriles de referencia (V _ref) de un electrodo de dos cañones (trazo punteado negro) y una electrodo concéntrico (traza gris) en respuesta a los cambios en el baño de Na ⁺ de concentración ([Na ^+] _b) como se indica. Tenga en cuenta que las respuestas de tensión de ambos electrodos son prácticamente idénticos. Trazas inferiores: Los cambios en el voltaje de la Na ^+: posible (V _{Na +)} de un electrodo de dos cañones (trazo negro) y un electrodo concéntrico (traza gris) en respuesta a los cambios en [Na ^+] _b. (B) parcelas de media logarítmica de la [Na ^+] _b frente al V _{Na +} de ambos electrodos. Parcelas lineal de los datos revelan una pendiente de aproximadamente 48 mV para ambos electrodos.(C) Respuesta de la V _{Na +} de un (trazo negro) de dos cañones y un electrodo concéntrico (trazo gris) a un cambio rápido en el [Na ^+] _{b desde} 152 mM a 70 mM. Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo concéntrico es significativamente más rápido. Con fines ilustrativos, las huellas fueron suavizadas con un filtro Sawitzky-Golay (ancho 20). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

9. Determinar el tiempo de respuesta de los electrodos, lo que depende del diámetro de la punta, la forma de la punta, así como en el espesor de la fase de sensor en la punta del electrodo.
   NOTA: microelectrodos sensibles al sodio En este juego experimental y el empleo de un cambio rápido entre diferentes salinas de perfusión (intercambio completados en la punta del electrodo dentro de 500 ms), haga doble cañón llegaron a un potencial estable dentro de 9,7 ± 4,5 s cuandocambiar de 152 mM a 70 mM ^[Na +] (n = 6). Dentro del mismo contexto, microelectrodos de sodio sensibles concéntricos alcanzaron un potencial estable dentro de sólo el 0,8 ± 0,3 seg (n = 6) (Figura 6C). Esto enfatiza la resolución de tiempo superior concéntrica en comparación con microelectrodos de dos cañones.

5. Disección de Tejidos

1. Para la generación de las rebanadas agudas, anestesiar a los ratones del día postnatal 16-20 con CO ₂ y rápidamente decapitado (siguiendo la recomendación de la Comisión Europea publicado en: La eutanasia de animales de experimentación, Luxemburgo: Oficina de Publicaciones Oficiales de las Comunidades Europeas, 1997; ISBN 92-827-9694-9).
2. Preparar cortes de tejido del hipocampo (espesor de 250 micras), siguiendo un procedimiento estándar (véase, por ejemplo ^14).

6. Procedimientos Experimentales

1. Transferir una rebanada en la cámara experimental y fijarlo con uncuadrícula.
2. Bajar el microelectrodo selectiva de iones calibrada sobre la superficie de la rebanada y empalar el stratum radiatum de la región CA1 a una profundidad de aproximadamente 50 micras con el electrodo.
   NOTA: Si toca la superficie de la rebanada con el microelectrodo conduce a fluctuaciones características en el cañón de iones y minúsculas. Además, el daño a las células durante el empalamiento del tejido provoca fluctuaciones también. Espere hasta que la línea de base se ha estabilizado.
3. Para la aplicación de presión de los agonistas del transmisor, llenar una pipeta de aplicación con el compuesto (por ejemplo, glutamato 0,5 mM). Coloque la pipeta a un micromanipulador y par a un dispositivo de aplicación de presión.
4. Baja pipeta de aplicación en el tejido y que lo coloque en la proximidad de la punta del microelectrodo selectivo de iones (~ de 20-40 micras). Inicie la aplicación de presión (por ejemplo, 10 seg, 40 mbar) y cambios de voltaje registro como supervisados ​​por el microelectrodo selectivo de iones.
5. Para la aplicación del baño de las drogas, swpicor entre los diferentes salinas de perfusión para una duración definida.
6. Para terminar el experimento, retirar con cuidado el microelectrodo selectivo de iones del tejido y registrar cualquier desviación en los potenciales del valor original cero que podría haber ocurrido durante períodos prolongados de grabación.
7. Eliminar rebanada preparación del baño y realizar una segunda calibración del microelectrodo selectivo de iones.
   NOTA: Esto es necesario porque la punta del electrodo puede quedar atascado durante su movimiento a través del tejido. Por lo tanto, es esencial para asegurar que el electrodo todavía responde adecuadamente a los cambios en las concentraciones de iones. Los experimentos deben ser rechazadas si la respuesta del electrodo a un cambio de diez veces en la concentración de iones se ha reducido en más de un 10%. Electrodos de pozo-de trabajo pueden, en principio, ser reutilizados en varios experimentos. Esto es especialmente cierto para los electrodos concéntricos, que incluso pueden durar varios días. Es esencial, sin embargo, que los procedimientos de calibración son rerepetido antes y después de cada solo experimento para garantizar el buen funcionamiento de los electrodos.

Análisis 7. Datos

1. Para convertir la respuesta de voltaje del electrodo selectivo de iones a los cambios en la concentración de ion extracelular, primero convertir la ecuación 2 para determinar el cambio en el potencial _{de iones?} V (mV) de la siguiente manera (demostrado aquí por K ⁺ electrodos -sensibles, procedimiento análogo se aplica para ^Na + electrodos -sensibles):

V _{K +:} cambios en el potencial del barril valinomicina (mV)

s: pendiente Nernst

K ^+] _B: concentración basal de potasio (en nuestro caso 2,5 mM K ⁺⁾

K ^+] _o: cambios en la [K _^+] o durante el experimento

2. Calcular la media aritmética de las pendientes derivados de las parcelas individuales o logarítmicasf la calibración antes y después del experimento (véase la Figura 5B, 6B; véase el punto 4.8) para recuperar "s".
3. Para calcular los cambios de la [K ^+] _{o (Δ} [K _^+] o, en mM), reorganizar la ecuación 3 a:

Resultados

Para supervisar [K ^+] _{o y} los cambios en el mismo en respuesta a la actividad excitatoria, un microelectrodo de dos cañones en potasio selectiva se insertó en el estrato radiado de la zona CA1. Unos pocos minutos después de empalamiento, el barril selectiva de iones del electrodo alcanzó una línea de base estable (Figura 7A), que corresponde a una [K _^+] o de alrededor de 2,8 mM, un valor cercano a la [K ^+] de la ACSF utilizado ( 2,5 mM). Bath aplicación de glutamato 0,5 mM durante 10 seg indujo un aumento reversible en [K _^+] o en aproximadamente 4 mM, seguido de un undershoot debajo del nivel basal que asciende a ~ 0,7 mM (Figura 7A). La reducción de la concentración de glutamato a 0,4, 0,3, y 0,2 mM causado una reducción correspondiente en la amplitud de tanto el aumento transitorio y la undershoot _en O (Figura 7A) [K ^+].

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Figura 7. transitorios de potasio extracelular en respuesta a la actividad excitatoria. (A) [K _^+] o transitorios, que consiste en un aumento seguido por una undershoot debajo del nivel basal, inducida por la aplicación de baño de diferentes concentraciones de glutamato durante 10 s como se indica. (B) influencia de una perfusión con bloqueadores de los receptores de glutamato (CNQX, 100 mM; APV, 100 mM) y la tetrodotoxina (TTX; 0,5 M) en [K _^+] o transitorios inducidos por la aplicación de baño de glutamato 0,5 mM durante 10 seg. (C) espontánea [K _^+] o transitorios en presencia de 0mg ²⁺ / BIC. Los experimentos mostrados en la AC se realizaron con electrodos de dos cañones. Para fines de ilustración, los rastros fueron suavizadas con un filtro de Sawitzky-Golay (ancho 20). Por favor click aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Experimentos anteriores han demostrado que este tipo de [K ^+] _o señales inducidas por glutamato no se modifican significativamente durante la aplicación de TTX, por lo que son en gran medida independiente de la apertura de los canales de sodio dependientes de voltaje y la acción neuronal generación potencial de ^15,16. Para estudiar los mecanismos subyacentes a los observados [K _^+] o cambios en respuesta al glutamato, se aplicó bloqueadores de los receptores de glutamato, a saber, CNQX (100 mM; bloqueador de los receptores AMPA) y APV (100 mM; bloqueador de los receptores NMDA) en presencia de TTX (0,5 M). Tras la perfusión baño con estos bloqueadores, inducida por glutamato [K _^+] o cambios eran prácticamente abolida, lo que confirma su dependencia de la apertura de los canales de los receptores de glutamato ionotrópicos como se informó anteriormente (por ejemplo, ^17; Figura 7B).

Para demostrar aún más tél relevancia de excitación glutamatérgica para la generación de extracelular [K ^+] señales, rebanadas fueron perfundidos con solución salina nominalmente Mg ²⁺ exento que contiene 10 mM metyoduro bicuculina (0 mg ²⁺ / BIC). Esto alivia la tensión dependiente de Mg ²⁺ -bloque de los receptores NMDA y amortigua la inhibición por bloqueo de los receptores _GABA A, causando actividad epileptiforme recurrente espontánea en la red (por ejemplo, ^18,19). Como era de esperar ^20, espontáneo, recurrente [K _^+] o transitorios, que asciende a aproximadamente 1,5 mM fueron detectados en 0mg ²⁺ / BIC solución salina (Figura 7C). Entre estas respuestas, más pequeño [K _^+] o transitorios con una amplitud media de aproximadamente 0,2 mM ocurrió (Figura 7C).

En una segunda serie de experimentos, se utilizó ^[Na +] microelectrodos -sensibles para determinar ^[Na +] _o cambios provocados por la aplicación deagonistas de glutamato. Aquí, también comparó las características de respuesta de microelectrodos de dos cañones y concéntricas que emplean dos paradigmas de aplicación diferentes. [Na ^+] microelectrodos -sensibles se posiciona en el estrato radiatum a una profundidad de alrededor de 50 mM. Después se alcanzó una línea de base estable, el agonista de glutamato L-aspartato se aplicó por perfusión baño (10 mM, 120 seg, la perfusión del baño a 2,5 ml / min). Como se observó anteriormente ^21, la aplicación de aspartato provocó una disminución lenta en [Na _^+] o en aproximadamente 15 mM, que duró unos 5 minutos y luego comenzó a recuperarse de nuevo a la línea de base (Figura 8A). Cabe destacar que, mientras que las amplitudes de pico y la cinética de los ^[Na _+] o señales determinadas por ambos electrodos eran prácticamente idénticas en estas condiciones, los electrodos concéntricos exhibieron una línea de base más estable y un nivel de ruido inferior (Figura 8A).

Para probar la r ESPUESTA características de los diferentes electrodos bajo un paradigma aplicación más rápida, glutamato-nos aplica presión a través de una pipeta de vidrio fino colocado en el estrato radiatum a una distancia de un 20-40 micras desde la punta de la microelectrodo selectivo de iones. Como era de esperar ^21, la aplicación de glutamato (10 mM) durante 200 ms provocó una caída en el _{O (Figura} 8B) [Na ^+]. Las amplitudes máximas de la [Na _^+] o disminución estaban en el mismo rango para ambos tipos de electrodos (dos cañones: 4.5 - 13.5 mM, n = 14; concéntrica: 2,0 - 19,1 mM, n = 15). Sin embargo, en contraste con los resultados obtenidos con baño de perfusión lenta (véase más arriba), no sólo la relación señal-ruido, sino también el curso temporal de los [Na _^+] o señales detectadas por los dos tipos de electrodos diferían significativamente. El tiempo promedio a pico fue de 3,5 segundos para el sólo el 1,3 seg de dos cañones y de los microelectrodos concéntricos.

homólogos ve_content "> Por lo tanto, estos resultados demuestran y confirman la cinética de respuesta más rápidos de Na ⁺ concéntricos vs. microelectrodos selectivos de dos cañones, (cf. Figura 6C y 8B), como también se observó para ^Ca2 + y pH selectivos ¹⁰ . En contraste con el estudio anterior, en el que se realizó la estimulación sináptica de corta ráfaga de evocar los transitorios de iones rápidos inducidos sinápticamente-, sólo había una tendencia, pero no hubo diferencias significativas en las amplitudes medias de los picos entre electrodos concéntricos y de dos cañones con nuestra aplicación paradigma. Esto era probablemente debido al hecho de que la distancia de la pipeta aplicación desde la punta del microelectrodo selectiva de iones varió por un factor de dos (20-40 micras), y, en consecuencia, que la concentración de glutamato máxima a la región diana no era el mismo en diferentes experimentos, obstruyendo cualquier diferencia existente en amplitudes de pico.

(A) Top traza: Cambio en la voltage de los barriles de referencia (V _ref) de un electrodo de dos cañones (trazo punteado negro) y un electrodo concéntrico (traza gris) en respuesta a los cambios en el baño de Na ⁺ de concentración ([Na ^+] _b) como se indica. Tenga en cuenta que las respuestas de tensión de ambos electrodos son prácticamente idénticos. Trazas inferiores: Los cambios en el voltaje de la Na ^+: posible (V _{Na +)} de un electrodo de dos cañones (trazo negro) y un electrodo concéntrico (traza gris) en respuesta a los cambios en [Na ^+] _b. (B) parcelas de media logarítmica de la [Na ^+] _b frente al V _{Na +} de ambos electrodos. Parcelas lineal de los datos revelan una pendiente de aproximadamente 48 mV para ambos electrodos. (C) Respuesta de la V _{Na +} de un (trazo negro) de dos cañones y un electrodo concéntrico (trazo gris) a un cambio rápido en el [Na ^+] _{b desde} 152 mM a 70 mM. Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo concéntrico es significativamente faster. Para fines de ilustración, los rastros fueron suavizadas con un filtro de Sawitzky-Golay (ancho 20).

Figura 8: transitorios sodio extracelular detectada por los electrodos de dos cañones y concéntricos.
(A) los cambios transitorios en V _ref y [Na ^_+] o inducida por perfusión baño con aspartato 10 mM durante 120 segundos, como se indica en el bar. Las huellas superiores muestran una grabación realizada con un electrodo de dos cañones, las huellas más bajos se registraron usando un electrodo concéntrico. (B) los cambios transitorios en V _{ref y} [Na ^_+] o inducida por la aplicación de presión local con glutamato 10 mM durante 0,2 segundos según lo indicado por la punta de flecha. Las huellas superiores muestran una grabación realizada con un electrodo de dos cañones, las huellas más bajos se registraron usando un electrodo concéntrico.Líneas rojas punteadas representan ajustes lineales del periodo comprendido entre el inicio de la señal a su máximo. Tenga en cuenta que el tiempo de respuesta del electrodo concéntrico es significativamente más rápido bajo esta condición. Con fines ilustrativos, las huellas fueron suavizadas con un filtro Sawitzky-Golay (ancho 20). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Base líquida portadora, electrodos selectivos de iones se han empleado con éxito durante décadas y para muchos iones, sensores altamente específicos están disponibles ^{22-26 de.} Cuando se utiliza en el espacio extracelular (ECS) de preparaciones de cerebro de vertebrados, hay que tener en cuenta, sin embargo, que se trata de una técnica muy invasiva: mientras que el ancho de la ECS sólo alrededor de 20 a 50 nm, el diámetro de ion-selectivo microelectrodos es de aproximadamente 1 m (electrodos de dos cañones) o grandes (electrodos concéntricos). Las puntas de microelectrodos selectivos de iones por lo tanto no sólo dañar el tejido durante su empalamiento del tejido, sino también ampliar el ECS, favoreciendo una subestimación de los transitorios de iones. A pesar de estas dificultades, los transitorios de iones extracelulares en respuesta a la actividad neuronal son notablemente consistente entre diferentes laboratorios ^7,8, lo que demuestra la fiabilidad de este método.

El rendimiento y la idoneidad de los electrodos selectivos de ionesdepende de su sensibilidad y selectividad, que se define por el cóctel de sensor ('ionóforo de membrana líquida') utilizado. Cócteles de sensores contienen una molécula transportadora especial, por ejemplo valinomicina para K ⁺ microelectrodos selectivos que presenta una alta selectividad para el potasio ^27. No obstante, la reactividad cruzada con otros iones puede ocurrir y debe ser probado. Valinomicina exhibe una reactividad cruzada significativa para el amonio, que tiene que tenerse en cuenta al interpretar los resultados (por ejemplo, ^11,12). Además, debido a la tensión de respuesta de los ionóforos sigue un comportamiento de Nernst (cf. ecuación 1), la relación señal-ruido y umbral de detección dependen de la concentración del ion a medir. Así, mientras que los pequeños [K _^+] o transitorios evocar grandes cambios de voltaje contra el bajo de línea de base [K _^+] o, pequeña [Na _^+] o transitorios son mucho más difíciles de detectar en contra de la hila línea de base gh [Na ^+] _{o (cf.} Figura 5 y 6).

El rendimiento de los electrodos selectivos de iones también está determinado por la resolución temporal, que se rige en gran medida por su constante de tiempo eléctrica. Esta última está determinada principalmente por la resistencia axial del sensor, y por la capacitancia distribuida a lo largo de la longitud de la pipeta, entre sus soluciones internas y el fluido externo. En la configuración de dos cañones, la resistencia es alta, debido a la larga columna de sensor de iones de rellenado. Para un dieléctrico aislante dado (en este caso de vidrio de borosilicato), la capacitancia se rige por el grosor dieléctrico. En electrodos de doble cañón, la anchura dieléctrica asciende a la pared de vidrio de la pipeta. A medida que el vidrio se adelgaza cerca de la punta, la anchura dieléctrica cae, y la capacitancia aumenta. Estos factores se combinan para producir electrodos con los tiempos de respuesta que van desde varios cientos de milisegundos a variossegundo, ya que estos factores son variados.

Una ventaja importante del diseño concéntrico es que tanto la resistencia axial y la capacitancia para el baño están muy disminuido. Las derivaciones de pipeta concéntricos mayoría de la resistencia del intercambiador de iones rellenado, dejando sólo un remanente en los últimos pocos micrómetros antes de la punta. Además, la solución de llenado dentro de la pipeta concéntrico está distanciado físicamente de la bañera, separados por el grosor de dos paredes de cristal, reduciendo en gran medida la capacitancia. Como se muestra anteriormente ^10, el efecto combinado de reducción de la resistencia y la capacitancia es una mejora en la resolución temporal de dos órdenes de magnitud. En el caso de concéntricos ^de Ca2 + y pH microelectrodos, el 90% los tiempos de respuesta fueron tan bajos como 10 a 20 ms ^10. Una ventaja relacionada del diseño concéntrico es el nivel de ruido inferior (ver Figura 8). Debido a la resistencia reducido en gran medida, los transitorios de tensión de cualquier ambient el ruido se reduce al mínimo. Por otra parte, la recuperación de dichos transitorios es rápida, debido a la constante de tiempo rápida. Estos artefactos son, por tanto, pequeño y rápido, y tienen un efecto menos perjudicial en las grabaciones fisiológicas (cf. Figura 8).

También hay desventajas de la técnica concéntrica. En primer lugar, su montaje es más compleja, y requiere mucho tiempo. Una segunda desventaja es la necesidad de colocar un microelectrodo de referencia independiente con su punta, lo que implica el uso de cualquiera de un micromanipulador separado o un doble manipulador especializada. Finalmente, microelectrodos de doble cañón se pueden extender a un diseño de triple cañón, lo que permite la detección de dos especies de iones diferentes al mismo tiempo ^28, que no es posible para los electrodos concéntricos.

Trampas más comunes

Silanización ineficiente.

El paso más importante, y el principal obstáculo en la fabricación de cualquier líquido-senso microelectrodos selectivo de iones a base es el procedimiento silanización. Cuando los electrodos no responden a cambios en la concentración de iones específico, o responder con una respuesta sub-Nernst (es decir, bien menos de 58 mV por diferencia de concentración de diez veces), pobre eficacia de silanización es típicamente la causa. En nuestra experiencia, esto puede ocurrir si la humedad del aire es demasiado alto o demasiado bajo, típico de las condiciones en la temporada de verano o invierno, respectivamente. Si es factible ejercer algún control sobre la humedad ambiente, estos problemas pueden ser superados.

La resistencia del electrodo es demasiado alto.

Si es necesario, la resistencia del barril sensible a iones puede ser reducido por el biselado. Con este fin, exponer su punta a un fuerte chorro de abrasivo en suspensión en el agua durante un par de segundos. Esto hará que su punta todo lo posible para romper y menor es la resistencia al valor deseado.

Puentes de sal.

Salpuentes entre los barriles de iones y de referencia como resultado electrodos mal o ninguno-respuesta y por lo tanto también pueden confundir enormemente su desempeño en la calibración. Como se ha mencionado anteriormente (véase el punto 1.6.), Esto es principalmente un problema cuando se elige de dos cañones de vidrio theta, pero es un hecho poco habitual cuando se utiliza la técnica de barril offset, trenzado se describe aquí.

Con la facilidad de fabricación en mente, el diseño de doble cañón original de Lux ²⁹ menudo se puede utilizar de forma rentable. Este método utiliza pre-llenado de los barriles de iones y de referencia con soluciones salinas, una exposición rápida a una solución de silano por su aspiración y expulsión de la punta, siguiendo por la incorporación de intercambiador de iones, también a través de la punta (ver ^30,31) . Estos electrodos pueden ser fabricados en aproximadamente 10 minutos, pero su tamaño de la punta es típicamente 4 micras o más y son más propensos a fallar durante un experimento. Por el contrario, los métodos de silanización que implican la exposición a vapores de silano y el caloring puede producir electrodos con puntas más pequeñas que duran días, ya veces semanas.

En conjunto, hay varios protocolos y enfoques sobre cómo preparar microelectrodos selectivos de iones. Aquí, hemos descrito dos procedimientos principales para la fabricación de microelectrodos de dos cañones, así como concéntricos retorcidas que funcionan bien y fiable en nuestros laboratorios, con una tasa global de éxito de cerca del 100%. Es importante destacar que estas técnicas serán transferibles a la medición de otras especies de iones, incluyendo el pH o calcio, y también será aplicable a otras preparaciones que el cerebro, incluyendo cavidades o fluidos llenos de fluido en general. Por último, pero no menos importante, microelectrodos selectivos de iones permiten la determinación de las concentraciones de iones dentro de las células. Debido a su tamaño relativamente grande de la punta (~ 1 m), esta voluntad, sin embargo, será posible sólo en las células con un cuerpo de células grandes, por ejemplo, tal como se encuentra en los preparativos de invertebrados ^28,32.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Abrasivo	Micropulido	Buehler GmbH	Disuelto en capilares
vidrio de borosilicato	1405059	Hilgenberg	Pipeta de aplicación; 75 mm x 2 mm, espesor de pared 0,3 mm
Capilares de vidrio de borosilicato con filamento	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	Para el sensor de microelectrodos de doble cañón
Capilares de vidrio de borosilicato con filamento	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	Para la referencia de microelectrodos de doble cañón
Capilares de vidrio de borosilicato con filamento	GB-200TF-15	Ciencia Productos	Concéntrico, canal exterior. D.E. 2.0 mm
Capilares de vidrio de borosilicato con filamento	GB-120TF-10	Productos Científicos	Concéntrico, canal interno. Diámetro exterior 1,2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments
Amplificador de electrómetro con cabecera		Hecho a medida	Rin = 10 TΩ e Ibias = 50 fA-1pA (alternativas disponibles en el mercado: e.g. Dagan IX2-700, con cabezal (resistencia de retroalimentación de 10 Gig) o EPMS-07, NPI, Tamm, Alemania)
Cámara experimental		Hecho a medida	Disponible comercialmente desde p. ej.   Warner Instruments, Estados Unidos;   Scientifica, Reino Unido
Horno		Heraeus	Debe permanecer constante a 200 ° C
Cera dura y pegajosa / cera dental	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
	calefactora	hecha a medida	Debe permanecer constante a 40 °C; C
Soporte de microelectrodos de plexiglás		Hecho a medida	Doble cañón: O.D.   capilares de 1,5 mm, concéntricos: D.E. capilares 2 mm
Micromanipulador		Leitz
Micromanipulador	MD4R	Microscopio estereoscópico Leica
	M205C	Leica
Objective	Plan 0.8xLWD	Extractor
	Modelo PP-830	Narishige	Microelectrodos concéntricos
Extractor de pipetas	Modelo P-97	Sutter Instruments	Sensor de microelectrodos concéntricos
Sistema neumático de expulsión de medicamentos	Picospritzter Tipo II	General Valve TM Corporation
Etapa de cola de milano de viaje	DT 25/M	Thorlabs
Pegamento de dos componentes	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	También se puede utilizar una pequeña tira de papel de aluminio para pegar los capilares...
Silverwire	99.9%	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Extractor vertical de Axon Instruments
	Tipo PE-2	Narishige Scientific Instruments	Con un mandril giratorio para microelectrodos de doble cañón
x/y etapa de traslación		Hecho
1 (S), 9 (R) - (&menos;)-Bicucullina metiodiuro Sigma	aldrich	14343	Antagonista competitivo de los receptores GABAA (sensible a la luz); PRECAUCIÓN
tóxico CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/kainato antagonista del receptor; PRECAUCIÓN: tóxico
Sulfóxido de dimetilo (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	Antagonista del receptor NMDA; PRECAUCIÓN
tóxico Hexametildisilazano (HMDS)	Sigma aldrich	440191	PRECAUCIÓN: Inflamable, toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación) y corrosivo para los metales y la piel
Ácido L-aspártico	Sigma aldrich	A9256	Activa NMDA y no NMDA y EAATs
Ácido L-glutámico sal monosódica hidrato	Sigma aldrich	G1626	Activa NMDA-R, AMPA-R, QA-R y KA-R),  mGluRs y EAATs
Ionóforo de potasio I - cóctel B	Fluka	60403	A base de valinomicina; PRECAUCIÓN
tóxico Ionóforo de sodio II - cóctel A	Fluka	71178	Basado en ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibidor de canales de Na+ dependientes de voltaje; PRECAUCIÓN agua tóxica
, ultra pura	Sigma aldrich	W3500

de Placa de pipetas Leica a medida: