El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.
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Artículo de método
Uso del análisis confocal de
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Resumen
Resumen
Este protocolo describe un método para visualizar ligandos distribuidos a través de un campo de células. La facilidad de expresar proteínas exógenas, junto con el gran tamaño de sus células en embriones tempranos, hacen de Xenopus laevis un modelo útil para la visualización de ligandos GFP-etiquetados. MRNAs sintéticos se traducen de manera eficiente después de la inyección en las primeras etapas de embriones de Xenopus, y las inyecciones pueden ser dirigidos a una sola célula. Cuando se combina con un trazador de linaje tales como membrana atado RFP, la célula inyectada (y sus descendientes) que están produciendo la proteína sobreexpresada fácilmente pueden ser seguidos. Este protocolo describe un método para la producción de etiquetado con fluorescencia Wnt y Shh ligandos de mRNA inyectado. Los métodos implican la micro disección de los explantes ectodérmicas (CAPS animales) y el análisis de la difusión ligando en múltiples muestras. Mediante el uso de formación de imágenes confocal, información sobre la secreción de ligando y la difusión sobre un campo de células se puede obtener. Los análisis estadísticos de imágenes confocal proporcionan datos cuantitativos sobre la forma de gradientes ligando. Estos métodos pueden ser útiles para los investigadores que quieran probar los efectos de los factores que pueden regular la forma de gradientes morfógeno.
Introducción
Durante el desarrollo embrionario temprano, las células se comprometen progresivamente para seguir linajes específicos de diferenciación: esto significa un grupo de totipotente (o pluripotentes) las células se restringen gradualmente a establecer poblaciones de células progenitoras determinadas para dar lugar a un tipo de célula. Señalización de las células de la célula es fundamental para la regulación de la especificación de linaje durante el desarrollo embrionario. Se requerirá la manipulación de estas señales para dirigir las células madre hacia destinos específicos para apoyar tratamientos médicos nuevos.
Un número relativamente pequ....
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Protocolo
Ética declaración: Los experimentos con animales se realizaron bajo una licencia oficina del Reino Unido Inicio de MEP y los experimentos llevados a cabo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de York, en el cumplimiento de la LLEGADA (Animal Investigación: Reporte de experimentos in vivo) directrices. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).
1. Estrategia para generar fluorescencia Tagged ligandos
A continuación se muestra un protocolo de ejemplo para la subclonación Wnt8a-HA y eGFP en pCS2, a fin de producir la fusión en el marco construir WNTA-HA-eGFP:
- Configurar y ej....
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Resultados
Confocal análisis de los explantes animales tapa expresar proteínas etiquetadas con fluorescencia proporciona un sistema eficaz para la visualización de la distribución ligando bajo diferentes condiciones experimentales. En un ejemplo, la distribución de GFP etiquetada Shh se muestra (Figura 1). En la etapa de 2 células, embriones de Xenopus se inyectan en ambas células con ya sea con un ARNm de control o con el ARNm que codifica para SULF1, una enzima que modifica el heparán sulfato de la supe.......
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Discusión
Una parte esencial de este protocolo es la generación de ligandos biológicamente activos que normalmente se procesan, secretadas, y capaces de provocar una respuesta en la célula receptora, a pesar de tener un resto fluorescente adjunto. Es fundamental para establecer que el producto del gen fluorescente de etiquetado es biológicamente activa mediante un ensayo apropiado. Para Shh-GFP, la capacidad de activar la expresión de ptc1 se confirmó 16. Wnt8a tiene una capacidad notablemente potente para ind.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por un BBSRC conceder a los MEP (BB / H010297 / 1), una cuota beca BBSRC a SAR y una beca MRC a SWF.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | Melford | MB 1200 | |
| Acetato de amonio | Ambion | de Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonato | VWR International | RC-091 | |
| Nitrato de calcio | Sigma | C13961 | |
| Tapa análoga (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| Clorhidrato de L-cisteína monohidratado | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Etanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | Descarga gratuita http://fiji.sc/Fiji | ||
| Gentamicina | Melford | G 0124 | |
| Ácido acético glacial | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Cubreobjetos de vidrio, No.1.5 | Suministros de laboratorio científico | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Tirador de agujas de vidrio | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Agujas de vidrio | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Gonadotropina crónica humana (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Cloruro de litio (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 y Software Zen (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Agua de grado molecular | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Esmalte de uñas | Botas Código de | barras 3600530 373048 | |
| Espectrofotómetro | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Placa de Petri (55 mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Fenol-cloroformo | Sigma | P3803 | |
| Software Photoshop | Adobe | http://www.photoshop.com/products | |
| ADN polimerasa de alta fidelidad y búferes | Biolabs | M0530S Tampón - M0531S | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Cinta | P/4280/53 | |
| SH5006MPK | |||
| Onecall | Qiagen | S28704 | |
| Tampones de enzimas de restricción | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| DNAse libre de ARNasa | Promega | ME10A | |
| Cuchillas de acero de un solo filo | Personna | 66-0403-0000 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 kit de transcripción | Ambion | AM1330 | |
| Diapositivas de vidrio | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Agujas de | |||
| software Zen lite | Carl Zeiss | Descarga gratuita http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
Referencias
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem.
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Reimpresiones y permisos
