Artículo de método

Uso del análisis confocal de

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DOI:

10.3791/53162

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14 de diciembre de 2015

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1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

En este artículo

Resumen

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Resumen

Este protocolo describe un método para visualizar ligandos distribuidos a través de un campo de células. La facilidad de expresar proteínas exógenas, junto con el gran tamaño de sus células en embriones tempranos, hacen de Xenopus laevis un modelo útil para la visualización de ligandos GFP-etiquetados. MRNAs sintéticos se traducen de manera eficiente después de la inyección en las primeras etapas de embriones de Xenopus, y las inyecciones pueden ser dirigidos a una sola célula. Cuando se combina con un trazador de linaje tales como membrana atado RFP, la célula inyectada (y sus descendientes) que están produciendo la proteína sobreexpresada fácilmente pueden ser seguidos. Este protocolo describe un método para la producción de etiquetado con fluorescencia Wnt y Shh ligandos de mRNA inyectado. Los métodos implican la micro disección de los explantes ectodérmicas (CAPS animales) y el análisis de la difusión ligando en múltiples muestras. Mediante el uso de formación de imágenes confocal, información sobre la secreción de ligando y la difusión sobre un campo de células se puede obtener. Los análisis estadísticos de imágenes confocal proporcionan datos cuantitativos sobre la forma de gradientes ligando. Estos métodos pueden ser útiles para los investigadores que quieran probar los efectos de los factores que pueden regular la forma de gradientes morfógeno.

Introducción

Durante el desarrollo embrionario temprano, las células se comprometen progresivamente para seguir linajes específicos de diferenciación: esto significa un grupo de totipotente (o pluripotentes) las células se restringen gradualmente a establecer poblaciones de células progenitoras determinadas para dar lugar a un tipo de célula. Señalización de las células de la célula es fundamental para la regulación de la especificación de linaje durante el desarrollo embrionario. Se requerirá la manipulación de estas señales para dirigir las células madre hacia destinos específicos para apoyar tratamientos médicos nuevos.

Un número relativamente pequeño de las vías de señalización se reiteró durante el desarrollo, incluyendo las vías que responden a la superfamilia de TGF (Nodals y BMPs) 1-2, FGFs 3, Wnts 4, 5 y erizos. Estas proteínas secretadas se unen a receptores presentes en la membrana celular para activar la transducción de señales alterando de este modo la expresión génica y / o comportamiento de la célula. La regulación estricta de la señal celularAlling es esencial para la especificación de linaje celular y el desarrollo normal. Mientras que la cruz de hablar entre estas vías es importante en la determinación del destino celular, un solo ligando puede suscitar en sí respuestas distintas a diferentes concentraciones. Gradientes morphogen fueron descritos hace más de 100 años como una teoría para explicar cómo los diferentes tipos de células pueden derivar de un campo de 6 células. Señalización moléculas producidas por un grupo de células puede difundir durante un cierto rango, la disminución en la concentración con una mayor distancia de la fuente. Las células expuestas a la señal responderán a la concentración local en su posición en el campo de las células, con las células en las posiciones distintas de responder de manera diferente a los diferentes niveles de la señal. La evidencia de la existencia de morfógenos proviene de estudios en el embrión de Drosophila 7 y el disco de ala 8, así como la extremidad de vertebrados 9 y 10 del tubo neural.

Se necesitan métodos envestigate cómo gradientes morfógeno se estableció e identificar otras moléculas importantes en la regulación de estos gradientes. Elegantes experimentos utilizando inmunohistoquímica para visualizar proteínas endógenas in vivo en el contexto de diferentes orígenes genéticos se han utilizado para investigar los gradientes de morfogenes 11-12. Sin embargo, los buenos anticuerpos y mutantes específicos no siempre están disponibles, por lo que se describe aquí un protocolo mediante la sobreexpresión de ligandos fluorescentes en Xenopus, para proporcionar una alternativa, método sencillo para diseccionar cómo los productos de genes exógenos pueden influir en la distribución de ligandos a través de un campo de las células. Xenopus laevis ofrece un excelente sistema para llevar a cabo este tipo de experimentos que sus embriones se desarrollan externamente por lo que son accesibles en las primeras etapas. Su gran tamaño (1-1.5mm de diámetro) simplifica la microinyección y manipulación quirúrgica y por blástula etapas las células son fáciles de imagen, ya que todavía son relativamente grandes (alrededor de 2081; m de ancho). Estudios de sobreexpresión en Xenopus son fáciles de hacer: ARNm inyectados en el embrión temprano pueden ser dirigidos a células particulares y se traduce de manera eficiente.

Las construcciones Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP fluorescencia etiquetados se generaron utilizando pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 y eGFP. El péptido HA es importante incluir, no sólo para proporcionar una etiqueta molecular adicional, pero también porque se cree que actúa como un espaciador que separa las proteínas Wnt y eGFP permitiendo que ambos productos génicos para funcionar. La construcción utilizada para la visualización de Shh fue utilizado anteriormente para generar un ratón transgénico que expresa una proteína de fusión Shh-eGFP 15; este fue proporcionado amablemente por Andy McMahon. Es importante destacar que la etiqueta GFP para todos los constructos se clona 3 'a la secuencia señal de tal manera que se retiene después de procesar. También es esencial para asegurar que la proteína final incluye secuencias requeridas para modificaciones, tales el addition de los lípidos como es el caso de Shh y Wnt ligands.The ADNc se subclonaron en el vector pCS2 + expresión que está optimizado para la produción de ARNm sintético; que incluye un promotor SP6 y la señal de poliadenilación (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

El trabajo que se describe aquí proporciona un protocolo simple para comparar la secreción y la difusión de fluorescencia etiquetada Wnt y Shh etiquetados ligandos. Mediante la inyección de cantidades definidas de mRNA sintético, el protocolo circunnavega cualquier problema asociado con la expresión variable a partir de diferentes vectores usando diferentes promotores. Estos métodos se han aplicado recientemente a investigar los efectos de la endosulfatase heparán sulfato SULF1 en Shh-eGFP y Wnt8a / secreción Wnt11b-HA-eGFP y difusión en Xenopus, 16-17.

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Protocolo

Ética declaración: Los experimentos con animales se realizaron bajo una licencia oficina del Reino Unido Inicio de MEP y los experimentos llevados a cabo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de York, en el cumplimiento de la LLEGADA (Animal Investigación: Reporte de experimentos in vivo) directrices. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Estrategia para generar fluorescencia Tagged ligandos

A continuación se muestra un protocolo de ejemplo para la subclonación Wnt8a-HA y eGFP en pCS2, a fin de producir la fusión en el marco construir WNTA-HA-eGFP:

  1. Configurar y ejecutar las reacciones de PCR para Wnt8a-HA y eGFP. Utilice la información cebador que se muestra en Tabla1 y la reacción PCR Ejemplo y el Ejemplo de PCR condiciones mostradas en la Tabla 2. Nota: El ADN molde puede variar dependiendo de la construcción que se producen, en este ejemplo, Wnt8a-HA se utiliza como plantilla de ADN.
  2. Limpie las reacciones de PCR utilizando un kit de extracción de gel, lleve a cabo la elución final en 30μl de agua de grado molecular.
  3. Comprobación 2 l de producto de PCR en un gel de agarosa al 1% preparado en TAE.
  4. Productos eGFP PCR Digesto Wnt8a-HA y pCS2 y utilizando las enzimas de restricción apropiadas (ver Tabla 1), creado reacciones como se describe en la Tabla 2 (producto Ejemplo PCR digerido).
  5. Incubar reacciones durante 3 horas a 37 ° C y luego almacenar productos Wnt8a-HA y las buenas prácticas agrarias de PCR en hielo.
  6. Añadir 1μl de fosfatasa intestinal de ternero alcalina (CAIP) para pCS2 compendio e incubar durante 6 minutos a 37 ° C.
  7. Heat inactivar CAIP por incubación durante 15 min a 65 ° C.
  8. Run pCS2 y PCR digiere en un gel de agarosa ultrapura 1% preparado en TAE.
  9. Extracto de gel y limpiar productos pCS2 y PCR utilizando un kit de extracción de gel, llevan a cabo la elución final en 30μl de agua de grado molecular.
  10. Configurar la ligadura tal como se describe en la Tabla 2 (Ejemplo T4 ligadura) y se incuba a 12 ° C durante 16 hr.

2. ARNm Síntesis: Generación de la Templat

  1. Producir plantillas usando la digestión con enzimas de restricción de los plásmidos siguientes (todas en el vector de expresión pCS2): membrana Cerulean (memCerulean), membrana de RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP.
    1. Establecer restricción digiere como se describe en la Tabla 2 (Ejemplo de plantilla digerir).
    2. Mezclar suavemente e incubar las reacciones de 2 horas a 37 ° C.
  2. Ejecutar 2,5 l de plásmido digerido en un gel de agarosa al 1% (TAE) para comprobar que la reacción ha cortado hasta su finalización.
  3. Limpie las digestiones utilizando un kit de extracción de gel, lleve a cabo la elución final en 50 l de agua de grado molecular.

3. ARNm Síntesis: Transcripción in vitro

  1. Sintetizar ARNm funcionales utilizando el kit de transcripción SP6 ARNm. Montar las reacciones en 1,5 ml ADNasa / ARNasa tubos de microcentrífuga gratuita.
  2. Establecer reacciones ARNm de transcripción como se describe en la Tabla 2 (Ejemplo de síntesis de ARNm).
  3. Mezclar elreacciones suavemente con una pipeta y luego se incuba a 37 ° C durante 4 hr.
  4. Comprobación 1 l de la reacción sobre un gel de agarosa al 2% (TAE).
  5. Añadir 1 l de ADNasa a la reacción, la mezcla suavemente con un P20 y se incuba la reacción durante otros 15 min a 37 ° C.
  6. Añadir 340 l de agua de grado molecular, 40 l de acetato de amonio y 400 l de fenol-cloroformo a la reacción. Vortex las reacciones durante 30 segundos.
  7. Haga girar el ARNm durante 5 min, 14,000 × g, 4 ° C.
  8. Pipetear la capa superior (acuosa) de cada reacción de moverlo a un nuevo máximo de 1,5 ml tornillo tubo de microcentrífuga gorra.
  9. Añadir un volumen igual de cloroformo para cada una de las reacciones decantó. Vortex las muestras durante 30 segundos.
  10. Haga girar el ARNm durante 5 min, 14,000 × g, 4 ° C
  11. Pipetear la capa acuosa superior de cada reacción de moverlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresca tapón de rosca.
  12. Añadir un volumen igual de isopropanol a cada una de las reacciones y precipitar el mRNA a -80 ° C durante 30 min.
  13. Girar cada una de las reacciones durante 15 min a 14.000 xg, 4 ° C para sedimentar el ARNm
  14. Eliminar el sobrenadante con cuidado de no perturbar el ARNm peletizado
  15. Añadir 200 l de etanol al 70% a cada una de las reacciones, mezclar las reacciones y luego girar durante 10 minutos a 14.000 xg, 4 ° C.
  16. Eliminar el etanol teniendo cuidado de no perturbar el ARNm, secar el sedimento a temperatura ambiente usando un desecador de vacío o Speed-Vac.
  17. Vuelva a suspender el ARNm de 10-20 l de agua de grado molecular. Haga girar brevemente y mantener las muestras en hielo. Nota: El calentamiento de la muestra a 80 ° C durante 1 min puede ayudar a que se disuelva.
  18. Ejecutar 1μl de ARNm en un gel de agarosa al 2% (TAE) y analizar de 1,2 l en un espectrofotómetro para obtener una lectura precisa de la concentración.
    PASO CRÍTICO: Se requiere una concentración de 400 ng / l de ARNm sintético para llevar a cabo los siguientes experimentos.
    PASO CRÍTICO: Si la relación 260/280 esfuera del rango de 2,00 a 2,20, o la cantidad total de ARNm por encima de 12 mg, llevar a cabo una precipitación con cloruro de litio.
  19. Tienda mRNA en 1 alícuotas a -80 ° C. Use alícuotas y luego tirar a la basura; No vuelva a congelar ARNm.

4. Generación de Xenopus laevis embriones

  1. Primer Xenopus laevis hembras mediante inyección subcutánea con 50 unidades de la hormona gonadotropina coriónica humana (HCG; Chorulon) una semana antes del experimento.
  2. Inducir Xenopus laevis mujeres la noche antes del experimento mediante la inyección de 250 unidades de HCG y su incubación en la oscuridad, O / N a 19 ° C.
  3. Diseccionar testículos de rana macho eutanasia y almacenar en 1xNAM a 4 ° C. NOTA: rana masculina es eutanasia por la anestesia de terminales de conformidad con el Anexo 1 de Animales (Procedimientos Científicos) Ley 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Femenina Masaje Xenopus laevis para inducir la ovulación, recoger el lahuevos id en un 55 mm de diámetro placa de Petri y vuelta.
  5. Producir una suspensión de esperma por aplastamiento ¼ de un testículo Xenopus laevis en 1 ml de agua desionizada.
  6. Cepillo Xenopus ovocitos con la suspensión de esperma aplastado con una pipeta y pipeta de bulbo Pasteur PASO CRÍTICO:. Realizar reacciones fertilización aproximadamente a las 4:30 pm en el día de la prueba.
  7. Embriones Cultura a 21 ° C en NAM / 10 (ver Tabla 3 para soluciones) en 55 mm placas de Petri recubiertas de agarosa al 1% diluido en agua (agua).
  8. Embriones De-jalea después de 45 min utilizando cisteína / HCL (Tabla 3). Nota: A 21 ° C, los embriones se llega a la etapa 2 de células después de 90 min y se unirá cada 20 min después de eso.

5. microinyección de embriones de Xenopus

  1. Usando 1 X capilares de vidrio de 90 mm y una de doble etapa micropipeta de vidrio tirador Narishige PC-10, tire micropipetas para inyectables. Ajustar la configuración empíricamente para lograr una punta fina (Diame menos de una micrater).
  2. Adjunte una micropipeta (aguja) a un microinyector de gas (por ejemplo, el de Harvard Appartaus PLI-100 PICO-inyector) para entregar en repetidas ocasiones volúmenes precisos de líquido mediante la aplicación de una presión regulada por un período establecido de tiempo digital. Ajustar la presión neumática para suministrar un volumen de 1,25 a 10 nanolitros según se determina usando una retícula o calibración de diapositivas.
  3. Escudo una placa de Petri de 55 mm con 5 ml de 1% de agarosa (agua). Corte un cuadrado 35-35 mm de agarosa fuera del plato, esto proporcionará una superficie estable para microinyectar embriones.
  4. Embriones transferir a NAM / 3 + Ficoll (Tabla 3) y mover al plato de la inyección.
  5. Inyectar embriones en el hemisferio animales una vez que alcanzan la etapa necesaria para el experimento.
    1. Para analizar la distribución de ligandos etiquetados GFP en la superficie celular, inyectar los embriones bi-lateralmente en la etapa de dos células, 10nl por célula. Ejemplo diluciones de ARNm se muestran a continuación para Wnt8a-HA-eGFP. PASO CRÍTICO: Asegúrese de que todas las concentraciones de ARNm starte en 400 ng / l.
      Nota: La cantidad de mRNA a inyectar debe determinarse empíricamente ensayando concentraciones y encontrar la cantidad mínima necesaria para visualizar el ligando fluorescente. Transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-HA es un paso esencial para determinar que los ARNm se traducen a niveles similares a fin de permitir la comparación de dos ligandos etiquetados con fluorescencia diferentes; hemos hecho esto por Wnt8a-HA-eGFP y Wnt11b-HA-eGFP en Fellgett et al., 2015.
      Nota: Al evaluar el efecto de una inyección de ARNm (tal como uno que codifica para un regulador candidato), un control típico es inyectar un ARN no activo, tal como LacZ, en embriones de hermanos con el fin de controlar los posibles efectos de la adicional transcripciones en el embrión.
      1. Diluir memRFP mRNA 1 en 4 (1μl + 3μl dH 2 O) con agua de grado molecular para reducir la concentración de 100 ng / l.
      2. Diluir Wnt8a HA-eGFP-mRNA 1 en 4 (1μl + 3μl dH2 O) con agua de grado molecular para reducir la concentración de 100 ng / l.
      3. Mezclar memRFP ARNm en una relación 1: 1 con Wnt8a-HA-eGFP mRNA.
      4. Mezclar ARNm a partir 5.5.1.3 en una proporción de 1: 1, ya sea con el control de ARNm LacZ o un modulador tal como SULF1.
      5. Inyectar embriones bilateralmente en la etapa de 2 células con 10nl de mRNA por célula (total de 20NL). Nota: Esto se traduce en 250 pg de RFP m em, 250 pg de Wnt8a-HA- e GFP, 500 pg de Wnt11b-HA- e GFP y 2 ng de LacZ o SULF1 ARNm que se inyecta en cada celda.
    2. Para analizar la difusión de GFP etiquetada ligandos, inyectar ARNm que codifica ligando-GFP junto con un marcador de linaje tales como memRFP en la fase de 16-32 celular, 1,25 nl por célula.
    3. Para analizar los efectos de cualquier modulador potencial de la difusión ligando, co-inyectar ARNm que codifica para el modulador junto con el ligando y el linaje trazador. Alternativamente, se inyectan células vecinas: una con los ARNm que codifican la ligan-GFP etiquetadod y un trazador de linaje (memRFP) y el otro con mRNAs que codifican para el modulador y un trazador de linaje diferente (memCerulean).
  6. Embriones de transferencia a una incubadora y la cultura 12.5 ° hasta el día siguiente, Nieuwkoop y Faber (NF) Etapa 8.

6. extirpando animales Cap explantes

  1. Embriones transferencia a un 55 mm placas de Petri recubiertas con 5 ml de agarosa al 1% (agua). Llene el plato con NAM / 2 (Tabla 3).
  2. Tome las tapas animales circulares con agujas de tungsteno PASO CRÍTICO:. Tomar gran capitalización en esta etapa ya que se curan mejor y sean más fáciles de imagen, mantenga las tapas de control para asegurar que no se produce la extensión convergente.
  3. Traslado explantes animales a 55 mm placas de Petri recubiertas de agarosa al 1% (agua) y embriones de cultivo a 21 ° C durante 4 horas PASO CRÍTICO:. Se requiere que la incubación de 4 horas para permitir que las proteínas fluorescentes para madurar.
  4. Generar las diapositivas de socorro por pegar a dos capas de PVC insulation cinta en portaobjetos de microscopio. Cortar unos 14 mm por 10 mm rectángulo de la cinta para dejar una cámara para el montaje de las tapas animales PASO CRÍTICO:. Acoplar dos capas de cinta a fondo sobre el portaobjetos antes de cortar el rectángulo.
  5. Pipetear 2 gotas separadas de NAM / 2 (Tabla 3) en la diapositiva relieve, de aproximadamente 30 l por gota.
  6. Transferencia explantes animales a las diapositivas de socorro usando una punta de corte P20 y orientar de manera que el lado apical orientada hacia arriba. Nota: Cada diapositiva puede contener 10-15 tapas animales PASO CRÍTICO:. En esta etapa, las tapas de los animales deberían haber sanado parcialmente, esto significa que son menos delicados y pueden ser orientados con unas pinzas.
  7. Baje suavemente una hoja de cubierta de vidrio sobre el portaobjetos de alivio y deje que la hoja de la cubierta se seque durante 20 minutos PASO CRÍTICO: El tamaño de la tapa de los animales es crucial;. asegurar la tapa es lo suficientemente grande que cuando el cubreobjetos de vidrio se baja sobre el portaobjetos alivio que comprime la capa apical de las células animales tapa lo suficiente para produce una superficie plana para la imagen. Si las tapas de los animales son demasiado pequeños siguen a continuación, reducir la cinta de PVC de una sola capa.
  8. Selle la diapositiva con barniz de uñas PASO CRÍTICO:. No utilice demasiada laca de uñas para sellar las diapositivas de alivio ya que si la cinta de PVC se vuelve demasiado húmedo se levantará y arruinar la diapositiva.
  9. Diapositivas relieve en seco durante 20 minutos en la oscuridad y que están listos para la imagen, por lo general las tapas animales permanecerán sanos durante 4-6 horas, una vez sellada en la diapositiva.

7. Imaging

Nota: Imaging se llevó a cabo utilizando un microscopio confocal invertido. Modo Lambda fue elegido para la imagen ya que esto permite múltiples fluoróforos con las firmas que se utilizarán superposición, y se elimina el problema del potencial de movimiento de la muestra entre las exploraciones.

  1. Buscar explantes utilizando un objetivo de menor aumento y luego cambiar a 63x / 1,4 objetivo de aceite para obtener imágenes de mayor resolución.
  2. Encienda el láser necesarios; Para este ejemplo el 405láser se utilizó para excitar memCerulean, se utilizó el láser 488 para excitar GFP y el láser 561 para excitar memRFP usando 405 y 488/561 espejos dicroicos.
  3. Utilice el modo lambda (En 2011, el modo de lambda seleccione Zen - 32 contenedores).
  4. Seleccione el 405 nm, 488 nm y 561nm lasers.To permitir un campo de visión más amplio, alejar la imagen (a 0.6x).
  5. Ajuste el tamaño del marco con el tamaño de imagen deseado (1024 x 1024 con tamaños de píxel de 220 nm se utilizó para este conjunto de datos).
  6. Establecer un promedio de 4 a típicamente a 8 para aumentar la relación señal a ruido.
  7. Optimizar la (unidad 1 aireado según el láser 561nm se utilizó para este conjunto de datos) estenopeica.
  8. Optimizar los poderes láser PASO CRÍTICO:. Balance de los 405nm, 488nm y 561nm láseres tales que todos los fluoróforos se pueden detectar utilizando la matriz 32 detector de tiempo que se minimiza la cantidad de voltaje y la ganancia requerida.
  9. Recoger el ser de luz emitida desde memCerulean, GFP y memRFP. Por esta luz de trabajo se recogió cada ~10 nm de 415-720nm, aunque intervalos de recogida más grandes también son posibles (por ejemplo., Cada ~ 20 nm).

Análisis 8. Imagen

  1. La investigación de los efectos de los moduladores de la expresión en la superficie celular de ligandos GFP-etiquetados
    NOTA: Los siguientes pasos son una guía detallada de cómo se llevó a cabo el análisis en nuestro laboratorio. El usuario final puede querer hacer más eficiente el proceso escribiendo un guión ImageJ o FIJI para eliminar algunos de los pasos manuales.
    PASO CRÍTICO: Es importante las muestras de usuario final los espectros de los fluoróforos utilizados en las mismas condiciones que el último experimento se lleva a cabo con el fin de Perf orm desmezcla espectral efectiva de las múltiples fluoróforos utilizados en el experimento final.
    Existen dos tipos principales de análisis se llevan a cabo en esta sección:
    1. Cálculo del número total de Wnt-HA-eGFP pixeles co-Localising con la membrana celular.
      1. Unmix el verde,canales rojo y azul zafiro utilizando espectros muestreados de inyecciones únicas de estos fluoróforos en el software ZEN. Guarde estas imágenes como documentos LSM separadas para su uso en todos los siguientes pasos.
      2. Abrir LSM archivos directamente en el software de edición de imágenes. Nota: Las siguientes instrucciones son para FIJI Imagen J.
      3. Guarde las imágenes LSM como documentos de secuencia de imagen, esta se dividirá automáticamente las imágenes en los canales separados.
      4. Guarde la secuencia de imágenes en la misma carpeta que los guiones para el software de análisis de secuencia de comandos que se van a utilizar para analizar los datos (ver archivos de código suplementarios para la escritura real). Nota: Las siguientes instrucciones son para Matlab.
      5. Abre el software de análisis de secuencia de comandos y abrir el directorio en el que los guiones se escriben.
      6. Introduzca el nombre del archivo que se analiza la ubicación, el software tomará el nombre de archivo y realizar el análisis.
        Nota: Los nombres de archivo leerán ImageA0000 y ImageA0001 para cada image. El software de análisis de secuencia de comandos utilizar la imagen marcada 0001 como la máscara y analizar el porcentaje de píxeles en la imagen 0000 que co-localizar con esta máscara.
      7. Tome el número porcentaje de co-localización (anotado como membrana celular poblado) y copiar esto a una hoja de cálculo. Nota: Las siguientes instrucciones son para Excel.
      8. Trazar el número porcentaje co-localización en un gráfico de barras, ya sea como un valor absoluto o relativo.
    2. Analizando el número, el tamaño y la forma de Wnt-HA-eGFP puntos lagrimales.
      1. Abrir LSM sin mezclar archivos directamente en el software de edición de imágenes. Nota: las siguientes instrucciones son para FIJI Imagen J.
      2. Dividir cada imagen en sus canales separados (Imagen> Color> canales Split).
      3. Umbral tanto la Wnt-HA-eGFP y los canales de marcadores de membrana (Imagen> Ajuste> Auto-umbral) PASO CRÍTICO:. Pruebe con un número de umbrales para ver cuál produce una imagen representativa, sin la sobreexposiciónel canal.
      4. Convertir el canal marcador de membrana a una máscara (Proceso> Binary> Crear máscara).
      5. Invertir esta máscara (Edición> Invertir).
      6. Convertir los puntos lagrimales Wnt-HA-eGFP a una máscara como anteriormente.
      7. Reste la máscara marcador de membrana de la máscara ligando-GFP (Proceso> calculadora Imagen> máscara Wnt en tapa de la caja, la máscara de membrana en el cuadro de abajo).
      8. Utilice la función de partículas analizar. Desde aquí, seleccione los parámetros necesarios y analizar los datos (partículas Analyse> Analizar).
      9. Copia el número de partículas, tamaño medio de las partículas y los datos de circularidad en una hoja de cálculo y luego trazar gráficos a partir de estos datos. Nota: Para este análisis, sólo entre partículas se analizaron 0.1-10μm 2 tamaño, no se impusieron restricciones a la circularidad de las partículas. Esta instrucción es para Excel.
  2. El análisis de la gama de la difusión ligando
    1. Abre todas las imágenes sin mezclar en im confocalenvejecimiento de software y luego exportar los archivos en un formato TIF, como datos en bruto y como una imagen RGB Nota:.. Esta instrucción es para Zen Lite 2011 PASO CRÍTICO: Incluye una barra de escala en al menos una de las imágenes para que la distancia puede ser calculado durante el análisis.
    2. Abra las imágenes para ser analizadas en el software de análisis de imágenes. Nota: Las siguientes instrucciones son para Photoshop 8.2.3) Haga clic derecho en el fondo de la imagen y seleccionar "capa de fondo ', para crear una nueva capa..
    3. Establecer los canales de marcadores de membrana a 0, por lo que sólo el canal ligando-GFP es visible (Capa> Nueva capa de ajuste> Mezclador de canales) PASO CRÍTICO:. Clip de la nueva capa de ajuste a la imagen que se está analizando, la opción de clip de la nueva capa que esta imagen está disponible como una casilla de verificación después de hacer clic en la opción de mezclador de canales.
    4. Abrir un nuevo espacio de trabajo. Ajuste la resolución de 300 píxeles por pulgada y el modo de color al color RGB (Archivo>Nuevo> Portapapeles).
    5. Copia todas las imágenes que se analiza en el único espacio de trabajo (click en la imagen y se recorta mezclador de canales mediante la celebración de control a continuación, mantenga el control y la tecla Alt y arrastre la imagen en el espacio de trabajo).
    6. Orientar todas las imágenes de modo que la longitud máxima de difusión para cada imagen puede medirse a lo largo del eje horizontal, con las células que expresan Wnt-HA-eGFP orientado hacia la izquierda.
    7. Guarde el espacio de trabajo como TIF y luego abrir este en el software de análisis de imágenes. Nota: Las siguientes instrucciones son para FIJI Imagen J.
    8. Abra la ventana del administrador de retorno de la inversión (Analizar> Herramientas> Gestor de retorno de la inversión).
    9. Dibujar un rectángulo en la primera imagen, el tamaño exacto del rectángulo se puede especificar (Seleccionar herramienta rectángulo y dibujar cualquier rectángulo> Editar> Cambios> Especificar). Nota: un tamaño de 650 x 100 píxeles longitud x anchura se utilizó en este estudio.
    10. Coloque el rectángulo en el borde mismo del dominio expresando Wnt-HA-eGFP. Coloque el rectángulo sobre la región con la distancia máxima de difusión Wnt-HA-eGFP. PASO CRÍTICO: Incluso sin el marcador de membrana de las regiones que expresan Wnt-HA- e GFP debe ser visible debido a la fluorescencia de fondo; si no entonces consultar imágenes en bruto.
    11. Cambie la caja de 10 M a la derecha. Determinar el número de micrómetros midiendo la longitud de la barra de escala incluido en una de las imágenes (Dibuja una línea trazar la barra de escala> Análisis> escala establecida). Nota: Esto proporciona un valor para 10 uM en píxeles.
    12. Añadir la casilla a la gerente de ROI pulsando el botón Agregar en la ventana de gestor de retorno de la inversión.
    13. Mover rectángulo a la siguiente imagen para medirse haciendo clic de nuevo en la herramienta de rectángulo para mover el rectángulo. Repita los pasos 8.2.10-11.
    14. Una vez que todos los paneles se han medido, seleccione multiplot en el menú administrador de retorno de la inversión (ROI gerente> Más> G. múltiple> Lista).
      Nota: los datos representan inte píxeles Wntnsity (Y) al aumentar la distancia a lo largo del eje horizontal (X, medida en píxeles). El valor de Y es la intensidad media de la señal de ligando-GFP en el punto X y el promedio se calcula a partir de todos los píxeles en el eje Y para cada valor de X. En consecuencia, el más alto de la caja, se analizarán las más píxeles para producir este promedio. Una pequeña caja (en el eje Y) será más ruidoso; una caja de altura tendrá intensidad de píxel promedio muy bajo.
    15. Copie los datos del cuadro de gráficos múltiples en una hoja de cálculo y re-etiqueta en consecuencia. Nota: Las siguientes instrucciones son para Excel.
    16. Desechar la primera 10-20μm de los datos de cada análisis, ya que representa la fluorescencia de fondo a partir de células que expresan el ligando-GFP y distorsiona los gráficos.
    17. Abre el análisis y la representación gráfica de software científico y crear un nuevo cuaderno. Nota: Las siguientes instrucciones son para Sigmaplot 13.
    18. Marque el número requerido de columnas para los datos haciendo doble clic sobre los números horizontales on la hoja de trabajo y etiquetarlos distancia en m, Wnt8a-HA-eGFP y Wnt11b-HA-eGFP.
    19. Copie los datos de la hoja de cálculo en las columnas relevantes en el análisis y la representación gráfica de software científico.
    20. Crear un gráfico de dispersión (Crear gráfico> Scatter> dispersión múltiple> Seleccione X muchos Y> Seleccione la columna de la distancia para X> Seleccione Wnt8a-HA-eGFP y Wnt11b-HA-eGFP para los valores de Y> Finalizar).
    21. Realizar un análisis de regresión de la curva Wnt8a-HA-eGFP haciendo clic izquierdo en un punto Wnt8a-HA-eGFP en el gráfico de dispersión. Todos los puntos deben resaltar. Haga clic en Análisis> Asistente de regresión.
    22. Seleccione la categoría ecuación de la curva (decaimiento exponencial) y el nombre de la ecuación (individual, 3 parámetros) a continuación, pulse siguiente.
    23. Seleccione los valores de X e Y a la que debe instalarse la curva (si los datos se destacó anteriormente, esto se debe hacer de forma automática) a continuación, pulse siguiente.
    24. Continúe con el asistente hasta que la opción de salida NuméricoLa página de s, garantizar "Crear informe" está marcada a continuación, pulse siguiente. Nota: Los parámetros de la curva ajustada se le aparecen en el Informe 1 *.
    25. En la página de opciones de gráficos garantizar "añadir ecuación para graficar título 'está marcada a continuación, pulse el final. Nota: El asistente habrá creado Informe 1 * y Gráfico 1 * pestañas en la parte superior del cuaderno. Además se han añadido la curva de la gráfica producida en (2.8.20).
    26. Repita los pasos 8.2.21-8.2.25 para ajustar una curva para Wnt11b-HA-eGFP PASO CRÍTICO:. Tratar de ajuste múltiples categorías de ecuaciones y los nombres de la ecuación a los datos. Nota: La curva con el mejor ajuste debe producir el mayor valor R 2 con la suma residual de cuadrados más bajo.

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Resultados

Confocal análisis de los explantes animales tapa expresar proteínas etiquetadas con fluorescencia proporciona un sistema eficaz para la visualización de la distribución ligando bajo diferentes condiciones experimentales. En un ejemplo, la distribución de GFP etiquetada Shh se muestra (Figura 1). En la etapa de 2 células, embriones de Xenopus se inyectan en ambas células con ya sea con un ARNm de control o con el ARNm que codifica para SULF1, una enzima que modifica el heparán sulfato de la supe...

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Discusión

Una parte esencial de este protocolo es la generación de ligandos biológicamente activos que normalmente se procesan, secretadas, y capaces de provocar una respuesta en la célula receptora, a pesar de tener un resto fluorescente adjunto. Es fundamental para establecer que el producto del gen fluorescente de etiquetado es biológicamente activa mediante un ensayo apropiado. Para Shh-GFP, la capacidad de activar la expresión de ptc1 se confirmó 16. Wnt8a tiene una capacidad notablemente potente para ind...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por un BBSRC conceder a los MEP (BB / H010297 / 1), una cuota beca BBSRC a SAR y una beca MRC a SWF.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarosaMelfordMB 1200
Acetato de amonioAmbionde Megascript SP6 Kit AM 1330
BicarbonatoVWR InternationalRC-091
Nitrato de calcioSigmaC13961
Tapa análoga (m7G(5'))Applied BiosystemsAM 8050
ChloroformSigmaC 2432
Clorhidrato de L-cisteína monohidratadoSigmaC7880
dNTPsInvitrogen18427-013
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)SigmaO3690
EtanolVWR International20821.33
Ficoll 400SigmaF 4375
Fiji image J softwareDescarga gratuita http://fiji.sc/Fiji
GentamicinaMelfordG 0124
Ácido acético glacialFisher ScientificA/0400/PB17
Cubreobjetos de vidrio, No.1.5 Suministros de laboratorio científico22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Tirador de agujas de vidrioNarishigeNarishige PC -10
Agujas de vidrioDrummond Scientific3-000-203-G/X
Gonadotropina crónica humana (HCG)Intervet
IsopropanolFisher ScientificP/7500/PB17
Cloruro de litio (LiCl)SigmaL-7026
LSM710 y Software Zen (2008-2010)Carl Zeiss
Matlab softwareMathworkshttp://uk.mathworks.com/
Agua de grado molecular Fisher ScientificBP 2819-10
Esmalte de uñas Botas Código debarras 3600530 373048
EspectrofotómetroLab.tech InternationalND-1000 / ND8000
Placa de Petri (55 mm)VWR International391-0865
Fenol-cloroformoSigmaP3803
Software PhotoshopAdobehttp://www.photoshop.com/products
ADN polimerasa de alta fidelidad y búferes BiolabsM0530S  Tampón - M0531S
Cloruro de potasio (KCl)CintaP/4280/53
SH5006MPK
Onecall QiagenS28704
Tampones de enzimas de restricciónRocheSuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
DNAse libre de ARNasaPromegaME10A
Cuchillas de acero de un solo filoPersonna66-0403-0000
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher Scientific27810.364
SP6 kit de transcripciónAmbionAM1330
Diapositivas de vidrioThermo FisherSHE 2505
Tris baseInvitrogen15504-020
Agujas de
software Zen liteCarl ZeissDescarga gratuita  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html
aislante de PVC Fisher Scientific Kit de extracción de gel tungsteno casero

Referencias

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