Los estudios sobre el desarrollo del paladar están motivados por la incidencia de paladar hendido, un defecto de nacimiento que impone una carga de salud tremenda y puede dejar la desfiguración permanente. Se demuestra aquí una técnica para estantes cultura palatinas que se pueden utilizar para estudiar diferentes vías de señalización implicadas en el desarrollo de paladar y la fusión.
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Artículo de método
Método de estudio palatina Fusión usando estático Organ Culture
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Resumen
Resumen
El labio leporino y el paladar se encuentran entre los más comunes de todos los defectos congénitos. Las formas de paladar secundario de estantes mesenquimales cubiertas de epitelio que se adhiere al formar la costura epiteliales de la línea media (MES). Las teorías sugieren que las células MES siguen un epitelio de transición mesenquimal (EMT), la apoptosis y la migración, haciendo un paladar fusionado 1. La desintegración completa de la economía de mercado es la fase esencial definitiva de confluencia del paladar y la zona células mesenquimales. Ofrecemos un método para cultivo de órganos paladar. La desarrollado protocolo in vitro permite el estudio de los procesos biológicos y moleculares durante la fusión. Las aplicaciones de esta técnica son numerosas, incluyendo la evaluación de las respuestas a los agentes químicos exógenos, efectos de los factores de regulación y de crecimiento y proteínas específicas. Cultivo de órganos Palatal tiene una serie de ventajas, incluyendo la manipulación en diferentes etapas de desarrollo que no es posible utilizando los estudios in vivo.
Introducción
Hendiduras orofaciales son los defectos congénitos craneofaciales más predominantes. Además, tomando en consideración todos los posibles defectos craneofaciales, se trata de la segunda anomalía de nacimiento más común en los recién nacidos 2. Paladar hendido ocurren en aproximadamente 1 de cada 700 nacimientos en los Estados Unidos (US) todos los años, la incidencia de paladar hendido es igual a 475 niños nacidos con paladar hendido al mes o 15 niños con hendiduras por día 3. Aproximadamente el 1% de los niños nacidos en todo el mundo cada año presentan algún tipo de dismorfología craneofacial.
Las hendiduras del paladar y el labio necesitan un procedimiento muy costoso y complicado con implicaciones para toda la vida para los pacientes con esta anomalía. El costo estimado para cada paciente con fisura oral es de aproximadamente $ 100.000 4. El tratamiento de un paciente con labio leporino y paladar hendido requiere un equipo de médicos, incluyendo craneofaciales cirujanos, otorrinolaringólogos, genetistas, anestesiólogos,patólogos del habla-lenguaje, nutricionistas, ortodoncistas, protesistas, psicólogos, neurocirujanos y oftalmólogos.
En palatogénesis, paladar secundario surge como excrecencias pareadas, que inicialmente crecen verticalmente y se someten a la elevación estante palatina sobre el dorso de la lengua. A raíz de la elevación, los palatinos pareadas crecen hacia la línea media (en E14.5 -E15 en ratones y la semana 9 en los seres humanos). El epitelio borde medial (MEE) que cubre la punta estante se adhiere formando la costura epitelial línea media.
Esto es seguido por epitelial a mesenquimal transición y / o apoptosis para permitir la confluencia mesenquimales. Adhesión de oponerse MEE es un evento esencial cuya alteración provoca paladar hendido. Sin embargo, sólo unos pocos estudios investigaron la adhesión inicial de palatinos 5. Las formas de paladar duro por la diferenciación de las células mesenquimales en osteoblastos. El desarrollo anormal del paladar puede producir cleft paladares con o sin la participación del labio.
Técnicas de cultivo de órganos Paladar habían utilizado ampliamente durante muchos laboratorios en los últimos 30 años 6,7.
En este protocolo se describe en detalle un método de la disección del paladar y de la cultura de órganos estática. La ventaja de un cultivo de órganos inmóvil es que permite palatinos se fusionen. Esta técnica se ha utilizado con éxito en nuestro laboratorio para muchos de fusión y de señalización experimentos 8,9. Sin embargo, el ámbito de aplicación de la técnica es muy amplia y se puede utilizar siempre que se requiera el sistema de cultivo de órganos estática, incluyendo la evaluación de las respuestas a los agentes químicos exógenos, los efectos de los factores de crecimiento de regulación en diferentes vías y proteínas específicas.
Figura 1. Ratón palatogénesis. Etapas de desarrollo del paladar ratones. (BF) ele Escaneomicrografías ctron (SEM) del paladar secundario en tiempos de desarrollo representativas. Flechas rojas: muestran la parte inicial de la adhesión del paladar y la fusión. Flechas amarillas: punto al espacio entre los paladares de primaria y secundaria que desaparecerán después de la fusión (Tomado de Kaufman 11 con permiso de PLoS ONE).
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Protocolo
Todos los procedimientos descritos deben realizarse de acuerdo con las directrices y normas para el uso de los animales vertebrados, incluyendo la aprobación previa del Comité local de Animal Institucional de Cuidado y Uso.
1. Preparación de disección Instrumentos y Medios de Cultivo
- Prelavado todos los instrumentos que se utilizarán en la disección con peróxido de hidrógeno 3% y luego autoclave a 121 ° C durante 20 min. Filtra medios BGJb con solución antibiótica y antimicótica usando un filtro de 0,22 micras de poro mediano con succión al vacío en una campana.
2. Preparación del Equipo de Cultura
- Cortar filtros de membrana de policarbonato que apoyarán los órganos palatinas en pequeños triángulos, rocíe con un 70% de alcohol y dejar que se sequen. Preparar Center-Well Organ Culture Dish (60x15 mm) mediante la colocación de una rejilla limpio y esterilizado equilátero de forma triangular de alambre (20 mm) sobre la placa de cultivo de órganos. Luego llene el pozo con 1 ml de BGJB medios de cultivo medios. NOTA: Los medios de comunicación deberían ser suficientes para alcanzar el nivel de la red sin sumergir los paladares. Coloque los filtros de membrana, el lado brillante hacia abajo, sobre la parte superior de la rejilla (3-4 membranas por cuadrícula) .Depending en el experimento, de tratamiento (proteínas, anticuerpos o inhibidores) se pueden añadir a los medios de comunicación
3. embrión de ratón Recogida y preparación para la Cultura
- Para obtener salvaje embriones de ratón de tipo, el uso programado 13.5 embarazada CD-1 de ratón cepa antecedentes genéticos. Limpiar la zona de disección con etanol al 70%.
NOTA: Otras cepas de ratones pueden ser utilizados. Preferimos ratones CD-1 debido a la cantidad de arena más grande. - La eutanasia a los ratones embarazadas en E13.5 dpc (días después del coito) con 5% isoflurano seguido por dislocación cervical para asegurar la muerte a través de protocolos aprobados.
- Pulverizar etanol al 70% en la superficie abdominal ventral para evitar que el palillo del pelo abdominal de los instrumentos. A continuación, abra la cavidad abdominal ventralutilizando una de bordes romos tijeras de operación y pinzas de micro-disección para localizar el útero. Utilizando las pinzas, levantar todo el útero y separarlo del cuerpo mediante el corte en el cuerpo uterino y en las puntas de los cuernos uterinos con una luz tijeras de funcionamiento.
- Coloque el útero sobre una toalla de papel limpia sobre hielo (De acuerdo con la guía de protocolo para el cuidado y uso de animales de laboratorio). Cubra el útero con otra toalla de papel limpia para evitar la contaminación. Esterilizar los instrumentos que utilizan el 70% de etanol aerosol antes de usar más. El útero y los embriones pueden ser transportados al laboratorio en hielo.
- En una campana de flujo laminar abierta, hacer cuidadosamente una pequeña abertura en el saco vitelino con unas tijeras de funcionamiento de bordes romos y pinzas de micro-disección. Haga la mayor apertura y luego empuje suavemente a exteriorizar el embrión desde el saco vitelino.
- La transferencia de los embriones inmediatamente a una placa Petri con fría tamponada con fosfato salino 1X (PBS) pH 7,4. Para asegurar el escenario adecuado, examina El embrión bajo un microscopio de disección para el cuerpo, tamaño de la cabeza y la integridad física morfología.
NOTA: Los embriones que no son en la etapa correcta del desarrollo no se utilizan para el experimento.
Figura 2. Limb Bud Morfología. La proa y extremidades traseras se comprueba el grado de sangrado membrana entre los dígitos. En E13.5, todas las condensaciones dígitos son prominentes, con la cincha y hendiduras distales entre los dígitos que aparecen muy distinta. Los dígitos traseras están detrás de un medio-día 12 Fila superior:. Extremidad anterior, fila inferior: extremidad posterior.
4. Boca Disección
- Coloque un embrión a la vez en una placa de Petri con PBS bajo el microscopio de disección. Usando pequeñas tijeras de disección y pinzas separar la cabeza del cuerpo de los embriones.
- Sosteniendo con cuidado el cráneo del ratón sobre el nivel del ojo con pinzas (evitandoel proceso maxilar) hacer dos incisiones en ambos lados de la línea del labio. A continuación, retire la mandíbula y la lengua. Aislar la región maxilar proceso haciendo un corte a nivel del ojo y quitar el cerebro, los ojos, tabique nasal y el tejido adyacente.
Figura tejido 3. Boca obtiene de 13,5 embriones, cuando los estantes de paladar habían elevados pero no hizo contacto. Los palatinos se colocaron en cultivo de órganos en un filtro en la interfaz de medios aéreos durante 72 horas en el modelo estático. (A) Nivel de disección de embriones E13.5. (B) Azul estrellas demarcan áreas para mantener el tejido con pinzas durante la disección. (C) Vista de palatinos disecados colocados sobre una membrana de filtro trapezoidal. (D) Vista lateral de la placa de cultivo después de la colocación del paladares diseccionaron y adición de medios de cultivo.
- Coloque el lado oral, paladar y quitar el tabique nasal y el tejido que lo rodea, manteniendo el paladar primario unido para ayudar a orientar de anterior a posterior. Use una espátula de cuchara y transferir con mucho cuidado los procesos palatinos (lado nasal abajo) para los filtros preparados en las rejillas de las placas de cultivo. NOTA: Ajuste el volumen de los medios de comunicación para permitir adecuada interfaz aire-media.
- Bajo el microscopio estereoscópico, diseccionar el paladar primario y utilizar pinzas para colocar los procesos palatinos cerca uno del otro. Los estantes de paladar no se fusionan si no se ponen en contacto. Cortar el filtro de membrana triangular donde se encuentra la parte anterior del paladar. La forma trapezoidal ayudará en la localización de la porción anterior del paladar.
- Cultura de los procesos palatinos individual o con dos o tres en la misma placa de cultivo de órganos usando BGJb medios de cultivo.
5. Estantes cultivo ratón palatinos
- Incubar la tissues a 37 ° C en una mezcla de gas humidificado (5% de CO2 y 95% de aire) durante 72 horas, y cambian el medio cada 24 horas.
6. Paladar procesamiento para el análisis histológico
- Fijar los paladares después de 72 horas en cultivo con formaldehído al 4% / buffer fosfato salino O / N a los 4 ° C. Luego, suavemente con una pipeta de transferencia lavar el tejido en la placa de cultivo con PBS. Envuelva los paladares en un pedazo de toallitas de laboratorio y lugar en la incrustación de casetes.
NOTA: Envolver los paladares en toallitas de laboratorio a prevenir su pérdida durante el proceso de deshidratación. - Deshidratar el tejido después de 70%, 80% y hasta el 100% lavados de etanol durante 1 hora, seguido por el procedimiento ordinario inclusión en parafina. Para incrustar, coloque la parte anterior del paladar hacia la bandeja.
- Cortar serie 6 micras secciones en la orientación coronal de anterior a posterior. Una sección paladar completa producirá 350-450 sections. Teñir las secciones con hematoxilina y eosina (H & E). Cada sección 20ª utilizando el descrito anteriormente Mean Fusión Puntuación (MFS) escala de 10 Score (Tabla 1). 8
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Resultados
La técnica se puede aplicar a diferentes tipos de experiments.The siguiente estudio fue diseñado para probar el efecto teratogénico de la nicotina in vitro en la fusión palatal. Dos cepas de ratones fueron utilizados para este experimento, CD1 y el tejido C57.Palatal se trató con concentraciones mM de hemisulfato de nicotina 0,06 y 6. Se observó que los patrones de fusión palatinas y el momento eran diferentes en las dos cepas diferentes. En ratones CD1, estantes palatales del grupo de control continuaron de fu...
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Discusión
El protocolo en este artículo proporciona un método de disección palatinos de los embriones en el día embrionario 13.5. Palatinos de embriones de ratón se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero en una atmósfera de 95% de O 2 5% de CO 2 a 37 ° C. Disección palatina éxito depende fundamentalmente de factores múltiples en cada paso durante el procedimiento desde el momento embrionario de los ratones sacrificados a la finalización de la cultura. Uno de los factores más importantes que influye...
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores no tienen ningún agradecimiento.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicilina/Estreptomicina | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Placas de Petri | VWR | 25384-088 | 100 x15 mm |
| Placa de cultivo de órganos de pozo central | Falcon | #353037 | 60 x15 mm |
| Rejilla triangular de alambre | Hecho a medida con malla de alambre de acero inoxidable para adaptarse bien al plato de cultivo de órganos. | ||
| Filtro de policarbonato | GE& Tecnologías de agua y procesos | K04BP04700 | Negro 0,4 micras, 47 mm |
| Microscopio estereoscópico | ZEISS Stemi SR | ||
| Campana de cultivo | NUAIRE Pinza | ||
| Dumont Medical | #5 | ||
| Tijeras de microdisección | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Tijeras Vannas, rectas, 8 cm de largo, puntas de 0,1 mm, hojas de 5 mm, fabricadas en Alemania |
| Tijeras de microdisección | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Tijeras, rectas, 8,5 cm de largo, puntas de 0,025 mm x 0,015 mm, hojas de 7 mm |
| Tijeras de microdisección | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Tijera de muelle curvada curva, 10,5 cm de largo, hojas de 8 mm, de fabricación alemana |
| Curreta quirúrgica (espátula de cuchara) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Capucha protectora de laboratorio | Labconco | ||
| Incubadora Thermo Scientific | Farma | ||
| Series11 Chaqueta | |||
| CO2 incubadora | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fuente de luz de fibra óptica | Fibra ligera Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Casete de incrustación | Toallitas Statlab | EC301 | |
| Kim | VWR | 470173-504 |
Referencias
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653(2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Elsevier. (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358(2011).
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Reimpresiones y permisos
