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Artículo de método

El uso de células Caco-2 para el Estudio de lípidos Transporte por el Intestino

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DOI:

10.3791/53086

⸱

20 de agosto de 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

En este artículo

Resumen

Caco-2 pueden servir como modelo in vitro para estudiar el transporte de lípidos por parte de los enterocitos y fármacos/vitaminas liposolubles en lípidos. El sistema de membrana permeable separa el compartimento apical del basolateral, mientras que el sistema de expresión de lentivirus ofrece un método eficaz de sobreexpresión génica. El aislamiento de lipoproteínas está confirmado por TEM.

Resumen

Los estudios de absorción de grasa en la dieta generalmente se realizan utilizando un modelo animal equipado con una cánula linfática. Aunque este modelo animal es ampliamente aceptado como el modelo in vivo de absorción de grasas en la dieta, las técnicas quirúrgicas involucradas son desafiantes y costosas. La manipulación genética del modelo animal también es costosa y requiere mucho tiempo. Podría decirse que el modelo alternativo in vitro es más asequible, ahorra tiempo y es menos desafiante. Es importante destacar que el modelo in vitro permite a los investigadores examinar los enterocitos como un sistema aislado, lo que reduce la complejidad inherente a todo el modelo de organismo. Este artículo describe cómo las células de carcinoma de colon humano (Caco-2) pueden servir como modelo in vitro para estudiar el transporte de lípidos por parte de los enterocitos, fármacos liposolubles y vitaminas. Explica el mantenimiento adecuado de las células Caco-2 y la preparación de su mezcla lipídica; y además discute la valiosa opción de utilizar el sistema de membranas permeables. Dado que las células Caco-2 diferenciadas están polarizadas, la principal ventaja de utilizar el sistema de membrana permeable es que separa el compartimento apical del basolateral. En consecuencia, la mezcla de lípidos se puede agregar al compartimento apical, mientras que las lipoproteínas se pueden recolectar del compartimento basolateral. Además, se discute la efectividad del sistema de expresión de lentivirus en la regulación positiva de la expresión génica en células Caco-2. Por último, en este trabajo se describe cómo confirmar el aislamiento exitoso de lipoproteínas intestinales mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Introducción

Los estudios de absorción intestinal de grasas en la dieta, y las drogas y vitaminas solubles en lípidos pueden llevar a cabo in vivo mediante el uso de un modelo de fístula linfática de 1 - 4. Sin embargo, las técnicas quirúrgicas que participan no sólo son un reto, pero también costoso. Aunque in vivo enfoques basados ​​en el análisis fecal pueden ser utilizados, que se utilizan principalmente para determinar el porcentaje de absorción por el tracto gastrointestinal 2,5. El modelo in vitro descrito en este artículo es más rentable, y las técnicas utilizadas son sin duda menos difícil. Estudios de modificación genética también son más económicos y menos tiempo cuando se llevaron a cabo utilizando este modelo in vitro.

Dado que los materiales solubles en lípidos que son absorbidos por los enterocitos son empaquetados en lipoproteínas de 6,7, la eficacia de este modelo in vitro para producir las lipoproteínas es crucial. Los dos intestina principall lipoproteínas son quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Los quilomicrones, definidos como lipoproteínas con 80 nm de diámetro o más, se producen estrictamente por el intestino delgado cuando los lípidos son abundantemente presentes en el lumen gastrointestinal. Puesto que son las lipoproteínas más grandes, los quilomicrones son posiblemente los transportadores de lípidos más eficientes. Este modelo in vitro, que es capaz de producir los quilomicrones 8, se puede utilizar para estudiar la absorción de grasa dietética, soluble en lípidos vitamina absorción por el intestino, y la biodisponibilidad oral de fármaco lipofílico. La presencia de moléculas solubles en lípidos, vitaminas, medicamentos o en la fracción de lipoproteína es un indicador de su absorción por el intestino delgado. Como se discutió anteriormente, este modelo se puede utilizar para mejorar la biodisponibilidad oral de fármaco lipofílico 6.

Este artículo describe cómo se deben mantener células Caco-2 en la membrana permeable o platos regulares de cultivo de tejidos, cómo las millas de lípidosxture para estimular la producción de lipoproteínas debe prepararse, cómo el sistema de expresión lentivirus puede ser empleado para lograr la sobreexpresión efectiva, y cómo se debe analizar las lipoproteínas aisladas.

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Protocolo

1. Mantenimiento de las células Caco-2

  1. El uso de platos regulares de cultivo de tejidos
    1. Descongelar las 2-Caco células de un vial congelado colocando el vial en un baño de agua a 37 ° C, e inmediatamente añadirlos a una placa de cultivo tisular de 10 cm que contenía 10 ml de medio de crecimiento (suero bovino fetal pre-calentado 15% (FBS ) en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)).
      1. Cuando las células Caco-2 han llegado a 50-70% de confluencia, ellos dividido 1: 6 mediante la incubación de las células con 3 ml de 0,05% / 0,53 mM de ácido etilendiaminotetraacético Tripsina (EDTA) a 37 ° C hasta que se separan (15 min) . Para evitar la formación de grumos de células, mezclar las células varias veces por pipeteo suave. Añadir 0,5 ml de las células tripsinizadas a una placa de cultivo de tejido de 10 cm que contenía 10 ml de medio de crecimiento pre-calentado.
    2. Agitar suavemente los platos varias veces en una dirección hacia adelante y hacia atrás seguido de una dirección hacia la izquierda y hacia la derecha. Evite remolinos de los platosya que puede resultar en una dispersión de células desigual.
    3. Colocar las cápsulas en una superficie plana en una incubadora a 37 ° se suministra con 5% de CO 2. Superficies inclinadas también pueden resultar en una dispersión de células desigual.
    4. Cambie los medios de crecimiento de un día después de comenzar la incubación.
    5. Monitorear las células y registrar el día que lleguen a la confluencia. Tomará alrededor de 1 semana para que las células alcanzan la confluencia del día en que se dividen.
    6. Cambiar el medio de crecimiento dos veces a la semana antes de que las células alcanzan la confluencia. Una vez que las células han alcanzado la confluencia, cambiar los medios de cultivo cada dos días. Después de que las células son 7 días post-confluentes, cambiar el medio de crecimiento diario.
      Nota: Las células están listas para experimentos cuando son 13 días post-confluentes (Figura 1). Dado que las células con el tiempo se vuelven menos efectivos para producir lipoproteínas, utilizar células que se encuentran entre 13 y 17 días post-confluentes 8. Vaya al paso 3 en la forma de realizar el experimento.
  2. Usando el sistema de membrana permeable
    1. Semilla las células Caco-2 en el inserto membrana permeable como se describe en el paso 1.1.1.1. arriba. Evitar el uso de células de un vial congelado debido a que su crecimiento celular es normalmente más lenta (período de recuperación). Brevemente, añadir 0,5 ml de las células tratadas con tripsina a la cámara apical (compartimiento superior) que contiene 10 ml de medio de crecimiento pre-calentado. Además, añadir 10 ml de medio de crecimiento pre-calentado a la cámara basolateral (compartimiento inferior).
      Nota: Para obtener las mejores prácticas, agregue los medios de cultivo a la cámara apical primero y luego a la cámara basolateral. Al retirar los viejos medios, retire los medios basolateral ante los medios apicales. Evite meter la membrana de policarbonato, ya que puede romper la membrana.
    2. Debido a la visibilidad celular pobres a través de la membrana de policarbonato, sembrar las células Caco-2 en una placa de cultivo de tejidos regular con densidad similar, y el uso de este plato para juzgar la confluencia celular.
    3. Siga steps 1.1.2-1.1.6 anteriores.

2. La sobreexpresión de genes

  1. Utilizando el método ordinario transfección
    1. Semilla las células Caco-2 en una placa de cultivo de tejidos como se describe en 1.1.1.1.-1.1.4.
      Nota: Cuando las células son alrededor de 40-50% de confluencia, que están listos para ser transfectadas.
    2. Añadir 67 l de reactivo de transfección a 472 l de los medios de comunicación séricos reducidos en un tubo de microcentrífuga. Evite el contacto del reactivo de transfección sin diluir con la pared del tubo.
    3. Añadir 23 g de pLL3.7 aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) 9 en el reactivo de transfección / reducido mezcla de medio de suero.
    4. Incubar la mezcla durante 20 min a TA.
    5. Reemplace el medio de crecimiento de las células Caco-2 'con 8 ml de 10% de FBS en DMEM.
    6. Añadir la mezcla de ADN / reactivo de transfección / media suero reducido gota a gota al plato.
    7. Agite con cuidado los platos varias veces en un delantero y backward dirección seguida por una dirección hacia la izquierda y hacia la derecha.
    8. Coloque el plato en el 37 ° C incubadora.
    9. Vuelva a colocar los medios de comunicación en el plato con 10 ml de medio de crecimiento un día después de comenzar la incubación.
    10. Supervisar la expresión génica.
      1. Controlar la expresión génica sin 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) tinción. Utilizando un microscopio fluorescente, determinar el porcentaje de células que son verde. El porcentaje representa la eficiencia de transfección.
      2. Supervisar la expresión génica con DAPI.
        1. Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces.
        2. Fijar las células mediante la adición de 10 ml de formaldehído al 4% en PBS (10 min de incubación a RT).
        3. Lavar las células con PBS tres veces.
        4. Se incuban las células en la oscuridad durante 15 min a TA con 8 ml de PBS que contenía 1: 500 DAPI, 1% de BSA, 0,01% de digitonina.
        5. Lavar las células con PBS tres veces.
        6. Ucantar un microscopio de fluorescencia, determinar el número de células que son verde / azul con relación a los que son de color azul (Figura 2 panel superior). El porcentaje calculado representa la eficiencia de transfección.
  2. Utilizando el sistema de sobreexpresión lentivirus 10
    1. Semilla de riñón embrionario (HEK) células humanas 293T en un 15 cm placa de cultivo de tejidos (10% de FBS en DMEM como su medio de crecimiento).
      Nota: Cuando las células son aproximadamente 60-70% de confluencia, que están listos para ser transfectadas.
    2. Añadir 162 l de reactivo de transfección de 1.133 l de los medios de comunicación séricos reducidos en un tubo de microcentrífuga de 11. Evite el contacto del reactivo de transfección sin diluir con la pared del tubo.
    3. Añadir 24 g de pLL3.7 eGFP (u otro constructo), 15,6 g de elemento de respuesta Rev (RRE), 6,0 g de REV, y 8,4 g de glicoproteína de virus de la estomatitis vesicular (VSVG) en el reactivo de transfección / rrelucida mezcla de medio de suero.
    4. Incubar la mezcla durante 20 min a TA.
    5. Reemplace el medio de crecimiento con 16 ml de 10% de FBS en DMEM.
    6. Añadir la mezcla de ADN / reactivo de transfección / media suero reducido gota a gota al plato.
    7. Agitar suavemente los platos varias veces en una dirección hacia adelante y hacia atrás seguido de una dirección hacia la izquierda y hacia la derecha. Es normal ver algunas de las células HEK293T unifamiliares en este punto.
    8. Coloque el plato en la incubadora.
    9. Después de 24 h de incubación, sustituir los medios de comunicación en el plato con 25 ml de medio de crecimiento.
    10. Al día siguiente, recoger el medio de crecimiento que contiene el lentivirus (primera colección).
    11. Repita el paso 2.2.10 para recoger más lentivirus (la segunda colección).
    12. Agrupar la primera y la segunda colección, y eliminar los restos celulares por centrifugación (2.500 xg durante 5 min).
    13. Se filtra la colección con un filtro desechable botella-superior (0,45 micras de poro), yconcentrar el virus por centrifugación de la colección a 31.400 xg durante 2 horas a RT (JA-20 rotor). Marque la parte inferior del tubo de centrífuga donde se encuentra el sedimento. Decantar el sobrenadante, y dejar el tubo invertido a temperatura ambiente durante unos 15 minutos.
    14. Resuspender el sedimento que contiene el virus con 100 l de 1X PBS. Evite las burbujas.
    15. Guarde el virus concentrado a -80 ° C. Evite los ciclos de congelación-descongelación.
    16. Determinar la cantidad óptima de virus necesaria para transducir las células Caco-2 por titulación. Para ahorrar costes, utilizar una placa de 24 pocillos (0,3 ml de crecimiento de los medios de comunicación / pocillo) en lugar de una placa de 10 cm de cultivo de tejidos para la titulación.
      1. Añadir cantidades crecientes del virus concentrado (0, 1, 2, 5, 10, 25, y 50 l / pocillo) suplementado con polibreno (concentración final = 5 g / ml) para el 40-70% de confluencia células Caco-2. Agite la placa de 24 pocillos con cuidado como se describe en 1.1.2.
      2. Vigile su expresión génica (Paso 2.1.10.) (Figura 2 inferior4 paneles).
    17. Dado que la expresión de transgén es generalmente sostenido, mantener las células transducidas para futuros experimentos y controlar continuamente su expresión génica (Paso 2.1.10.).

3. Estimular la secreción de lipoproteínas

  1. Usando el tejido plato normal cultura
    1. Preparar una mezcla de lípidos 100X mezclando 50 mg de ácido oleico, 40 mg de lecitina y 48 mg de taurocolato de sodio. Llevar el volumen a 900 l con PBS (suficiente para 8 platos). Agite la mezcla de lípidos vigorosamente.
    2. Añadir 900 l de la mezcla de lípidos 100X en 89,1 ml de medio de crecimiento. Mezclar y filtrar los medios de comunicación que contiene lípidos. Las concentraciones finales (1X) de ácido oleico, lecitina, y taurocolato de sodio son 2,0 mM, 1,36 mM, y 1,0 mM, respectivamente.
    3. Añadir 10 ml de los medios de comunicación que contiene lípidos a las células.
    4. Se incuban las células con los medios de comunicación que contiene lípidos durante 4 horas en un 37° C incubadora.
    5. Lavar las células con PBS tres veces.
    6. Añadir 10 ml de medio de crecimiento a las células para recoger la secreción de lipoproteínas.
    7. Incubar durante 2 horas en una incubadora a 37 °.
    8. Se recoge el medio que contiene lipoproteínas.
  2. Usando el sistema de membrana permeable
    1. Siga los pasos 3.1.1-3.1.2 para preparar la mezcla de lípidos.
    2. Añadir 10 ml de los medios de comunicación que contiene lípidos a la cámara apical y 10 ml de medio de crecimiento a la cámara basolateral.
    3. Incubar durante 4 horas en una incubadora a 37 °. Se recoge el medio que contiene lipoproteínas en la cámara basolateral.

4. Aislamiento lipoproteína (Figura 3)

  1. Eliminar los restos celulares de los medios de comunicación que contiene lipoproteína mediante centrifugación (2.000 xg durante 5 min).
  2. Decantar los medios de comunicación en un tubo de 50 ml.
  3. Añadir 5,95 g de cloruro de sodio a los medios.
  4. Si la sample será analizada por el TEM, añadir 1 tableta de cóctel inhibidor de proteasa para mantener la integridad de las lipoproteínas.
  5. Llevar el volumen a 23 ml con agua (1,2 g / ml NaCl solución de densidad).
  6. Disolver los solutos completamente.
  7. Decantar toda la solución en un tubo de ultracentrífuga de policarbonato.
  8. Superponer suavemente la solución de densidad de 1,2 g / ml con 0,5 ml de agua (1,0 g / ml de densidad).
  9. Equilibrar el tubo en peso y no por volumen.
  10. Cargar suavemente los tubos en el rotor T865.
  11. Haga girar las muestras en la ultracentrífuga a 429.460 xg durante 24 horas a 4 ° C.
  12. Inmediatamente aislar la parte superior solución de 0,5 ml por pipeteo suave. Mantenga el tubo lo más quieto posible.

Análisis 5. TEM

  1. Preparar 5 ml de ácido fosfotúngstico al 2% (w / v) y ajustar el pH a 6,0.
  2. Filtrar el ácido fosfotúngstico al 2% con un filtro de jeringa (tamaño de poro: 0,2 micras).
  3. Caída de 20 l de la muestra de la lipoproteína en un plato estéril.
  4. Caída de 20 l de ácido fosfotúngstico filtrada 2% junto a la muestra en el mismo plato.
  5. Caer suavemente una rejilla EM con el lado opaco descansando en la muestra.
  6. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min.
  7. Golpear suavemente el lado de la rejilla EM sobre un papel de filtro para eliminar la muestra de la red.
  8. Caer suavemente la rejilla EM con el lado opaco que descansa sobre el ácido fosfotúngstico al 2%.
  9. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min.
  10. Golpear suavemente el lado de la rejilla EM sobre un papel de filtro para eliminar el ácido fosfotúngstico de la red.
  11. El uso de un TEM, la captura de las imágenes de las lipoproteínas (Figura 4).

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Resultados

Figura 13-días post-confluentes células normales Caco-2 1 muestra. La aparición de estructuras en forma de cúpula y las gotas de lípidos intracelulares son característicos de diferenciadas Caco-2 células. Cuando las células Caco-2 no se dispersan igualmente durante la siembra, se aglutinan y crecer demasiado en ciertas áreas del plato; y habrá algunas áreas en el plato sin células. Remolina y colocando el plato en una superficie inclinada debe ser evitado. También es importante señalar ...

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Discusión

En este papel, los dos sistemas que se pueden utilizar para mantener las células Caco-2 se describen, a saber, el plato de cultivo de tejido normal y la membrana permeable. Los beneficios de usar el sistema de membrana permeable incluyen la separación de la apical y basolateral de los compartimentos, y la capacidad de incubar la mezcla de lípidos y recoger la secreción de lipoproteínas de forma simultánea. Sin embargo, los insertos de membrana permeable son caros, y su membrana de policarbonato no permite una buena visi...

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Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Premio Seed Grant de la Facultad de Farmacia de la Universidad Northstate de California (a AMN). Los autores desean agradecer a la Facultad de Farmacia de la Universidad Northstate de California por cubrir el costo de publicación de este artículo, y a George Talbott por su ayuda en la edición de este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMVWR16750-112Precaliente el medio de crecimiento en una placa de cultivo de tejidos individual antes de agregar las células
FBSFisher3600511No inactivamos por calor nuestro suero
TripsinaVWR45000-660Las células se pueden lavar con PBS antes del tratamiento con tripsina 
Sistema de membrana permeableFisher7200173plato de 10 cm, tamaño de poro de 3 mm, membrana de policarbonato
10 cmFisher08-772-E plato de cultivo detejidos
15 cmFisher08-772-24 Plato decultivo de tejidos
24 pocillosFisher12565163Placa
de cultivo de tejidos Reactivo de transfección a base de lípidosFisherPRE2691Puede sustituirse por otro reactivo de transfección
Medios de suero reducidosInvitrogen11058021Para la transfección
pLL3.7 eGFPAddgene11795https://www.addgene.org/11795/
Filtro de tapa de botellaFisher9761120poro de 0,45 mm
PolybreneFisherNC984045410 mg/ml
Ácido oleicoSigma01383-5GPrevenir el ciclo de congelación-descongelación
Lecitina FisherIC10214625Lecitina de huevo  
Taurocolato de sodioFisherNC9620276Producto descontinuado; Número de catálogo alternativo: 50-121-7956
Tableta de cóctel inhibidor de proteasa (sin EDTA)Fisher5892791001Se utiliza principalmente para muestras que necesitan análisis TEM
Tubo de ultracentrífuga de policarbonatoFisher NC9696153Si lo utilizas varias veces, colapsarás el tubo
Tapa para tubo de ultracentrífugaFisherNC9796914Se requiere una herramienta para quitar el tubo/tapa del rotor
JeringaFisher50-949-261Desechable Filtro
jeringaFisher09-719C Tamaño deporo = 0,2 mm; nylon
Ácido fosfotúngsticoFisherAC208310250Para preparar ácido fosfotúngstico al 2%, pH 6.0
PinzaFisher50-238-62Extra fino y Consejos fuertes
Formvar/rejilla de carbonoFisher50-260-34Formvar/rejilla cuadrada de película de carbono 400 Cobre
plato de plato de placa dede

Referencias

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