Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en<em&gt; Drosophila</em

Resumen

Las mitocondrias desempeñan un papel central en la regulación del metabolismo y la homeostasis. Los cambios sutiles en el metabolismo mitocondrial que afectan a la fisiología del organismo podrían ser difíciles de detectar en los estudios metabolómicos de todo el organismo. Aquí describimos un método de aislamiento que mejora la detección de cambios metabólicos sutiles en Drosophila melanogaster.

Resumen

Dado que las mitocondrias desempeñan un papel en el metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo de los carbohidratos y la oxidación de los ácidos grasos, los defectos en la función mitocondrial a menudo comprometen la vida de quienes padecen estas enfermedades complejas. La detección de cambios metabólicos mitocondriales es vital para la comprensión de los trastornos mitocondriales y las respuestas mitocondriales a los agentes farmacológicos. Aunque el metabolismo mitocondrial es el núcleo de la regulación metabólica, la detección de cambios sutiles en el metabolismo mitocondrial puede verse obstaculizada por la sobrerrepresentación de otros metabolitos citosólicos obtenidos mediante extracciones de todo el organismo o de todo el tejido.

Aquí describimos un método de aislamiento que detectó cambios metabólicos mitocondriales pronunciados en Drosophila que eran distintos entre las preparaciones enriquecidas con mosca entera y mitocondrial. Para ilustrar la sensibilidad de este método, utilizamos un conjunto de Drosophila que albergaba ADN mitocondrial (ADNmt) genéticamente diverso y los expusimos al fármaco rapamicina. Con este método, demostramos que la rapamicina modifica el metabolismo mitocondrial de una manera dependiente del genotipo mitocondrial. Sin embargo, estos cambios son mucho más distintivos en los estudios metabolómicos cuando los metabolitos se extrajeron de fracciones enriquecidas mitocondriales. Por el contrario, los extractos de tejido entero solo detectaron cambios metabólicos mediados por el fármaco rapamicina, independientemente de los ADNmt.

Introducción

El objetivo de este procedimiento es desarrollar fracciones enriquecidas mitocondriales que producen metabolitos mitocondriales suficientes para estudios de metabolómica utilizando Drosophila melanogaster. En nuestra experiencia, la metabolómica análisis utilizando métodos de extracción celular enteros son incapaces de detectar sutiles cambios de metabolitos mitocondriales en Drosophila. Sin embargo, fraccionamiento mitocondrial antes del análisis metabolómica aumenta la sensibilidad para identificar los cambios de metabolitos mitocondriales.

Las mitocondrias son orgánulos celulares responsables para proporcionar 90% de ....

Protocolo

1. Reactivos y Soluciones

1. Preparación de alimentos con mosca y los medios de comunicación
   1. Calor ingredientes de la mosca 11% de azúcar, 2% de levadura autolizada, 5,2% de harina de maíz, agar 0,79% w / v en agua en una placa calefactora puesta a 90 ° C. Agitar regularmente hasta que se obtiene una mezcla ligeramente densa homogénea. Preparar un volumen final de 550 ml de la comida de la mosca para un total de 100 viales con 5 ml volar comida en cada uno.
   2. Retirar de la fuente de calor, revuelva ocasionalmente hasta que la comida se enfría a 80 ° C y añadir 0,2% tegosept-4-hidroxibenzoato disuelto en etanol al 95%.
   3. Divida la comi....

Resultados

Utilizando el protocolo explicado anteriormente, se realizó un análisis metabolomic en fracciones enriquecidas mitocondriales y extractos animales enteros para probar el efecto de la droga rapamicina sobre ADNmts divergentes ^7. Hemos entregado 200 M de rapamicina disolviendo el fármaco en la comida de la mosca. Las moscas se expusieron a la rapamicina durante 10 días. Los metabolitos a partir de extractos de moscas enteras y a partir de extractos mitocondriales se obtuvie.......

Discusión

Los pasos más críticos en este protocolo son: 1) la cría de moscas suficientes en abundante espacio. Es muy importante que no se pueblan la demografía jaulas con más de 150 moscas cada uno; 2) el cambio de la comida de las jaulas con frecuencia para evitar la competencia de alimentos y el estrés nutricional; y 3) el mantenimiento de todas las muestras a 4 ° C para garantizar la integridad durante el aislamiento de la fracción mitocondrial. También se recomienda para enfriar el tampón de aislamiento, el tampón de lavado,.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,2% tegosept-metil 4-hidroxibenzoato	VWR	AAA14289
Etanol	Sigma-Aldrich	792799
Manitol	Sigma-Aldrich	M4125
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S9378
3-(N-morpholino) ácido propanosulfónico (MOPS)	Sigma-Aldrich	M1254
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma-Aldrich	38057
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Tris HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T-B7
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1551139
almohadillas de CO2 para anestesiar moscas	Investigación	TritechMINJ-DROS-FP
jaula de 1 L	Tienda de restaurante web	999RD32
Tapa de jaula de 1 L	Tienda de restaurante web	999LRD
un homogeneizador de rebote de vidrio-teflón	Fisher Scientific	NC9661231
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	S8045
rapamicina	Laboratorios LC	R-5000
anti-porina	MitoSciences	MSA03
anti-alfa tubulina	Estudios del desarrollo Banco de hibridomas	12G10
Pierce BCA Protein Kit	Thermo Scientific	23225
CO2 almohadilla	Tritech Research, Inc	Matraz filtrante MINJ-DROS-FP ENASCO
tapón de goma		SB08184M

enasco S08512M