Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Resumen

En este estudio, se describió un método para sintetizar poblaciones ultrapequeñas de nanopartículas biocompatibles, así como varios métodos in vitro para evaluar sus interacciones celulares.

Resumen

Los vehículos de administración basados en nanopartículas han demostrado ser muy prometedores para las aplicaciones de orientación intracelular, proporcionando un mecanismo para alterar específicamente la señalización celular y la expresión génica. En una investigación previa, se demostró la síntesis de nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) ultrapequeñas para aplicaciones de administración tópica de fármacos y detección de biomarcadores. Los SLN son un ejemplo bien estudiado de un sistema de administración de nanopartículas que se ha convertido en un prometedor vehículo de administración de fármacos. En este estudio, los SLN se cargaron con un tinte fluorescente y se utilizaron como modelo para investigar las interacciones entre partículas y células. Se utilizó el método de temperatura de inversión de fase (PIT) para la síntesis de poblaciones ultrapequeñas de nanopartículas biocompatibles. Se utilizó un ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilfeniltetrazolio (MTT) para establecer los niveles de dosificación adecuados antes de los estudios de interacción nanopartícula-célula. Además, los fibroblastos dérmicos humanos primarios y las células dendríticas de ratón se expusieron a SLN cargados de colorante a lo largo del tiempo y las interacciones con respecto a la toxicidad y la absorción de partículas se caracterizaron mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Este estudio demostró que los SLN ultrapequeños, como sistema de administración de nanopartículas, son adecuados para la diana intracelular de diferentes tipos de células.

Introducción

Vehículos de administración basados ​​en nanopartículas han mostrado una gran promesa para aplicaciones dirigidas intracelulares, proporcionando un mecanismo para alterar específicamente la señalización celular y la expresión génica. Estos vehículos pueden ser cargados con fármacos, proteínas y ácidos nucleicos diseñados para afectar las respuestas celulares y lograr un efecto deseado en los tejidos diana. Muchos tipos de nanovehículos se han explorado para el beneficio terapéutico y de diagnóstico incluyendo lípidos, polímeros, silicio y materiales magnéticos. Estos sistemas son atractivos debido a su potencial para la entrega localizada de fármacos, aumento de la concentración terapéutica en tejidos diana, y la reducción de la toxicidad sistémica.

Nanopartículas lipídicas sólidas (GLC) son un ejemplo bien estudiado de un sistema de liberación de nanopartículas que ha surgido como un vehículo de suministro de fármaco prometedor en los últimos años. SLNs se pueden formular fácilmente para múltiples aplicaciones, incluyendo la detección de ^bio-1, cosméticos ^2, y tentrega herapeutic ^3-7. Su utilidad se deriva del hecho de que se componen enteramente de, lípidos no tóxicos reabsorbibles, resulta en una mayor biocompatibilidad. Durante la síntesis, fármacos lipófilos se pueden incorporar en vehículos SLN, lo que aumenta la solubilidad del fármaco y la idoneidad para la administración parenteral. Vehículos SLN también ayudan a estabilizar la terapéutica encapsulados, reduciendo su degradación y la limpieza, y la maximización de la acción terapéutica. Estos vehículos son particularmente bien adaptado para acción prolongada, preparaciones de liberación controlada debido a su estabilidad en ^3,4,8,9 la temperatura corporal. Es importante destacar que la encapsulación de fármacos en nanopartículas lipídicas altera los perfiles farmacocinéticos intrínsecas de las moléculas de fármaco. Esto proporciona una ventaja potencial al permitir la liberación controlada de fármacos con un índice terapéutico estrecho. La velocidad de liberación de la terapéutica incorporado SLN-puede ser sintonizado basa en la tasa de degradación de lípidos o de la tasa de difusión del fármaco en elmatriz lipídica.

SLNs son a menudo diseñados para acumularse en tejidos diana específicos. Por ejemplo, su tamaño (típicamente mayor que 10 nm) potencia la retención en la circulación, donde la vasculatura tumoral con fugas de tejido facilita la deposición. Además, la vía de administración de partículas se ha demostrado que altera la biodistribución con el potencial para apuntar estructuras fisiológicas específicas, tales como los ganglios linfáticos ^10,11. Tras la deposición en los tejidos diana, el logro de las interacciones celulares apropiadas y eventual internalización de nanopartículas es un reto debido a la capacidad de las membranas celulares para controlar selectivamente el flujo de iones y moléculas dentro y fuera de la celda ^12. Para facilitar la absorción celular, es posible modificar nanovehículos con ligandos específicos que incluyen péptidos, moléculas pequeñas, y anticuerpos monoclonales ^13,14. Varios mecanismos que incluyen tanto la penetración pasiva y transporte activo de nanopartículasa través de la membrana celular se han descrito previamente ^3,12,15. En general, se ha demostrado que las interacciones célula-nanopartículas están influenciados por las propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas incluyendo el tamaño, forma, carga superficial y la química de superficie, además de los parámetros específicos de células tales como el tipo celular o fase del ciclo celular ^12.

Una investigación anterior demostró la síntesis de sub-10 GLC nm de tópicos ^{16 y} biomarcadores aplicaciones de detección de ¹ utilizando el método de la temperatura de inversión de fases (PIT) ^17. Este es un método de síntesis suave donde la composición ² se mantiene constante mientras que la temperatura se cambia gradualmente. Agitación continua de la solución calentada, mientras se enfría a los resultados de RT en una nanoemulsión. Este proceso resulta en la síntesis de GLC con tamaño de partícula menor ¹ que se informó anteriormente utilizando diversos métodos para la síntesis de lípidos nanoparticles ^17-22. La escala de tamaño resultante, a menos de 20 nm, proporciona una ventaja para aplicaciones de focalización intracelulares debido a una mayor área de superficie y el potencial para las interacciones celulares mejoradas.

A esquemática de GLC, diseñado para ofrecer un colorante fluorescente o terapéutico, se muestra en la Figura 1. Los SLNs constan de un lípido interior (por ejemplo, alcano lineal) permitiendo la incorporación de compuestos lipófilos (por ejemplo, tintes o agentes terapéuticos) y un exterior tensioactivo (tensioactivo no iónico, por ejemplo, lineal) rodeada de agua. En este estudio, SLNs se cargaron con un colorante fluorescente y se usan como un modelo para investigar las interacciones célula-partícula. Fibroblastos dérmicos humanos primarios y células dendríticas de ratones fueron expuestos a teñir-cargadas SLN lo largo del tiempo con el fin de caracterizar las interacciones con respecto a la toxicidad y la captación de partículas. A 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) ensayo fue utilized el fin de establecer los niveles de dosificación apropiados. La microscopía de fluorescencia y citometría de flujo fueron dos métodos empleados para examinar la captación de partículas in vitro.

Figura 1. Esquema de GLC que muestra los componentes principales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

1. Tramitación de GLC

1. Síntesis de GLC
   Nota: Utilice el método PIT ^1,17,20 para preparar los sub-20 GLC nm ^1.
   1. Utilice una técnica aséptica, Bioreagents o reactivos de grado de cultivo de células, y los materiales estériles (es decir, pipetas, espátulas, viales, etc.).
   2. Utilice un gabinete de bioseguridad para la síntesis de GLC (Figura 2).
   3. Combinar 0,6 mg de tinte fluorescente (Rojo Nilo (NIR), la concentración NiR es de aproximadamente 0,3 mg / ml) y 0,10 g de Heneicosane (lípido, 5% p / p concentración de lípidos) en un vial (15 ml), co-funde a 90 ° C, y revuelva.
   4. Añadir 0,11 g de polioxietileno (10) oleil éter (tensioactivo, 5,5% p / p concentración de tensioactivo). Co-fundir la mezcla resultante a 90 ° C y remover.
   5. Añadir 1,79 g de agua estéril a la mezcla, el calor a 90 ° C, y revuelva hasta que se forme una nanoemulsión transparente.
      Nota: Bajo continua agitación y enfriamiento controlado, SLSe crean Ns. Estas condiciones causan una inversión de la emulsión de agua en aceite a una emulsión aceite-en-agua. Moléculas lipofílicas como partición NiR a las gotas de lípidos.
   6. Preparar una nanoemulsión en paralelo sin añadir el colorante fluorescente, con el fin de servir como una muestra de control. Combine 0,10 g de Heneicosane y 0,11 g de polioxietileno (10) oleiléter en un vial (15 ml) co-fusión a 90 ° C, y revuelva.
      1. Añadir 1,79 g de agua estéril a la mezcla, el calor a 90 ° C, y revuelva hasta que se forme una nanoemulsión transparente.
   7. Además esterilizar cada nanoemulsión usando un filtro estéril de 0,2 micras.
   
   Figura 2. Esquema de la síntesis de GLC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Tamaño de partícula y Polydispersity
   1. Utilice dispersión dinámica de luz (DLS) para medir el tamaño de las partículas y la polidispersidad de los GLC ¹ utilizando una cubeta de vidrio y un instrumento diseñado para medir el tamaño de las partículas.
   2. Antes de las mediciones de las muestras, medir los tamaños de partícula de dos estándares conocidos siguiendo el protocolo del fabricante para la preparación estándares y medición.
   3. Llenar la cubeta de vidrio con 1,5 ml de solución estándar y medir la solución estándar con las mismas condiciones de medición como las muestras.
      Nota: Paso anterior se repitió para cada norma.
   4. Medir las muestras como se ha preparado. Para cada uno, utilice los siguientes parámetros experimentales: una duración de 100 segundos, el índice de refracción del agua (1.33), la viscosidad del agua a 20 ° C (1.002 mPa · s).
      Nota: Esta técnica utiliza desplazada en frecuencia de luz para medir el tamaño de las nanopartículas.
   5. Reporte el diámetro medio de partícula y la polidispersidad de partidistribución de tamaño de culo.
3. Punto de fusión y calor latente de fusión
   1. Utilice un calorímetro diferencial de barrido (DSC) equipado con un muestreador automático y la fuente de enfriamiento nitrógeno líquido para investigar el comportamiento térmico de SLNs ^1.
   2. Pipetear los SLNs como preparadas en un molde de aluminio 40 l con una masa de aproximadamente 25 mg y sellar herméticamente el recipiente usando una prensa rizador universal a minimizar la pérdida de humedad durante el análisis DSC.
   3. Mida cada nanoemulsión de 5 a 80 ° C.
   4. Informar el punto de fusión y el calor latente de fusión del gráfico de DSC, donde el valle representa el punto de fusión y la integral de la área bajo la curva en el gráfico de DSC dividido por la cantidad de material representa el calor latente de fusión.

2. GLC Interacción con fibroblastos y las células dendríticas

1. Cultura de Primaria fibroblastos humanos
   1. Cultura fi humana primariafibroblastos de acuerdo a las instrucciones del fabricante en medio líquido para el cultivo de fibroblastos dérmicos humanos (medio 106), complementado con el kit suplemento de bajo crecimiento en suero (LSGS). Mantener las células en una atmósfera húmeda a 37 ° C, 5% de CO ₂ y la subcultura al llegar a 80% de confluencia.
   2. Por tanto MTT y análisis de imágenes, las células de semillas en una placa de 96 pocillos, a una densidad de 2 x 10 ⁴ células por pocillo, y permitir que se equilibre a 37 ° CO / N antes de la exposición SLN.
   3. En el tiempo cero, diluir GC en medio completo como se indica (Figura 4), ​​con respecto a la concentración de lípidos, y añadir 10 l por pocillo a cada replicar bien en la placa de 96 pocillos.
   4. Mantener las células a 37 ° C, 5% de CO _2, durante el período de incubación.
2. MTT Ensayo de toxicidad
   1. Después de 24 h de incubación con GLC, determinar la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT, según el protocolo del fabricante.
   2. Lavar las células una vez y añadir medio fresco a cada pocillo (100 l / pocillo). Matar a los pocillos de control por incubación en una solución de metanol 70% durante 10 min antes de reemplazar con medio fresco.
   3. Añadir reactivo MTT (10 l por pocillo) a cada pocillo de la microplaca y se incuba O / N a 37 ° C.
   4. Después de O / N incubación, disolver los cristales de formazina intracelulares con la solución de detergente proporcionado (100 l por pocillo) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   5. Después de 3 h de incubación a RT, obtener valores de absorbancia a una longitud de onda de medición de 570 nm utilizando un lector de microplacas.
      Reactivo MTT utilizado debe ser de menos de 1% (w / v) de 3- (4,5-dimetiltiazol-2) -2, bromuro de 5-difenil-tetrazolio: Nota.
3. Microscopía de Fluorescencia
   1. En los puntos de tiempo específicos después de la dosificación de los fibroblastos con SLN, lavar los fibroblastos dos veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y fijar durante 10 minutos con 70% de metanol frío.
   2. Después de 10 min, Sustituir el metanol con PBS y capturar imágenes utilizando un microscopio invertido, usando un paso de banda (BP) 690/50 nm conjunto de filtros.
4. Cultivo de células de médula ósea de ratón dendríticas
   1. Inducir a las células derivadas de la médula ósea de ratón dendríticas (BMDC) anteriormente descritos ^23,24. Brevemente, las suspensiones de placa de una sola célula de ratones C57BL / 10 de la médula ósea en 100 mm placas de Petri en 2 x 10 ⁶ / placa con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos murino recombinante (GM-CSF, 300 U / ml) y murina recombinante IL-4 (células B factor estimulante, 200 U / ml). Cambie los medios de comunicación cada 3 días.
   2. El día 7, añadir SLNs cargados-NIR a los platos a una concentración final de 0,5 y 5,0 mg / ml de lípidos y mantener las células en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora para la longitud deseada de la exposición.
   3. Recoger las células de los platos aspirando todos los medios de comunicación en la placa, recogiéndola en un tubo de 50 ml, seguido de un lavado a fondo de la placa (para desalojar ad vagamenteHerent células) con 5 ml de tampón fosfato salino (PBS) conteniendo 4 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Recoger la suspensión celular obtenida en el mismo tubo 50 ml.
5. Evaluación del GLC Incorporación mediante citometría de flujo
   1. Determinar la concentración de la suspensión celular obtenida en el punto 2.4.3 y distribuir 3x10 ⁵ células en un 12 mm x 75 mm de fondo redondo de tubo de FACS.
   2. Lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS y luego centrifugar los tubos durante 5 min a 400 xg, a una temperatura de 4 ° C.
   3. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 100 l de PBS / EDTA 2 mM / 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) (tampón de tinción) que contienen anticuerpo monoclonal anti-CD11c-FITC (0,25 g / ml final). Incubar durante 30 min en hielo en la oscuridad.
   4. Lavar las células con 1 ml de PBS y centrifugar los tubos durante 5 min a 400 xg, a una temperatura de 4 ° C.
   5. Descartar el sobrenadante y resuspender cadasedimentar con 400 l de tampón de tinción. Las células están ahora listos para la adquisición de las muestras con un citómetro de flujo (posiblemente equipado con láseres azul y rojo).
   6. El uso de citometría de flujo de software de análisis, evaluar el nivel de incorporación de GLC por DC por gating en la población de células CD11c + (FITC positivo) y la comparación de la intensidad de GLC-asociados fluorescencia (medido en los canales PerCP-Cy5.5 o APC).

Resultados

El método PIT fue utilizado para sintetizar los GLC y la temperatura de inversión de fase se determinó utilizando un baño de agua. Las muestras se calienta lentamente y suavemente agitado hasta que la solución parecía clara. La temperatura de inversión de fase para los GLC hechas usando lípidos heneicosane es de 45 ° C. La Tabla 1 resume el tamaño de partícula, polidispersidad, punto de fusión y el calor latente de fusión de los GLC. Los SLNs sintetizados usando las condiciones de procesamiento descrita...

Discusión

En este estudio, la síntesis de GLC y su aplicabilidad para aplicaciones dirigidas intracelulares fueron exploradas. Estas nanopartículas biocompatibles se han mostrado prometedores como vehículos de administración para múltiples aplicaciones, incluyendo la administración de fármacos, el silenciamiento de genes y tecnologías de vacunas ^25-30. Ultra-pequeños GLC se sintetizaron utilizando un proceso fácil, y sus interacciones con las células cutáneas primarias y células inmunes primarias fueron exploradas. GLC...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Rojo del Nilo (NiR)	Sigma	19123	BioReactivo, apto para fluorescencia, ≥ 98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polioxietileno (10) éter de oleilo
Agua	Sigma	W3500	Filtrado estéril, Biorreactivo, apto para cultivo celular
Filtro de jeringa 0.2 y micro; m Supor Membrana de baja unión a proteínas	Ciencias de la vida	PN4612	Nanotrac no pirogénico
Ultra	Microtrac	U1985IS	Instrumento
Calorímetro diferencial de barrido	Mettlet-Toledo		Instument
Fibroblastos humanos primarios	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medio 106	Life Technologies	M-106-500	Un medio líquido estéril para el cultivo de fibroblastos dérmicos humanos.
Kit de suplemento de crecimiento sérico bajo (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	Todos los componentes del kit completo de
ensayo de proliferación celular LSGS MTT	Trevigen	4890-025-K	Kit sensible para la medición de la proliferación celular basado en la reducción de la sal de tetrazolio, bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio (MTT)
Lector de microplacas Safire2	Tecan	----	Instrumento
solución salina tamponada con fosfato	Sigma	P5493	Para biología molecular
Murina recombinante GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, por SDS-PAGE en condiciones reductoras y visualizado por tinte de plata.
IL-4 murina recombinante	Peprotech	214-14	>97%, por SDS-PAGE en condiciones reductoras y visualizado por tinte de plata.