Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en<em&gt; Drosophila</em

Resumen

Las mitocondrias desempeñan un papel central en la regulación del metabolismo y la homeostasis. Los cambios sutiles en el metabolismo mitocondrial que afectan a la fisiología del organismo podrían ser difíciles de detectar en los estudios metabolómicos de todo el organismo. Aquí describimos un método de aislamiento que mejora la detección de cambios metabólicos sutiles en Drosophila melanogaster.

Resumen

Dado que las mitocondrias desempeñan un papel en el metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo de los carbohidratos y la oxidación de los ácidos grasos, los defectos en la función mitocondrial a menudo comprometen la vida de quienes padecen estas enfermedades complejas. La detección de cambios metabólicos mitocondriales es vital para la comprensión de los trastornos mitocondriales y las respuestas mitocondriales a los agentes farmacológicos. Aunque el metabolismo mitocondrial es el núcleo de la regulación metabólica, la detección de cambios sutiles en el metabolismo mitocondrial puede verse obstaculizada por la sobrerrepresentación de otros metabolitos citosólicos obtenidos mediante extracciones de todo el organismo o de todo el tejido.

Aquí describimos un método de aislamiento que detectó cambios metabólicos mitocondriales pronunciados en Drosophila que eran distintos entre las preparaciones enriquecidas con mosca entera y mitocondrial. Para ilustrar la sensibilidad de este método, utilizamos un conjunto de Drosophila que albergaba ADN mitocondrial (ADNmt) genéticamente diverso y los expusimos al fármaco rapamicina. Con este método, demostramos que la rapamicina modifica el metabolismo mitocondrial de una manera dependiente del genotipo mitocondrial. Sin embargo, estos cambios son mucho más distintivos en los estudios metabolómicos cuando los metabolitos se extrajeron de fracciones enriquecidas mitocondriales. Por el contrario, los extractos de tejido entero solo detectaron cambios metabólicos mediados por el fármaco rapamicina, independientemente de los ADNmt.

Introducción

El objetivo de este procedimiento es desarrollar fracciones enriquecidas mitocondriales que producen metabolitos mitocondriales suficientes para estudios de metabolómica utilizando Drosophila melanogaster. En nuestra experiencia, la metabolómica análisis utilizando métodos de extracción celular enteros son incapaces de detectar sutiles cambios de metabolitos mitocondriales en Drosophila. Sin embargo, fraccionamiento mitocondrial antes del análisis metabolómica aumenta la sensibilidad para identificar los cambios de metabolitos mitocondriales.

Las mitocondrias son orgánulos celulares responsables para proporcionar 90% de la energía que las células necesitan para la función normal ^1. En los últimos años se ha reconocido que las mitocondrias juegan un papel mucho más dinámico en la función celular y del organismo que simplemente la producción de trifosfato de adenosina (ATP), y ahora son reconocidos como centros para la regulación de la homeostasis metabólica ^2,3. Las mitocondrias son el resultado de un proceso en el que endosimbiótica dislinajes microbianos Tinct fusionaron ~ Hace 1,5 millones de años ^4. Como las mitocondrias evolucionaron hasta convertirse en verdaderos orgánulos, genes de la endosymbiont fueron incorporados en el genoma nuclear emergente. En los animales hoy en día, aproximadamente 1.500 proteínas mitocondriales son codificada en el núcleo, mientras que 37 genes permanecen en el ADNmt, 13 de los cuales codifican proteínas mitocondriales que son subunidades de los complejos de enzimas de la fosforilación oxidativa ^5. Es necesaria la coordinación entre las mitocondrias y compartimentos nucleares para mantener la función mitocondrial adecuada.

Utilizando los métodos descritos aquí hemos sido capaces de detectar cambios metabólicos mitocondriales en Drosophila que resultan de la manipulación de la coordinación entre los genomas mitocondriales y nucleares. Se utilizó una cepa de Drosophila en el que el ADNmt de su especie hermana D. simulans se colocó en una sola D. melanogaster fondo nucleares ^6. Este mitonuclear 'perturbado'genotipo se comparó con el genotipo mitonuclear 'nativa', o co-evolucionado de D. melanogaster que lleva el mismo genoma nuclear con su D. nativa melanogaster ADNmt. El D. melanogaster y D. simulans ADNmts difieren de ~ 100 aminoácidos y> 500 sinónimo sustituciones que afectan a ^7,8 comunicación mitonuclear. Hemos generado extractos de moscas enteras y extractos enriquecidos mitocondriales para estudiar los cambios de metabolitos en respuesta al estrés farmacológico. Aquí nos muestran que al utilizar fracciones mitocondriales enriquecida detectamos cambios pronunciados en metabolitos mitocondriales entre el genotipo co-evolucionado nativo que lleva el D. ADNmts melanogaster y el genotipo perturbado llevan D. simulans ADNmt. En contraste, los cambios de metabolitos entre estos dos genotipos son sutiles utilizando métodos normales que utilizan extracto de mosca conjunto. Por lo tanto, este método proporciona un camino para entender cómo ADNmts median cambios mitocondriales enrespuesta a diferentes fármacos.

Protocolo

1. Reactivos y Soluciones

1. Preparación de alimentos con mosca y los medios de comunicación
   1. Calor ingredientes de la mosca 11% de azúcar, 2% de levadura autolizada, 5,2% de harina de maíz, agar 0,79% w / v en agua en una placa calefactora puesta a 90 ° C. Agitar regularmente hasta que se obtiene una mezcla ligeramente densa homogénea. Preparar un volumen final de 550 ml de la comida de la mosca para un total de 100 viales con 5 ml volar comida en cada uno.
   2. Retirar de la fuente de calor, revuelva ocasionalmente hasta que la comida se enfría a 80 ° C y añadir 0,2% tegosept-4-hidroxibenzoato disuelto en etanol al 95%.
   3. Divida la comida en dos volúmenes iguales. Añadir 1,1 ml de 50 mM rapamicina disolvieron en etanol a un volumen y 1,1 ml de etanol al otro volumen. Se agita la rapamicina y las soluciones de etanol en la comida. Asegúrese de que la temperatura desciende a 50 ° C antes de la adición de las drogas.
2. Aislamiento Buffer
   1. Preparar 500 ml de Aislamiento Buffer [225 mM manitol, sacarosa 75 mM, 10 mM 3- (N </ em> morfolino) propanosulfónico (MOPS) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 2,5 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA)] en agua.
   2. Ajustar el pH a 7,2 utilizando hidróxido de sodio. El pH inicial será ácida.
   3. Utilice botellas de almacenamiento de filtro estériles con un tamaño de poro de 0,22 micras para esterilizar la solución y almacenarlo a 4 ° C.
3. Tampón de lavado
   1. Preparar 500 ml de tampón de lavado [225 mM manitol, sacarosa 75 mM, KCl 10 mM, Tris HCl 10 mM y 5 mM KH ₂ PO _4] en agua.
   2. Ajustar el pH a 7,2 utilizando hidróxido de sodio. El pH inicial será ácida.
   3. Utilice botellas de almacenamiento de filtro estériles con un tamaño de poro de 0,22 micras para esterilizar la solución y almacenarlo a 4 ° C.

2. Crianza de las cepas de Drosophila

1. Para controlar la densidad de larvas durante el desarrollo, colocar 25 pares de los padres para una botella de cultivo y permitir que ponen huevos durante 48 horas.
2. Eliminar padres después de 48 horas para regular la densidad de huevos.
3. Repita los pasos 2,1 y 2,2 mediante la descendencia F1 emergentes, por lo que dos generaciones de este control de la densidad se logra.
4. Para recoger los adultos, anestesiar las moscas utilizando dióxido de carbono (CO ₂₎ y separados por sexo.
   1. Utilice un regulador de etapa única a entregado CO ₂ puro a partir de un tanque de alta presión en un flujo continuo de 5 psi. Para evitar la electricidad estática, utilice un tubo de plástico para catalizar el CO ₂ en 500 ml de filtrado matraz con agua.
   2. Use un tapón de goma con un agujero para sellar el matraz. Utilice un tubo de plástico para conectar la abertura lateral del matraz a una almohadilla de CO _2.
   3. Coloque las moscas en la almohadilla por no más de 10-15 minutos. Permitir a recuperarse de la anestesia durante 24 horas antes de colocarlos en condiciones experimentales.
5. Para generar suficientes metabolitos de fracciones enriquecidas mitocondriales, utilice 300 moscas por muestra. En este caso, utilizar las hembras, pero Gender puede diferir en otros experimentos. Moscas de transferencia 150 a un hecho en casa 1 L demografía jaula. Permitir el acceso a 5 ml de alimentos mosca en un vial.
6. Transferir los 150 moscas restantes a otra jaula de 1 l. No sobrepoblar jaulas con más de 150 moscas.
7. Utilice seis muestras replicadas por condición experimental. Desde extractos animales enteros producen más metabolitos, para generar 1 muestra de animal entero aísla, transferir 50 hembra vuela una jaula. En cuanto a los aislamientos mitocondriales, utilizar seis muestras replicadas por condición experimental.
8. Coloque las jaulas a 25 ° C con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.
9. Proporcionar alimentos frescos cada 2 o 3 días en un vial con 5 ml de alimentos para mantener la calidad de los alimentos.
10. Mantener moscas en la comida durante 10 días. Este paso es necesario para el tratamiento rapamicina ^7. Otros tratamientos o condiciones serán diferentes.

3. Aislamiento de fracciones mitocondriales

1. Dump vuela de una jaula (150 moscas) en unvidrio-teflón homogeneizador Dounce llena con 1 ml de tampón de aislamiento frío.
2. Homogeneizar moviendo la mano del mortero hacia arriba y abajo de 15 golpes. Mantenga el mortero sobre hielo para mantener las mitocondrias intactas.
3. Transferencia homogeneizado a un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
4. Tome el sobrenadante y se centrifuga a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C para enriquecer en las mitocondrias.
5. A medida que el sobrenadante contiene la fracción citosólica, descartar el sobrenadante o utilizarlo para experimentos alternativos. Resuspender el precipitado en 300 l de tampón de lavado.
6. Repita los pasos 3,1 a 3,5 para la segunda jaula. Combinar los sedimentos resuspendidos de ambas jaulas en un tubo de microcentrífuga criogénico.
7. Centrifugar a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C.
8. Descartar el sobrenadante y flash-congelar el sedimento en nitrógeno líquido.
9. Guarde las fracciones enriquecidas mitocondriales a -80 ° C o temperatura inferior.
   1. Alternativamente, para pre animal completamenteparation, coloque los adultos en un tubo de microcentrífuga criogénico. Flash congelar el vial en nitrógeno y almacenar adultos líquido a -80 ° C o temperatura inferior.

Resultados

Utilizando el protocolo explicado anteriormente, se realizó un análisis metabolomic en fracciones enriquecidas mitocondriales y extractos animales enteros para probar el efecto de la droga rapamicina sobre ADNmts divergentes ^7. Hemos entregado 200 M de rapamicina disolviendo el fármaco en la comida de la mosca. Las moscas se expusieron a la rapamicina durante 10 días. Los metabolitos a partir de extractos de moscas enteras y a partir de extractos mitocondriales se obtuvie...

Discusión

Los pasos más críticos en este protocolo son: 1) la cría de moscas suficientes en abundante espacio. Es muy importante que no se pueblan la demografía jaulas con más de 150 moscas cada uno; 2) el cambio de la comida de las jaulas con frecuencia para evitar la competencia de alimentos y el estrés nutricional; y 3) el mantenimiento de todas las muestras a 4 ° C para garantizar la integridad durante el aislamiento de la fracción mitocondrial. También se recomienda para enfriar el tampón de aislamiento, el tampón de lavado,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,2% tegosept-metil 4-hidroxibenzoato	VWR	AAA14289
Etanol	Sigma-Aldrich	792799
Manitol	Sigma-Aldrich	M4125
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S9378
3-(N-morpholino) ácido propanosulfónico (MOPS)	Sigma-Aldrich	M1254
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma-Aldrich	38057
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Tris HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T-B7
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1551139
almohadillas de CO2 para anestesiar moscas	Investigación	TritechMINJ-DROS-FP
jaula de 1 L	Tienda de restaurante web	999RD32
Tapa de jaula de 1 L	Tienda de restaurante web	999LRD
un homogeneizador de rebote de vidrio-teflón	Fisher Scientific	NC9661231
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	S8045
rapamicina	Laboratorios LC	R-5000
anti-porina	MitoSciences	MSA03
anti-alfa tubulina	Estudios del desarrollo Banco de hibridomas	12G10
Pierce BCA Protein Kit	Thermo Scientific	23225
CO2 almohadilla	Tritech Research, Inc	Matraz filtrante MINJ-DROS-FP ENASCO
tapón de goma		SB08184M

enasco S08512M