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Artículo de método

En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

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DOI:

10.3791/53093

⸱

4 de diciembre de 2015

 ,  ,  , 
1Interdisciplinary Graduate School, Nanyang Technological University, 2Singapore Centre on Environmental Life Sciences Engineering, Nanyang Technological University, 3School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, 4Centre for Marine Bio-Innovation, University of New South Wales, 5School of Biological, Earth and Environmental Sciences, University of New South Wales, 6School of Biotechnology and Biomolecular Sciences Sciences, University of New South Wales

En este artículo

Resumen

La microrreología de seguimiento de partículas investiga la viscoelasticidad de los materiales. Aquí, la técnica se utiliza para determinar la viscoelasticidad, el cumplimiento de la fluencia y las funciones efectivas de reticulación de diferentes componentes de la matriz de una biopelícula bacteriana. La matriz está formada por sustancias poliméricas secretadas por las bacterias y sus componentes determinan la estructura de la biopelícula y sus propiedades mecánicas.

Resumen

Las células bacterianas son capaces de formar comunidades de biopelículas adheridas a la superficie conocidas como biopelículas al encerrarse en sustancias poliméricas extracelulares (EPS). El EPS sirve como un andamio físico y protector que alberga las células bacterianas y consta de una variedad de materiales que incluyen proteínas, exopolisacáridos y ADN. La composición del EPS puede cambiar, lo que remodela las propiedades mecánicas de la biopelícula para desarrollar o respaldar aún más estructuras alternativas de la biopelícula, como serpentinas, como respuesta a las señales ambientales. A pesar de esto, hay pocas descripciones cuantitativas sobre cómo los componentes del EPS contribuyen a las propiedades mecánicas y la función de las biopelículas. La reología, el estudio del flujo de la materia, es de particular relevancia para las biopelículas, ya que muchas biopelículas crecen en condiciones de flujo y están constantemente expuestas a esfuerzos cortantes. También proporciona medición e información sobre la propagación de la biopelícula en una superficie. Aquí, la microrreología de seguimiento de partículas se utiliza para examinar la viscoelasticidad y las funciones efectivas de reticulación de diferentes componentes de la matriz en varias partes de la biopelícula durante el desarrollo. Este enfoque permite a los investigadores medir las propiedades mecánicas de las biopelículas a microescala, lo que podría proporcionar información útil para el control y la ingeniería de biopelículas.

Introducción

La mayoría de las células bacterianas son capaces de emplear tanto (sésiles) Modos adjunta a la superficie de crecimiento 1 planctónica (de vida libre) y. En el modo unido a la superficie de crecimiento, las células bacterianas secretan y encierran a sí mismos en grandes cantidades de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) para formar biopelículas. La EPS se compone principalmente de proteínas, exopolisacáridos, ADN extracelular y es esencial para la formación de biopelículas 2. Sirve como un andamio físico por el cual las bacterias pueden utilizar para diferenciar espacialmente y protege a las bacterias de las condiciones ambientales nocivas y las respuestas del huésped. Los diferentes componentes de EPS tienen papeles distintos en la formación de biopelículas 3 y los cambios en la expresión de los componentes de EPS puede remodelar radicalmente las estructuras biofilm 4. Componentes EPS también pueden funcionar como moléculas de señalización 5, y estudios recientes han mostrado ciertos componentes EPS que interactúan con las células microbianas para guiar sus diff migración y biofilmerentiation 6-8.

La investigación sobre la EPS en gran medida se ha avanzado sobre la base de los análisis morfológicos de los biofilms producidos por mutantes defectuosos en un componente específico de la EPS 9,10. Además, el EPS se caracteriza generalmente en la escala macro (caracterización granel) 11. Morfológica analiza sin embargo puede faltar detalle cuantitativa y caracterización mayor, que devuelve valores medios, pierde el detalle que existe dentro de la heterogeneidad de la biopelícula. En la actualidad existe una creciente tendencia a progresar a la caracterización en tiempo real de las propiedades mecánicas de la EPS en la escala micro. Este protocolo se muestra cómo microrheology partícula de seguimiento es capaz de determinar los efectos espacio-temporales de componentes de la matriz Pel y exopolisacáridos Psl en la viscoelasticidad y eficaz reticulación de Pseudomonas aeruginosa biofilms 4.

Microrheology pasiva es una rh simple y baratoeology método que proporciona el más alto rendimiento del muestreo microrheological espacial de un material hasta la fecha 12,13. En microrheology pasiva, esferas de sondas se colocan en la muestra y su movimiento Browniano, impulsado por energías térmicas (k B T) es seguido por microscopía de vídeo. Varios partículas pueden ser rastreados de forma simultánea, y las coordenadas de tiempo-dependiente de las partículas siguen un camino aleatorio convencional. Por lo tanto, en promedio, las partículas se mantienen en la misma posición. Sin embargo, la desviación estándar de los desplazamientos o la media al cuadrado de desplazamiento (MSD) de las partículas, no es cero. Desde fluidos viscosos fluyen, la partícula MSD en un fluido viscoso crece linealmente a medida que pasa el tiempo. En contraste, la reticulación polimérico encuentra en viscoelástico o sustancias elásticas les ayuda a resistir el flujo, y las partículas se convierten limitada en su desplazamiento, que conduce a las mesetas de la curva de MSD (Figura 1A). Esta observación se deduce la relación MSDαt α, donde α es el exponente de difusión que se relaciona proporción de contribuciones elásticas y viscosas de la sustancia. Para partículas que se mueven en los fluidos viscosos a = 1, en ​​sustancias viscoelásticas 0 <α <1, y en sustancias elásticas α = 0. El MSD también puede ser usada para calcular la deformación por fluencia, que es la tendencia del material se deforme permanentemente sobre tiempo y calcula cómo fácilmente un diferenciales materiales.

La química tamaño, la densidad y la superficie de la partícula son críticos para la correcta aplicación de experimento microrheological y se eligen con respecto al sistema estudiado (en este caso los polímeros de la matriz del biofilm, véase la Figura 1B). En primer lugar, la partícula mide la reología de la sustancia con estructuras que son mucho más pequeño que la propia partícula. Si las estructuras de la sustancia son de escala similar a la partícula, el movimiento del partícu es perturbado por la forma y orientación de las estructuras individuales. Sin embargo, si las estructuras que rodean la partícula son mucho más pequeños, este efecto es pequeño y promedio, la presentación de un entorno homogéneo a la partícula (Figura 1B). En segundo lugar, la densidad de la partícula debe ser similar al del medio (1.05 g ml -1 para medios a base de agua) de tal manera que se evita la sedimentación y las fuerzas de inercia son insignificantes. La mayoría de las partículas con celosías de poliestireno cumplen los criterios anteriores. Idealmente, la partícula no interactúa con los polímeros de la matriz de la biopelícula como la interpretación reológico de MSD partícula sólo es válida si el movimiento es aleatorio, impulsada por la energía térmica y la colisión con estructuras de sustancias. Esto se puede observar mediante la comprobación de la partícula sonda tiende a obligar o rebotar en la superficie de un biofilm pre-adulto. Sin embargo, a pesar de la falta de atracción por el biofilm, las partículas deben ser capaces de ser incorporados a la matriz.Además, la heterogeneidad físico-químico de la biopelícula puede resultar en diferentes partículas siendo más adecuado como sondas en diferentes regiones del biofilm. De este modo, las partículas de diferentes tamaños y química de la superficie deben aplicarse a la biopelícula.

Como tal, la partícula MSD es capaz de proporcionar información útil sobre cómo los diferentes componentes contribuyen a la reología y la difusión de la biopelícula. Además, el uso de diferentes sondas le permite a uno para derivar información sobre la heterogeneidad espacial fisicoquímica de la biopelícula. Este método puede ser utilizado para probar el tratamiento antimicrobiano efecto sobre las propiedades mecánicas de la biopelícula, o aplicarse a las biopelículas de especies mixtas para investigar cómo las propiedades mecánicas de la biopelícula se cambian de la introducción de otra especie. Partículas TME también puede ser útil para la caracterización de la dispersión de la biopelícula. Tales estudios serían útiles en la comprensión de los biofilms, lo que podría mejorar los tratamientos biofilm unnd ingeniería de biofilms para actividades útiles.

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Protocolo

1. Biofilm Cultivo

  1. Preparación de Cepas bacterianas
    1. 1 día antes de la cultivación biofilm, preparar cultivos bacterianos planctónicas mediante la inoculación de 2 ml de medio de crecimiento apropiado de cultivo bacteriano congelado. Utilice medio Luria-Caldo (10 g L -1 NaCl, 10 g de extracto de L -1 levadura y 10 g L -1 triptona) para mucoide P. aeruginosa y sus PEL Δ Δ y PSL mutantes defectuosos. Incubar durante la noche a 37 ° C y 200 rpm de remoción condiciones. Diluir cultivos de una noche a un OD 600 de 0,40 utilizando un espectrofotómetro.
    2. Ensamble de configuración de celda de flujo, que ha sido descrito previamente 14, preferiblemente en una estación móvil o carro que puede ser llevado a la sala de microscopio para obtener imágenes de la célula de flujo sin necesidad de desmontarlos.
    3. Preparar el medio de cultivo estéril en 2 L o botellas de 5 litros por cada celda de flujo. Utilice un medio mínimo M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM NH 4 Cl, NaCl 9 mM, 2 mM MgSO 4, y 0,1 mM CaCl 2) suplementado con 0,04% de glucosa (peso / vol) y 0,2% (peso / vol) casaminoácidos) para P. aeruginosa fluya biofilms celulares.
    4. Microesferas fluorescentes Alícuota en tubos de microcentrífuga y giran en H2O estéril durante 5 min en centrifugar a 9,391.2 g. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de medio de crecimiento para eliminar el sodio azida (desinfectante) antes de añadir al medio de crecimiento en 2 L o 5 botellas medianas L.
      NOTA: Diferentes tamaños de microesferas vienen en diferentes concentraciones y deben diluirse de acuerdo con las instrucciones. Por ejemplo, dispersar a 120 l de 1,0 micras de diámetro microesferas, 15 l de 0,5 micras microesferas de diámetro y 0,96 l de 0,2 micras de diámetro microesferas en 2 l de medio de crecimiento para dar 2,18 × 10 6 microesferas ml -1 para cada tamaño de partícula.
    5. Coloque la botella medio a UPSTresma de celda de flujo y permitir que el medio de cultivo fluya a través de la configuración entera. Detenga el flujo e inyectar cultivos de una noche diluidas en cámaras celda de flujo. Permitir que las bacterias se adhieran al sustrato cubreobjetos durante 1 h antes de flujo de medio de crecimiento continua a una velocidad de flujo de aproximadamente 5,5 x 10 -3 m seg -1, o 8 rpm con una bomba peristáltica.
      NOTA: Las biopelículas son generalmente cultivadas a temperatura ambiente (25 ° C) durante 3-7 días.
    6. Alternativamente, para la configuración de la cultura estática, diluir cultivos de una noche 100 veces en tubos de microcentrífuga, añadiendo 10 l de cultivo durante la noche a 1 ml de medio de crecimiento con partículas. Aumentar la concentración de partículas en el medio de crecimiento para cultivo estático en aproximadamente 500 veces en comparación con la utilizada para las biopelículas de flujo (por ejemplo, lavar y resuspender 600 l de 1.0 micras esferas de diámetro en 10 ml de medio de crecimiento) como biofilms celda de flujo están constantemente repone con partículas sino culturas estáticas no lo son.
      1. Añadir 2001; l de cultivo de una noche se diluyó con partículas a las cámaras de 8 diapositivas así. Se incuba a 37 ° C en condiciones estáticas. Las biopelículas son generalmente cultivadas durante 1 día. Reemplace el medio de cultivo gastado diariamente con medio de cultivo fresco con partículas si biofilm se cultiva desde hace más de 1 día.

2. Microscopía

  1. En el día 3 y 5, apague flujo de la bomba peristáltica y llevar configuración de celda de flujo en la sala de microscopía. Abrazadera de tubo cerca de la entrada y salida de las cámaras de la celda de flujo para prevenir la deriva (una causa error sistemático por los cambios en el medio ambiente) de flujo. Coloque la celda de flujo en la platina del microscopio de un microscopio vertical.
    NOTA: Utilice un microscopio invertido para obtener imágenes de los pocillos.
  2. Utilice microscopía de fluorescencia con objetivo 40X aceite para grabar vídeos de movimiento de microesferas embebidas en el biofilm en varios lugares (microcolonias y capas diferenciadas planos) y en diferentes días (día 3 y 5) parainvestigaciones espaciales y temporales. Tome cortos vídeos con una mayor velocidad de fotogramas para investigar los acontecimientos que ocurren en escalas de tiempo cortas (por ejemplo, 1,5-3 vídeos min a velocidad de fotogramas de 25-50 cuadros por segundo para la dinámica de rápidos), y videos más largos con menor velocidad de fotogramas para investigar los acontecimientos en el tiempo más largo escalas (por ejemplo, vídeos de 15-30 min de velocidad de fotogramas de 2.5-5 cuadros / seg para una dinámica más lenta).
    NOTA: Un video contiene típicamente 5-10 partículas, y es típicamente de 1,0 a 2,5 GB de tamaño de archivo. Microcolonias más grandes pueden contener más partículas. Tome 5-10 vídeos para cada categoría (por ejemplo, 5-10 vídeos de diferentes microcolonias y de diferentes lugares en capas planas indiferenciadas). El biofilm tiene una arquitectura heterogénea que puede consistir en microcolonias, canales, vacíos y las capas planas indiferenciadas.
  3. Guardar vídeos en formato adecuado que pueden ser leídos por Fiji / ImageJ (por ejemplo CZI, tif).
  4. Compruebe los vídeos para la deriva desplazándose por vid acabadaeo y la observación de que las partículas no se mueven en la misma dirección al mismo tiempo. Drift puede ser causada por el movimiento z-etapa, las corrientes en la celda de flujo, el desequilibrio de la mesa de anti-vibración, presión de aire o cambios de temperatura. Menor correcta deriva utilizando técnicas de post-procesamiento normalmente se suministran con software microscopio. Deseche todos los vídeos que la deriva no se puede corregir. Registre los siguientes parámetros, que son necesarios durante el análisis de seguimiento de partículas: Resolución (píxeles / um), Número de Marcos, Duración.
  5. Retire la celda de flujo de platina del microscopio y reinicie la bomba peristáltica para seguir cultivando la biopelícula.

3. Análisis de seguimiento de partículas

  1. Obtener trayectorias de las partículas utilizando el plug-in TrackMate en software de código abierto (ImageJ). Descarga Fiji en http://fiji.sc/Fiji. Abra el video con Fiji y en el menú Plugins, seleccione Seguimiento y TrackMate.
  2. Compruebe o ajuste la configuración en °e ventana sugiriendo ajustes iniciales de calibración para que coincida con los parámetros de vídeo como se registra en el paso 2.4.
  3. Detectar partículas en TrackMate usando ImageJ.
    1. Seleccione 'detector de log', diámetro de partícula de entrada y el valor umbral (por ejemplo, 1000). Desplazarse por el video, mientras que al hacer clic en el botón 'Vista previa' para comprobar que los círculos morados siguen las partículas a lo largo del vídeo. Ajuste los valores de diámetro y de umbral, según sea necesario: aumentar el valor umbral si círculos de color púrpura aparecen en el espacio vacío. Reducir el valor de umbral si se detectan partículas no suficientes. Haga clic en el botón al lado de completar la detección de las partículas.
    2. Haga clic en el botón al lado cuando se le presenta la opción para agregar o quitar las partículas detectadas en 'umbral inicial', 'Seleccione una vista' y 'Seleccionar un filtro' ventanas continúen sin ajuste si la detección inicial de partículas fue satisfactoria.
    3. Seleccione 'rastreador LAP simple' en el optien la barra de "Seleccionar un método de seguimiento" ventana como partículas rara vez se mueven fuera de foco en el biofilm y se realiza un seguimiento fácilmente. Utilice los valores máximo distancia de enlace sugerido o baja y la brecha de cierre automático y haga clic en siguiente.
    4. Compruebe que el seguimiento de las partículas es satisfactoria desplazándose por el video para ver que las partículas siguen las pistas dibujadas por TrackMate, y que no hay pistas deseadas o faltantes. Saltear las diversas etapas de filtrado. Ir a la última ventana "Seleccione una acción '. Seleccione 'pistas de exportación a archivo xml' desde el menú desplegable y haga clic en "Ejecutar". Elija una carpeta para guardar las pistas.
      NOTA: Hay varios programas disponibles en el dominio público para el análisis de trayectorias de las partículas y el uso de microrheology. msdanalyzer y TrackArt son ejemplos de partículas seguimiento de programas de análisis que se ejecutan en el entorno Matlab.
  4. Preparar Matlab para importar las trayectorias de las partículas en los archivos xml seleccionando en el menú deMatlab Archivo> Ruta Set ... y poner la carpeta de scripts disponibles con el paquete de Fiji.
  5. Para analizar las trayectorias de las partículas con msdanalyzer, descargue el enlace al archivo zip o el archivo tar.gz at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
    1. Extraer la carpetamsdanalyzer 15 y colóquelo en una carpeta que pertenece a la ruta de Matlab (por ejemplo C: Documents and Settings Mis documentos Matlab). Comience Matlab e iniciar el analizador escribiendo:
      ma = msdanalyzer (2, 'um', 's')
      donde um y sec son las unidades de espacio y tiempo físicos en el video.
      1. Importe las trayectorias de las partículas escribiendo:
        [pistas, md] = importTrackMateTracks ('nombre_de_archivo.xml', 'Clipz';, 'Scalet')
        ma = ma.addAll (pistas);
        donde 'Clipz' elimina la dimensión z un vídeo 2D, y 'Scalet'.
      2. Trazar las trayectorias Onto gráfico usando:
        ma.plotTracks;
        ma.labelPlotTracks;
      3. Calcular los TME de las partículas usando:
        ma = ma.computeMSD;
        ma.msd
      4. Trazar los TME de cada partícula:
        cifra
        ma.plotMSD
      5. Combine trayectorias de las partículas de otros vídeos de la misma categery (por ejemplo, partículas incrustadas en microcolonias de tipo salvaje en el día 3) repitiendo 3.5.1.1 a 3.5.1.4).
      6. Trazar la media del conjunto o de la media de todas las curvas:
        ma.plotMeanMSD
        Cambiar el y- y el eje x de lineal a escala logarítmica. En tiempos de retardo largos, las curvas se vuelven MSD ruidoso debido a la insuficiencia de las estadísticas en los plazos más largos. Las curvas de MSD también pueden elevarse abruptamente debido a un error dinámica. Estas regiones de la curva se pueden eliminar mediante el uso de la herramienta de pincelpara seleccionar el final de la curva y seleccionando 'El cepillado'> 'Eliminar sin cepillar' en el menú Herramientas.
    2. Descarga Ezyfit en http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ y añadir Ezyfit a una carpeta que pertenece a la trayectoria Matlab (por ejemplo C: Documents and Settings Mis documentos Matlab). Instale el menú Ezyfit escribiendo en Matlab espacio de trabajo efmenu instalación. Reinicie MATLAB con el menú Ezyfit en la ventana de la figura. Ajustar las curvas de MSD a la ley de potencia seleccionando en el menú Ezyfit 'Mostrar Fit'> 'Power'> 'a * x ^ n' eran n es el exponente de difusión estimada α.
      NOTA: msdanalyzer requiere el Curve Fitting Toolbox de Matlab para el ajuste de las curvas de MSD. Ezyfit es una alternativa y el software libre que puede realizar el ajuste de curvas.
    3. Borrar trayectorias de las partículas actuales y los TME para calcular nuevos TME partículas en otros lugares o tiempo:
      claro
    4. Después del cálculo de varias curvas medias MSD de partículas en un medio (control), y microcolonias y áreas diferenciadas de varias cepas, copiar y pegar las curvas en un gráfico para la comparación. La rigidez de la muestra y aumentar la reticulación con valores más bajos de MSD. Curvas planas tienen menores α y la muestra es más elástica que curvas más pronunciadas con mayor α.
    5. Seleccione la curva e ir a "Herramientas" para mirar las estadísticas de datos, como la mediana y el rango. El MSD del talón es proporcional a la deformación por fluencia, J (t) del material en el que el cordón está incrustado según la relación,
      figure-protocol-1
      donde J = deformación por fluencia, d = diámetro de las partículas, k B = constante de Boltzman, T = temperatura y t = tiempo.

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Resultados

Las propiedades viscoelásticas locales de la biopelícula en diferentes regiones de la biopelícula, que incluía los huecos (medianas por encima de la biopelícula), llanuras (capa plana indiferenciado de células) y microcolonias (véase etiquetas en la Figura 2A) fueron investigados. Los cambios temporales en propiedades viscoelásticas del biofilm durante la maduración de 3 días a 5 también se determinaron. El MSD de las partículas en los huecos se utilizó como control y comparable a la MSD de partículas e...

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Discusión

Microrheology es una herramienta útil para las mediciones reológicas locales en sistemas heterogéneos, tales como las biopelículas microbianas. Es una técnica no destructiva, lo que permite la supervisión en tiempo real de los cambios reológicos dentro de la misma muestra biológica a través de múltiples puntos de tiempo. En este protocolo, microrheology partícula de seguimiento se aplicó a Pel y los mutantes de exopolisacáridos Psl el fin de investigar cómo afectan a la elasticidad y la reticulación eficaz de la matriz ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación es apoyada por la Fundación Nacional para la Investigación y el Ministerio de Educación de Singapur en virtud de su Centro de Investigación del Programa de Excelencia, las ayudas para la instalación (M4330002.C70) de la Universidad Tecnológica de Nanyang, y ACRF Nivel 2 (MOE2014-T2-2-172) del Ministerio de Educación, Singapur. Los autores agradecen a Joey Yam Kuok Hoong por participar en la manifestación de este protocolo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
FluoresferasInvitrogenF-88211.0 μ Microesferas fluorescentes rojas M (580/605) con modificación de carboxilato
Zeiss Axio Imager M1Microscopio epifluorescenteZeiss
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80Cole-ParmerEW-07523-80Bomba peristáltica
Cámaras de celda de flujo UniversidadTécnica de Dinamarca
Trampa de burbujasUniversidad Técnica de Dinamarca
Tubo de siliconaDow Corningde 3 mm de diámetro exterior, 1  mm de diámetro interior
Conectores de plástico de polipropileno transparente Cole Parmer06365-831/16 pulg. (1.588 mm)
de aglutinantePara sujetar tubos
CubreobjetosThermo Scientific™ Nunc&comercio;50 x 24 mm
Jeringa 3 mlTerumo
27   Aguja GTerumo
2   L Botellas de almacenamiento/medios VWR®
Carropara sujetar la configuración
Carl Clips de la biopelícula

Referencias

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