Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Al lado de los hepatocitos parenquimatosos, el hígado consiste en células no parenquimatosas (APN), a saber las células de Kupffer (KC), hígado células endoteliales (LEC) y las células estrelladas hepáticas (HSC). De dos dimensiones (2D) cultura de hepatocitos humanos primaria (HPP) todavía se considera como el "patrón oro" para las pruebas in vitro de metabolismo de fármacos y hepatotoxicidad. Es bien sabido que el monocultivo 2D de PHH sufre de desdiferenciación y pérdida de función. Recientemente se demostró que NPC hepáticas jugar un papel central en la fisiología del hígado (patógeno) y el mantenimiento de las funciones PHH. La investigación actual se centra en la reconstrucción de la arquitectura del tejido in vivo por 3D-y co-cultivo de los modelos para superar las limitaciones de los monocultivos 2D. Previamente hemos publicado un método para aislar células de hígado humano y se investigó la idoneidad de estas células para su uso en cultivos de células en Biología y Medicina Experimental 1. Basado en el amplio interés en este technique el objetivo de este trabajo fue proporcionar un protocolo más detallado para el proceso de aislamiento de células del hígado incluyendo un video, lo que permitirá una fácil reproducción de esta técnica.
células de hígado humano se aislaron de muestras de tejido hepático humano de las intervenciones quirúrgicas por un EGTA / colagenasa técnica P perfusión de dos etapas. PHH se separaron de la NPC por una centrifugación inicial a 50 x g. Densidad etapas de centrifugación de gradiente se utilizan para la eliminación de células muertas. poblaciones de células hepáticas individuales fueron aislados de la fracción enriquecida NPC usando las propiedades de células específicas y procedimientos de clasificación de células. Al lado del aislamiento PHH fuimos capaces de separar KC, LEC y HSC para su posterior cultivo.
En conjunto, el protocolo presentado permite el aislamiento de PHH y NPC en alta calidad y la cantidad de muestra de tejido de un donante. El acceso a las poblaciones de células hepáticas purificados podría permitir la creación de in vivo como Li humanamodelos Ver.
Introducción
tejido hepático humano es muy complejo y se compone de dos entidades diferentes de células, las células del parénquima y células no parenquimatosas (APN). las células hepáticas parenquimatosas incluyen los hepatocitos y cholangiocytes. Los hepatocitos representan 60 a 70% de las células hepáticas totales y representan la mayor parte de las funciones del hígado metabólicos, por ejemplo, ácidos biliares y complementan la síntesis del factor, la biotransformación y la energía metabolismo 2,3.
La fracción más pequeña NPC constituye el 30-40% de las células hepáticas totales. NPC incluyen diferentes poblaciones de células, ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Nota: se aislaron Todas las células de tejido hepático resecado no tumoral humana, que se mantuvo después de la resección parcial del hígado con tumores hepáticos primarios o secundarios. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes de acuerdo con las directrices éticas de la Charité - Universidad de Berlín.
1. Preparación de materiales y soluciones
- Esterilizar todos los instrumentos y los materiales por adelantado para evitar la contaminación bacteriana durante el proceso de aislamiento.
- Preparar las soluciones necesarias para la perfusión de la muestra de tejido del hígado, el proceso de aislamiento de los....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La separación en una fracción del parénquima y no parenquimatosas, usando centrifugación en gradiente de densidad como un procedimiento de limpieza en combinación con el uso de propiedades de adherencia y MACS conduce a éxito PHH y NPC aislamiento. PHH y el CNP se pueden aislar en alta calidad y en cantidad. La figura 1 muestra la configuración representante del equipo para la perfusión del hígado y la digestión. 10% de FCS se añadió a la colagenasa P que contiene de per.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El protocolo publicado describe una técnica para aislar puro PHH y NPC, a saber, KC, HSC y LEC, a la vez de alta calidad y pureza a partir de la misma muestra de tejido hepático humano. La mayoría de las publicaciones que se ocupan de aislamientos de células del hígado cubren sólo una de esas poblaciones de células 18-20 y procedimientos de aislamiento realizadas con tejidos humanos son raros (revisado por Damm y col.) 21. Adaptación de los métodos establecidos con el tejido animal (po.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Liu Jia Li por su apoyo en la creación de la figura 1. Este estudio fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación y Proyecto de investigación (BMBF) de hígado virtual: 0.315.741.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| General Equipment | |||
| PIPETBOY | pipetas Eppendorf | ||
| Microscopio Eppendorf | |||
| Microscopio | Carl Zeiss | ||
| Olympus | |||
| CO2-incubadora | Binder | ||
| Lamin Air | Heraeus | ||
| Centrífuga Vávarifugo 3.0R | Heraeus | ||
| Vaso de precipitados | de orina Sarstedt 2041101 | ||
| jeringa perfusora 50 ml | B.Braun | 12F0482022 | |
| Filtro de tapa de botella | Nalgene | 1058787 | |
| Falcon 50 ml Tubo cónico de polipropileno | BD Biosciences | 352070 | |
| Falcon 15 ml Tubo cónico de polipropileno | BD Biosciences | 352096 | |
| placa de cultivo de tejidos | BD Biosciences | 533047 | pipetas |
| serológicas | BD Biosciences | 357525, 357551, 357543 | 25 ml, 10 ml, puntas |
| pipeta | SARSTEDT | 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 | 100 µ l, 200 y micro; l, 1.000 y micro; l |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Equipo de aislamiento | |||
| Bomba peristáltica Lauda | |||
| termostato | Lauda medidor de | ||
| pH | Schott | ||
| balanzas finas | Sartorius | ||
| stand | |||
| Bü embudo chner embudo | Haldenwanger | ||
| tubo de | |||
| silicona | |||
| cánulas con puntas | |||
| pinza | |||
| plato | |||
| bisturí | Feather | 12068760 | |
| cámara de recuento Neubauer | para el trabajo | ||
| Costar | |||
| Surgical Drape | Charité Universitä tsmedizin Berlin A2013027 | ||
| compresa | Fuhrmann | 40013331 | |
| guantes quirúrgicos estériles | Gammex PF | 1203441104 | |
| Pegamento para tejidos | B. Braun | 1050052 | |
| frasco de vidrio | Colagenasa | ||
| P | Roche | Roche 13349524 | |
| Percoll | Biochrom | L6145 | Densidad 1.124 g/ml |
| Hank' s BSS | PAA | H00911-3938 | |
| Dulbecco' s PBS | PAA | H15 - 002 | sin Mg/Ca |
| Ampuwa | Plastipur | 13CKP151 | |
| Albúmina | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| NaCl | Merck | 1.064.041.000 | |
| KCl | Merck | 49.361.000 | |
| Hepes Pufferan | Roth | 133196836 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| >Media Equipment | |||
| DMEM | PAA | E15-005 | Glucosa baja (1 g/L) (sin L-glutamina) |
| HEPES Solución tampón 1 M | GIBCO | 1135546 | |
| L-Glutamina | GIBCO | 25030-024 | 200 mM |
| MEM NEAA | GIBCO | 11140-035 | |
| penicilina/estreptomicina | GIBCO | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15 - 039 | sin L-Glutamina |
| Piruvato de Sodio | GIBCO | 1137663 | 100 mM |
| Azul Tripano Solución | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| William' s E | GIBCO | 32551-020 | |
| con GlutaMAX™ | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | 03780-50G | |
| Fortecortin | Merck | 49367 | 8 mg/2 ml |
| Insulina Humana | Lilly | HI0210 | 100 I.E./ml |
| N-Acetilcisteína | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Suero fetal de ternera (FCS) | PAA | A15-101 | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| >Equipo para inmunotinciones | |||
| CD 68 | R& D Systems, EE. UU. | monoclonal | |
| CK 19 | Santa Cruz | D2309 | policlonal |
| CK18 | Cruz | K2105 | monoclonal |
| Vimentin | Santa Cruz | monoclonal | |
| GFAP | Sigma Aldrich | monoclonal | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 23.472-9 | |
| cabra anti-ratón IgG1-PE | Santa Cruz | C0712 | |
| Cabra anti-conejo IgG-FITC | Santa Cruz | L0412 | |
| Metanol | J.T.Baker | 1104509006 | |
| Formaldehído 4% | Herbeta Arzneimittel | 200-001-8 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G |
Referencias
- Pfeiffer, E., et al. Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells. Exp Biol Med. , Maywood. (2014).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev Cell. 18 (....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
