Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

Summary

Aquí, se presenta un protocolo para crear un cromosoma artificial bacteriano infeccioso que contiene un ADNc de longitud completa del ARN genómico de cadena positiva del virus de la encefalitis japonesa. Este protocolo se puede utilizar para construir un ADNc funcional de otros virus de ARN de cadena positiva, lo que lo convierte en una poderosa herramienta genómica para estudiar la biología del virus.

Abstract

La genética inversa, un enfoque para rescatar virus infecciosos completamente de un ADNc clonado, ha revolucionado el campo de los virus de ARN de cadena positiva, cuyos genomas tienen la misma polaridad que el ARNm celular. El sistema de genética inversa basado en ADNc es un método seminal que permite la manipulación directa del ARN genómico viral, generando así virus recombinantes para estudios moleculares y genéticos tanto de elementos de ARN viral como de productos génicos en la replicación y patogénesis viral. También proporciona una valiosa plataforma que permite el desarrollo de vacunas genéticamente definidas y vectores virales para la entrega de genes extraños. Sin embargo, para muchos virus de ARN de cadena positiva, como el virus de la encefalitis japonesa (JEV), los ADNc clonados son inestables, lo que representa un obstáculo importante para la construcción y propagación del ADNc funcional. En el presente informe se describen las consideraciones estratégicas para crear y amplificar un ADNc infeccioso JEV de longitud completa genéticamente estable como cromosoma artificial (BAC) bacteriano utilizando los siguientes procedimientos experimentales generales: aislamiento de ARN viral, síntesis de ADNc, subclonación y modificación de ADNc, ensamblaje de un ADNc de longitud completa, linealización de ADNc, in vitro Síntesis de ARN y recuperación de virus. Este protocolo proporciona una metodología general aplicable a la clonación de ADNc de longitud completa para una variedad de virus de ARN de cadena positiva, particularmente aquellos con un genoma de >10 kb de longitud, en un vector BAC, a partir del cual se pueden transcribir ARN infecciosos in vitro con una ARN polimerasa bacteriófago.

Introduction

Para virólogos de ARN, el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante a finales de 1970 hizo posible convertir genomas de ARN viral en los clones de ADNc, que luego podrían ser propagan como plásmidos en bacterias para la manipulación genética de los virus de ARN. ¹ La primera virus de ARN para ser molecularmente clonado se Qß bacteriófago, un virus de ARN de cadena positiva que infecta a Escherichia coli. Un plásmido que contiene una copia completa de ADNc del ARN genómico Qß dio lugar a fagos Qß infecciosas cuando se introduce en E. coli. ² Poco después, esta técnica se aplicó a poliovirus, un virus de ARN de cadena positiva de los seres humanos y animales. Un plásmido que lleva un ADNc de longitud completa del ARN genómico poliovirus se infecciosas cuando se transfecta en células de mamífero y capaz de producir viriones infecciosos ³ En este enfoque "DNA-puesto en marcha", los ADNc clonados deben ser transcritas intracelularmente para iniciar la replicación del ARN viral.;Sin embargo, no está claro cómo se inicia la transcripción y cómo las transcripciones se procesan a la secuencia viral correcta. Esta preocupación ha llevado al desarrollo de un "RNA-lanzado" enfoque alternativo, en el que se clona una copia completa de ADNc del genoma de ARN viral bajo un promotor reconocido por una E. coli o ARN polimerasa del fago para la producción de RNAs sintéticos in vitro con definido 5 'y 3', que se someten al ciclo de replicación viral completa cuando se introduce en células huésped. ^4,5 El primer éxito con este enfoque se informó para el virus del mosaico del bromo ^6,7, un virus de ARN de cadena positiva de las plantas. Desde entonces, el enfoque de ARN-lanzado ha sido desarrollado para una amplia gama de virus de ARN de cadena positiva, incluyendo calicivirus, flavivirus, alfavirus, arterivirus y coronavirus. ^1,4,5,8

Tanto en el ADN y ARN-lanzado sistemas de genética inversa, la construcción de un full de longitud clon de ADNc es la clave para la generación de ADN o ARN infecciosa de los virus de ARN de cadena positiva, pero se convierte en un considerable reto técnico como el tamaño de los aumentos del genoma viral. ^9-17 En particular, un gran genoma de ARN de ~ 10 -32 kb presenta tres principales obstáculos para la clonación de un ADNc funcional de cuerpo entero. ¹⁸ La primera dificultad es la síntesis de una fiel copia de ADNc, ya que la fidelidad de RT-PCR es inversamente proporcional a la longitud del ARN viral. El segundo obstáculo es la presencia de secuencias potencialmente tóxicos, ya que las moléculas de ARN largas son más propensas a contener secuencias inesperadas capaces de hacer que el fragmento de ADNc en los plásmidos inestables en E. coli. La tercera y más importante problema es la disponibilidad de un vector adecuado, ya que es difícil encontrar un vector de clonación que puede albergar un inserto de ADNc viral de> 10 kb. Durante las últimas tres décadas, estas barreras han sido superadas por varios avances en enzimología, la metodología, un. d vectorología ^1,4,5,8 De éstos, el desarrollo más prometedor e innovador es la clonación de grandes virus de ARN de cadena positiva cromosomas artificiales bacterianos (BAC como infecciosas). El vector de BAC es un plásmido de bajo copia clonación (1-2 copias / célula) basado en el E. factor de fertilidad coli, con un tamaño medio de inserto de ADN de ~ 120-350 kb ^{19 a 21} Un fragmento de ADN se inserta en el vector de BAC en una manera similar a la clonación en vectores de clonación generales.; los clones BAC resultantes son estables a lo largo de muchas generaciones en E. . coli ^22,23 Hasta la fecha, la tecnología BAC se ha utilizado para crear clones de cDNA infecciosos para> 10 miembros de tres familias de virus de ARN de cadena positiva, es decir, ^{Flaviviridae,} 24-29 de Arteriviridae, ³⁰ y Coronaviridae. ^{9,16,17 , 31,32}

El uso de virus de la encefalitis japonesa (JEV) como ejemplo, el presente trabajo presenta los procedimientos detallados que pueden serutilizado para construir un integral BAC infeccioso genéticamente estable para una variedad de virus de ARN de cadena positiva. JEV es un flavivirus zoonótica ³³ que se transmite en la naturaleza entre las aves, cerdos y otros huéspedes vertebrados por mosquitos vectores ^34,35. En los seres humanos, la infección por JEV puede causar la enfermedad neurológica encefalitis japonesa a menudo fatal grave (JE), ³⁶ que se produce en Asia y partes del Pacífico occidental, ^37,38, con una incidencia anual estimada de ~ 50,000-175,000 casos clínicos. ^39,40 El genoma de JEV es un ~ 11 kb, de sentido positivo molécula de ARN de cadena simple y consiste en termina un solo marco de lectura abierto (ORF) flanqueada por dos regiones no codificantes (NCR) en los extremos 5 'y 3'. ^41,42 El ORF codifica una poliproteína que se escinde por el anfitrión y proteasas virales para generar 10 proteínas individuales, designada C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5 en el N- a la dirección C-terminal. ^34,43,44 Además, un correoforma Xtended de NS1 (NS1) se expresa por -1 frameshifting ribosomal en los codones 8-9 de NS2A. ^45,46 De estas 11 proteínas, las tres proteínas estructurales (C, prM y E) son esenciales para la formación de infecciosa viriones, ^47,48 y los restantes ocho proteínas no estructurales (NS1 a NS5 y NS1 ') son cruciales para la replicación viral ARN, ensamblaje de partículas ^{49-51, 52-56} y evasión de la inmunidad innata. ^57-59 Tanto el 5' y 3 'NCR contienen conservan secuencias primarias y las estructuras de forma de ARN secundarias / terciarias, ^60-62, que son importantes para la modulación de la replicación del ARN viral. ^63,64

Este protocolo describe las herramientas, métodos y estrategias para la generación de un larga duración infecciosa BAC de JEV SA ₁₄ -14-2. ²⁸ Este clon BAC funcional contiene una copia completa de ADNc del ARN genómico JEV, ⁶⁵ que está rodeada por un promotor para la ARN polimerasa SP6 aguas arribadel viral extremo 5 'y un sitio de restricción Xba I único aguas abajo del extremo 3' viral para la transcripción in vitro de escorrentía. Esta tecnología BAC es aplicable a la construcción de un clon de ADNc molecular totalmente funcional para una gran variedad de virus de ARN de cadena positiva.

Protocol

Nota: La figura 1 presenta una estrategia para la construcción de un larga duración infecciosa ADNc JEV como BAC ²⁸ Tabla 1 proporciona una lista de los oligonucleótidos utilizados en este protocolo ^28..

1. Extraer el ARN viral de JEV Partículas en Cell Cultura sobrenadantes

1. Comience con el medio de cultivo celular que contiene JEV SA ₁₄ -14-2, un virus vivo vacuna contra la JE que requiere de Bioseguridad Nivel 2 de contención.
   Nota: El título viral es aproximadamente 1-3 × 10 ⁶ unidades formadoras de placa / ml.
2. Tome la formación necesaria bioseguridad para todas las prácticas estándares microbiológicos, equipos de seguridad e instalaciones de laboratorio antes de trabajar con JEV SA ₁₄ -14-2.
3. Se purifica ARN viral a partir de una alícuota del medio de cultivo celular que contiene el virus utilizando una solución monofásica de fenol y isotiocianato de guanidina ⁶⁶ (Figura 1A).
   1. Anunciod 600 l de reactivo monofásica a 200 l de sobrenadante de cultivo en un microtubo de 1,7 ml. Homogeneizar la mezcla a mano-agitando el tubo vigorosamente durante 30 sec e incubando durante 5 min a TA.
   2. Añadir 160 l de cloroformo a la muestra homogeneizada. Mezclar bien con la mano-agitar el tubo vigorosamente durante 15 segundos y dejándola durante 2-3 minutos a temperatura ambiente.
   3. Centrifugar el lisado total al 13.400 xg durante 15 min a 4 ° C, lo que resulta en una separación de dos fases líquidas, es decir, una fase orgánica inferior y una fase acuosa superior. Transferir la fase acuosa superior (menos de 200 l) que contiene el ARN a un nuevo microtubo.
   4. Precipitar el ARN mediante la adición de 1 l de 5 mg / l de glucógeno y 400 l de isopropanol al 100% e incubando durante 10 min a TA.
   5. Centrifugar la mezcla a 13.400 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante y lavar el precipitado de ARN con 1 ml de etanol al 75% en un vórtex cuatro y cincuenta y sietetiempos y centrifugación a 13.400 xg durante 5 min a 4 ° C.
   6. Seque la ARN precipitado durante 10 minutos y se disuelven en 40 l de dH ₂ O. Almacenar el ARN extraído a -80 ° C hasta su uso.

2. Sintetizar un conjunto de cuatro superposición de fragmentos de ADNc (F1 a F4) abarca el completo viral ARN genómico mediante transcripción inversa (RT) -PCR

1. Realizar una reacción de RT 20 l con una alícuota de 10 l del ARN viral purificado como una plantilla y una forma modificada del virus de la leucemia murina de Moloney la transcriptasa inversa. ⁶⁷
   1. Configurar una mezcla de 13 l que contiene 10 l de la ARN purificado, mezcla de dNTP 1 l 10 mM, 1 l 4 pmol / l imprimación y 1 l _H2Od Utilice el-primer fragmento específico para cada reacción RT: 1RT para la F1, 2RT para F2, 3RT de F3 y F4 para 4RT.
   2. Se incuba la mezcla a 65 ° C durante 5 minutos, el lugar en el hielo durante 1 minuto, y luego rápido giro para recoger el contents en la parte inferior del tubo.
   3. Añadir 4 l 5 × tampón RT, 1 l de 0,1 M de DTT, 1 inhibidor de RNasa l 40 U / l, y 1 l de 200 U / l transcriptasa inversa. Mezclar pipeteando arriba y abajo tres a cinco veces.
   4. Deje que la reacción transcurra a 50 ° C durante 1 hora, a continuación, al calor inactiva la muestra a 70 ° C durante 15 minutos. Guarde el sintetizado ADNc de primera cadena a -20 ° C hasta su uso.
2. Realizar una reacción de PCR 100 l con una alícuota de 5 l de la reacción RT inactivado por calor como una plantilla y una alta fidelidad de ADN polimerasa termoestable ⁶⁸ (Figura 1B).
   1. Configurar una reacción de PCR 100 l en hielo, que contiene 5 l de la reacción de RT, 20 l 5 × PCR buffer, 4 l mezcla de dNTP 10 mM, cebador directo 5 l 10 M, 5 l 10 mM cebador inverso, 1 l 2 U / DNA polimerasa l, y 60 l _H2Od Utilice el par de cebadores-fragmento específico para cada reactio PCRn: 1F + 1R para la F1 (2.573 pb), 2F + 2R para F2 (4171 pb), 3F + 3R para F3 (3922 pb), y 4F + 4R para F4 (1798 pb).
   2. Mezclar suavemente por el dedo de volteo el tubo de tres a cinco veces y se centrifuga brevemente para recoger su contenido en la parte inferior.
   3. Comience termociclado con una etapa de desnaturalización inicial de 30 segundos a 98 ° C, seguido de 25-30 ciclos con el siguiente perfil de PCR: 10 segundos a 98 ° C, 30 segundos a 60 ° C y 1.2 min (30 s / kb) a 72 ° C. Guarde los productos de PCR a 4 ° C hasta su análisis.
3. Ejecutar una alícuota de 2 a 5 l de cada reacción de PCR en un gel de agarosa al 0,8% que contenía 0,5 mg / ml de bromuro de etidio (EtBr) (Figura 2).
   PRECAUCIÓN: EtBr es un mutágeno potente y requiere batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes para ser usados ​​y extrema precaución para ser observado durante su uso, almacenamiento y eliminación.

3. subclone Cada uno de los cuatro fragmentos de ADNc (F1 a F4) en una tasa de alcoholemia de vectores para Crear pBAC / F1 para pBAC / F4 bTécnicas y Molecular Cloning

1. Digerir el vector e insertar ADN con dos endonucleasas de restricción apropiadas, como sigue:
   1. Realizar una digestión secuencial de pBAC / PRRSV / FL (vector), ³⁰ un derivado del plásmido pBeloBAC11 (7507 pb, número de acceso GenBank U51113), con Pme I y Not I en un volumen total de 60 l (que contiene ~ 500 ng de DNA , 10 U de la enzima, tampón de digestión 1x, y 1 × BSA) a 37 ° C 12-15 hr, que produce el fragmento vector 15.426 pb.
   2. Realizar una digestión secuencial de cada uno de los cuatro amplicones de ADNc (INSERT) con Sma I y Not I en un volumen total de 60 l (que contienen ~ 1 g de ADN, 20 U de la enzima, 1 x tampón de digestión, y 1 × BSA) a 25 ° C (Sma I) o 37 ° C (No I) para 12 hasta 15 horas, lo que da los siguientes fragmentos de inserción del tamaño deseado: F1 (2559 pb), F2 (4157 pb), F3 (3908 pb), y F4 (1784 pb).
2. Se purifica elvector deseado e insertar fragmentos de ADN mediante extracción en gel.
   1. Separar los productos digeridos doblemente en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% que contiene 0,5 mg / ml EtBr. Recorta una banda del fragmento de ADN deseado con una cantidad mínima de agarosa (normalmente ~ 200 l) bajo la luz ultravioleta de onda larga.
   2. Añadir un volumen igual de tampón TEM (10 mM Tris-Cl, EDTA 1 mM, y 10 mM de MgCl ₂₎ a la extirpado agarosa en un microtubo de 1,7 ml. Incubar la muestra a 72 ° C durante 10-15 min, con vórtex cada 2-3 min hasta que la agarosa se haya derretido por completo.
   3. Añadir un volumen igual de fenol saturado con tampón pre-calentado, vórtice vigorosamente durante 1 min, y se centrifuga a 13.400 xg durante 10 min a TA.
      Nota: La mezcla se separa en una fase orgánica inferior y una fase acuosa superior. Transferir la fase acuosa superior que contiene el DNA a un nuevo microtubo.
   4. Añadir un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1) y agitar durante 1 minuto, y centrifugar a 13,400 × g durante 10 min a TA. Pasar la fase acuosa superior a un nuevo microtubo.
   5. Añadir 0,5 l de 10 g de levadura tRNA / l, décimo volumen de 3 M de acetato de sodio y 2,5 volúmenes de etanol 100%. Mantener la mezcla en hielo durante 20 min.
   6. Centrifugar la mezcla a 13.400 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento de ADN con 1 ml de etanol al 70% en un vórtex tres a cinco veces y centrifugación a 13.400 xg durante 10 min.
   7. Aire secar el sedimento de ADN durante 10 min y se disuelven en 20 l de tampón TE (10 mM Tris-Cl y EDTA 1 mM [pH 7,6]).
3. Ligar el vector deseado e insertar fragmentos de ADN utilizando ADN ligasa de T4.
   1. Configurar una reacción de ligación que contiene 20 l de 50-100 ng del ADN del vector, un exceso molar ~ 3 veces de la inserción de ADN, 400 U de T4 DNA ligasa y 1 x tampón de ligación. Incubar la reacción de ligación a 16 ° C 12-15 hr.
      Nota: Incluya un contr negativoreacción ol, es decir, vector sólo que sin el inserto, en paralelo.
   2. Realizar cuatro ligaciones separadas, cada una de unirse al fragmento de 15.426 pb Pme I Not I de pBAC / PRRSV / FL con el 2559-pb (para la F1), 4.157 pb (para F2), 3.908 pb (para F3), o 1.784 pb (para F4) fragmento Sma I- Not I de uno de los cuatro amplicones de ADNc, para generar subclones pBAC / F1 a pBAC / F4.
4. Transformar el ADN ligado en E. coli DH10B por el método de choque -calor _CaCl2.
   1. Tome 100 alícuotas del CaCl ₂ tratados con células DH10B competentes ⁶⁹ se almacena a -80 ° C y descongelar en hielo.
      Nota: Utilice 100 l de células por transformación.
   2. Añadir una alícuota de 10 l de la reacción de ligación de ADN de 100 l de las células descongeladas en un microtubo de 1.7 ml, mezclar suavemente tocando el tubo y mantener en hielo durante 30 min.
   3. Heat-shock la mezcla de células de ADN durante 45 segundos en un 42 ° C wabaño ter, lugar en hielo durante 2 minutos, y luego añadir 900 l de caldo LB precalentado a temperatura ambiente.
   4. Se incuban las células calor conmocionado a 35 ° C durante 1 hora, con agitación a 225-250 rpm.
   5. Spread 50 a 200 l de alícuotas de las células cultivadas en placas de agar LB que contenían 10 mg / ml de cloranfenicol (LMC). Mantenga las placas a temperatura ambiente, lado derecho hacia arriba, hasta que se sequen.
   6. Gire las placas boca abajo y se incuba a 35 ° C durante 15 horas.
5. Recuperar el ADN BAC clonado de las células huésped por un método de purificación basado en columnas (Figura 1C).
   1. Recogida de seis a ocho colonias bacterianas de las placas de agar LB-CML y en ellos inocular 3 ml de caldo 2xYT que contienen 10 mg / ml CML. Incubar los cultivos a 35 ° C durante 10 h con agitación vigorosa (225-250 rpm).
   2. Aislar recombinante BAC ADN 1-1,5 ml de los cultivos bacterianos utilizando columnas de centrifugación, según lo indicado por el fabricante. ⁷⁰ eluir el ADN extraído (typicamente de 100-200 ng) en 20 l de tampón TE.
   3. Realice dos digestiones con enzimas de restricción analíticas de los BAC aislados para ~ 6 h en un volumen total de 10 l, uno para identificar la presencia del vector con un inserto correcto usando las mismas enzimas utilizadas para la clonación (véase el Protocolo 3.1), y el otro para probar la integridad de los BACs clonados con una enzima apropiada (por ejemplo, Bgl II, Nco I, Pst I o), generando un patrón de fragmentos de restricción única.
   4. Propagar la BAC clonados correctamente mediante la inoculación de 500 l de los cultivos bacterianos positivos (de Protocolo 3.5.1) en 500 ml de medio 2xYT-Cml y cultivar el inóculo durante 6 horas a 35 ° C con agitación a 225 a 250 rpm. Se purifica el ADN BAC (típicamente 10 a 20 g) a partir del cultivo 500 ml usando columnas de filtración, según lo recomendado por el fabricante. ⁷¹
      Nota: Los cuatro iniciales subclones de BAC, que contienen cada uno un fragmento de ADNc de ARN genómico JEV, puede llegar a tener sobree o mutación (s) más no deseado cuando se compara con la secuencia de consenso del genoma viral ⁴² (que sirve como una secuencia de referencia). Cualquier mutación debe ser corregido por mutagénesis dirigida basada en PCR antes del montaje de un ADNc de longitud completa JEV. ²⁷

4. Crear un ADNc de longitud completa JEV con el 5 'SP6 promotor y 3' Run-off del Sitio

1. Hacer tres modificaciones genéticas (vea abajo Protocolos 4.1.1-4.1.3) en los ADNc clonados para permitir la transcripción in vitro de escorrentía de los ARN del genoma de longitud con el auténtico 5 'y 3' del genoma viral.
   1. Introducir un promotor SP6 directamente aguas arriba del extremo 5 'del genoma viral por PCR de extensión por solapamiento (Figura 1D, pBAC / F1 ^SP6).
      1. Amplificar dos fragmentos de ADN a través de la superposición de la primera PCR estándar de pBAC / F1 con los dos pares de cebadores SP6F + SP6R (tamaño del producto, 173 pb) y F1F + F1R (producto size, 676 pb), cada uno en una reacción de 50 l que contiene 1 l de plantilla de ADN (~ 200 pg / l), 10 l 5 x tampón de PCR, 2 l mM dNTPs 10, 2.5 mu l cada una de 10 mM de avance y retroceso cebadores, 0,5 l 2 U / l de ADN ^polimerasa, 68 y 31,5 l _H2Od Realice la PCR usando el siguiente perfil de ciclos: 98 ° C durante 30 seg, y 25 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 20 seg.
      2. Gel-purificar los dos fragmentos de ADN amplificados por PCR después de ejecutar cada uno de los dos productos de PCR en un gel de bajo punto de fusión punto de agarosa al 1,5%, como se describe en el Protocolo 3.2.
      3. Fusionar los dos fragmentos de ADN purificados en gel a través de la segunda fusión de PCR usando los cebadores SP6F + F1R más externa (tamaño del producto, 821 pb) en una reacción de 100 l incluyendo 1 l cada uno de los dos fragmentos de ADN purificadas (~ 100 pg / l), 20 l 5 x tampón de PCR, 4 mM dNTPs 10 l, 5 l cada una de 10 mM de avance y retroceso cebadores, 1 mu l2 ADN U / l de ^polimerasa, 68 y 63 l _H2Od Utilice el siguiente perfil de ciclos térmicos: 98 ° C durante 30 seg, y 25 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 30 seg.
      4. Gel-purificar el amplicón PCR a partir de un fundido de bajo punto de fusión del gel de agarosa al 1%, como se describe en el Protocolo 3.2.
      5. Realizar el procedimiento de clonación de cinco pasos se describe en 3.1 a 3.5 Protocolos para ligar el fragmento Pac I- Bsi WI-760 pb de la PCR amplicón purificado en gel fusionado con el fragmento Pac I- Bsi WI-9532 pb de pBAC / F1 para generar pBAC / F1 ^SP6.
   2. Retire el pre-existente, interna sitio Xba I en el nucleótido 9131 mediante la introducción de una mutación puntual silenciosa (A ⁹¹³⁴ → T) a través de la superposición de extensión PCR (Figura 1D, pBAC / F3 ^KO).
      1. Amplificar dos fragmentos de ADN superpuestas por la primera PCR estándar de pBAC / F3 con dos pares de cebadores X1F + X1R(tamaño del producto, 746 pb) y X2F + X2R (tamaño del producto, 316 pb) en una reacción de 50 l bajo las condiciones experimentales descritas en el Protocolo 4.1.1.1.
      2. Gel-purificar los dos fragmentos de ADN amplificados por PCR después de la separación electroforética en 1,5% en geles de agarosa de bajo punto de fusión, tal como se detalla en el Protocolo 3.2.
      3. Fusionar los dos fragmentos de ADN purificados en gel a través de la segunda fusión de PCR usando los cebadores más exteriores X1F + X2R (tamaño del producto, 1.033 pb) en un 100 l de reacción bajo las condiciones experimentales descritas en el Protocolo 4.1.1.3.
      4. Gel-purificar el amplicón PCR fundido desde un bajo punto de fusión en gel de agarosa al 1%, tal como se detalla en el Protocolo 3.2.
      5. Realice el procedimiento de clonación de cinco pasos descritos en los Protocolos 3.1-3.5 para ligar el fragmento de 949 pb Avr II-Not I del PCR amplicón purificado en gel fusionado con el 16.245 bp No I- Bsi WI y 2141 pb Bsi W I - fragmentos Avr II de pBAC / F3 para producir pBAC / F3 ^KO.
   3. Ingeniero un nuevo Xba artificial I sitio de escorrentía justo aguas abajo del extremo 3 'del genoma viral mediante mutagénesis dirigida basada en PCR (Figura 1D, pBAC / F4 ^RO).
      1. Generar un fragmento de ADN mediante PCR de pBAC / F4 con los cebadores ROF + ROR (tamaño del producto, 324 pb) en una reacción de 100 l que contienen ADN molde 1 l (~ 200 pg / l), 20 l 5 x tampón de PCR, 4 l 10 mM dNTPs, 5 l cada una de 10 M adelante y atrás primers, 1 l 2 U / ADN polimerasa ^l, 68 y 64 l dH ₂ O. Realice la PCR usando el siguiente perfil de ciclos: 98 ° C durante 30 seg, y 25 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 15 seg.
      2. Gel-purificar el fragmento de ADN amplificado por PCR a partir de un bajo punto de fusión del gel de agarosa al 1%, como se detalla en el Protocolo 3.2.
      3. Realice el procedimiento de clonación de cinco pasos descritos en los Protocolos 03.01 a 03.05 para ligar el 283-bp Sfi I Not I fragmento de la amplificación de PCR purificado en gel con el fragmento de 16.933 pb Sfi I Not I de pBAC / F4 para crear pBAC / F4 ^RO.
2. Prepare un conjunto de los cuatro modificado, la superposición de ADNc en un solo de larga duración SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14-2) uniéndose a los tres sitios de restricción física (GI Bsr, Bam HI, y Ava I ) de una manera secuencial usando la clonación procedimientos detallados en los protocolos de cinco pasos 03/01 a 03/05 (Figura 1E): F1 ^SP6 → F1 F2 ^SP6 (reemplazando el fragmento Bsr G I- Not I de pBAC / F1 ^SP6 con la de pBAC / F2) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO (reemplazando el fragmento Bam H I- Not I de pBAC / F1 F2 ^SP6 con la de pBAC / F3 ^KO) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO F4 ^{RO (reemplazando} el fragmento Ava I- Not I de pBAC / F1 ^SP6 F2F3 ^KO con la de pBAC / F4 ^RO).

5. Prepare una alta pureza Maxi-prep de la integral SA ₁₄ -14-2 BAC

1. Crecer una sola colonia de E. coli DH10B llevar pBAC / SA ₁₄ -14-2 en 3 ml de caldo 2xYT que contiene 10 mg / ml para Cml 10 horas a 35 ° C con agitación a 225-250 rpm, y luego ampliar mediante la inoculación de 500 l de la 10 hr cultivo bacteriano en 500 ml de medio 2xYT-CML y cultivar el inóculo durante 6 horas a 35 ° C con agitación vigorosa.
2. Centrifugar el cultivo bacteriano en dos 250 ml botellas a 3107 × g durante 15 min a 4 ° C. Resuspender cada sedimento en 30 ml de solución GTE (glucosa 50 mM, 25 mM Tris-Cl, y EDTA 10 mM [pH 8,0]), y luego añadir 500 l de 60 mg / ml de lisozima. Se incuban las dos suspensiones de células en hielo durante 10 min.
3. Añadir 60 ml de solución de lisis recién hecho (0,2 N NaOH y 1% SDS) a cada suspensión celular, mezclar bien hasta que se aclare, y mantener a los lisadosa TA durante 10 min.
4. Añadir 45 ml de solución de neutralización (100 ml, que consta de 60 ml 5 M de acetato de potasio, 11,5 ml de ácido acético glacial y 28,5 ml dH ₂ O) a cada botella, mezclar bien por inversión de las botellas, y se incuban los lisados ​​neutralizados en el hielo durante 10 min.
5. Centrifugar los lisados ​​neutralizados en 18.566 × g durante 20 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante de las dos botellas en dos nuevas botellas 250 ml; añadir 0,6 volúmenes de isopropanol al 100% a cada uno, y mantenerlos en hielo durante 20 min.
6. Centrifugar los precipitados a 18.566 × g durante 20 min a 4 ° C. Disolver cada sedimento en 5 ml de tampón TE, combinarlos en un tubo de 50 ml (10 ml total), y precipitar el ARN mediante la adición de un volumen igual de 5 M de cloruro de litio. Se incuba la mezcla en hielo durante 10 min.
7. Centrifugar el precipitado de ARN en 14.636 × g durante 20 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo 250 ml y se precipita el ADN mediante la adición de 2 volúmenes de 100% de isopropanol.Se incuba la mezcla en hielo durante 20 min.
8. Centrifugar el precipitado de ADN en 18.566 × g durante 20 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante, resuspender el sedimento de ADN en 9,5 ml de tampón TE (pH 7,6), y añadir 10 g de cloruro de cesio (CsCl) y 390 l de 10 mg / ml EtBr.
9. Cargar la solución de ADN-CsCl-EtBr en un tubo de polipropileno de 16 x 76 mm sellable utilizando una jeringa equipada con una aguja de 18 G. Haga girar el gradiente de CsCl sellado en una ultracentrífuga a 401.700 xg durante 16 horas a 20 ° C (Figura 3).
10. Se recoge una banda de ADN del plásmido BAC a partir del gradiente de CsCl usando un aguja 18 G para crear una salida de aire en la parte superior del gradiente y un 20 G jeringa con la aguja equipada para recuperar el ADN de BAC desde el lado de la pendiente.
11. Añadir 2,5 volúmenes de dH ₂ O-butanol saturado de la muestra de ADN BAC teñido con EtBr y mezclar mediante agitación. Centrifugar la mezcla a 13.400 xg durante 1 min y transferir la fase acuosa inferior a un nuevo 1,7 ml microtube. Repita este procedimiento en seis ocasiones.
12. Precipitar el ADN BAC EtBr libre mediante la adición de 1/10 volumen de 3 M de acetato de sodio y 2,5 volúmenes de etanol 100% al ADN BAC-butanol extraído e incubando durante 10 min en hielo. Centrifugar el precipitado a 13.400 xg durante 10 min, se lava el sedimento de ADN con 1 ml de etanol 70%, y volver a sedimentar por centrifugación.
13. Aire secar el sedimento de ADN durante 10 min y se disuelven en 200 l de tampón TE (pH 7,6).
    Nota: La figura 4 muestra una visión general del sistema de genética inversa para JEV SA ₁₄ -14-2.

6. Transcribir los ARN sintéticos in vitro a partir de una longitud completa de ADN JEV BAC Linearizado

1. Realice una gran escala la digestión con enzimas de restricción de pBAC / SA ₁₄ -14-2 con Xba I en un volumen total de 100 l (que contienen 3 g de ADN, 60 U de la enzima, 1 x tampón de digestión, y 1 × BSA) a 37 ° C durante 12-15 horas. Examine una alícuota de 3 l de la digestion reacción en un gel de agarosa al 0,8% que contiene 0,5 g / ml EtBr.
2. Incubar la reacción de digestión adicionalmente con 25 U de nucleasa de judía mung (MBN) a 30 ° C durante 2 horas (Figura 4A).
3. Llevar el volumen de la, muestra tratada con MBN digerido con Xba hasta 300 l con dH ₂ O. Añadir un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1) para la muestra diluida, vórtice vigorosamente durante 1 min, giran a 13.400 × g durante 10 min, y luego transferir la fase acuosa superior a un nuevo 1,7 ml microtubo. Añadir un volumen igual de cloroformo y repita el procedimiento de extracción.
4. Recuperar el fenol / cloroformo extraído-, BAC linealizado mediante precipitación con etanol: Añadir 1/10 de volumen de 3 M de acetato de sodio y 2,5 volúmenes de etanol al 100%, y se incuba en hielo durante 20 min. Centrifugar el precipitado a 13.400 xg durante 10 min, se lava el sedimento de ADN con 1 ml de etanol al 70%, y luego girar hacia abajo por la re-centrifugación.
5. Aire secar la pelle ADNt durante 10 minutos y se disuelven en 30 l de dH ₂ O. Examinar una alícuota de 1 l de la BAC recuperado en un gel de agarosa al 0,8% con 0,5 mg / ml EtBr (Figura 5A).
6. Realice una transcripción escorrentía del BAC ADN linealizado en un volumen total de 25 l (que contienen ~ 200 ng plantilla de ADN, 0,8 mM analógico tapa [m ⁷ G (5 ') ppp (5') A], 1 mM rNTPs, 40 inhibidor de RNasa U, 20 U SP6 ARN polimerasa, ⁷² y 1 × tampón de transcripción) a 37 ° C durante 1 hr (Figura 4B). Incluir 0,5 M ^[3 H] UTP para la cuantificación del ARN sobre la base de ^[3 H] UTP incorporación, tal como se comprueba por adsorción a papel de filtro DE-81. ⁶⁹
7. Ejecutar una alícuota de 1 a 2 l de la reacción de transcripción escorrentía en un gel de agarosa al 0,6% que contiene 0,5 mg / ml EtBr (Figura 5B).

7. Determinar ARN infectividad y Rendimiento Virus

1. Cultivar células BHK-21 en 150 mm culture platos a una densidad de 3 x 10 ⁶ células / placa durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO _2.
   Nota: mantener las células BHK-21 en medio esencial mínimo alfa suplementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, vitaminas y penicilina / estreptomicina.
2. Enjuague la monocapa de células con 10 ml de solución fría A (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na ₂ HPO _4, y 1,5 mM KH ₂ PO _4). Separar las células de los platos por tratamiento con 4 ml de tripsina-EDTA (0,25%), y recogerlas por centrifugación a 270 xg en una centrífuga de sobremesa durante 2 min.
3. Resuspender el sedimento celular con 50 ml de solución fría A en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar la suspensión de células a 270 xg durante 2 min. Repita este procedimiento de lavado tres veces; después del último lavado, resuspender el botón celular a una densidad de 2 x 10 ⁷ células / ml en Sol A.
4. Mezcle una parte alícuota de 400 l de suspensión celular con 2 μg de ARN sintético en una cubeta de hueco de 2 mm, y rápidamente electroporar la mezcla con un electroporador en condiciones óptimas de electroporación: longitud 980 V, 99 microsegundos pulso y 5 pulsos (Figura 4C).
   Nota: Utilice el ³ H-etiquetados ARN sintetizado en el Protocolo 6.5 directamente para la electroporación sin purificación adicional.
5. Deje las células electroporadas a TA durante 10 min y transferir a un microtubo de 1,7 ml que contenía 600 l de medio de cultivo completo.
6. Preparar una dilución en serie de 10 veces de las células electroporadas en 1 ml de medio de cultivo completo y la placa una alícuota de 100 l de cada dilución en las monocapas de células BHK-21 unelectroporated (5 × 10 ⁵⁾ en una placa de 6 pocillos.
7. Después de 4-6 horas de incubación, superponer las células con 0,5% de agarosa en medio esencial mínimo que contenía suero bovino fetal al 10%. Las placas se incuban durante 4 días a 37 ° C con 5% de CO _2.
8. Visualice el centro infecciosas (placas) por fijación con 7% de formaldehído y tinción con cristal violeta al 1% en 5% de etanol ²⁷ (Figura 6a).
   1. Opcional: Examine las células de ARN-electroporación en 18 a 20 horas después de la transfección de JEV expresión de la proteína mediante ensayos de inmunofluorescencia ^27,73 (Figura 6B), y la cosecha de los sobrenadantes de las células de ARN-electroporación a las 22 y 40 horas después de la transfección para el virus titulación por ensayos de placa ^27,63 (Figura 6C).

Results

Para todos los virus de ARN de cadena positiva, la fiabilidad y la eficiencia de un sistema de genética inversa dependen de la estabilidad genética de un ADNc de longitud completa clonado, cuya secuencia es equivalente a la secuencia consenso de ARN genómico viral. ²⁷ La figura 1 muestra un anillo de cinco estrategia de paso para la construcción de un cDNA infeccioso de longitud completa como un BAC para JEV SA ₁₄ -14-2 ^28: Paso 1, la purificación de ARN viral a partir del sobrenadante de cultivo celular de células BHK-21 infectadas por el JEV (Figura 1A); Paso 2, la síntesis de cuatro amplicones de ADNc superpuestas (F1 a F4) que abarcan todo el genoma viral (Figura 1B); Paso 3, la subclonación de cada uno de los cuatro fragmentos de ADNc contiguas en un vector BAC, creando pBAC / F1 a pBAC / F4 (Figura 1C); Paso 4, la modificación de los ADNc clonados para la transcripción in vitro el escurrimiento con SP6 ARN polimerasa, es decir, la colocación de un SP6secuencia del promotor inmediatamente corriente arriba del extremo 5 'viral (pBAC / F1 ^SP6), la eliminación de una pre-existente sitio interno Xba I en el nucleótido 9131 mediante la introducción de una mutación puntual silenciosa, A ⁹¹³⁴ → T (pBAC / F3 ^KO), y la inserción de un sitio de escorrentía nueva Xba artificial inmediatamente aguas abajo de la viral extremo 3 '(pBAC / F4 ^RO) (Figura 1 D); y el Paso 5, el montaje de un álbum SA ₁₄ -14-2 ADNc BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2 (Figura 1E) Tabla. 1 se enumeran los oligonucleótidos utilizados en este procedimiento de clonación. ²⁸

Para la construcción de un ADNc JEV funcional, el primer paso importante es la síntesis de los cuatro fragmentos de ADNc solapados utilizando el ARN viral purificado como molde para la RT-PCR. La Figura 2 proporciona un resultado representativo para los cuatro productos de RT-PCR que eran electroforesis en un 0,8%gel de agarosa. Este gel demuestra claramente que un ADNc de longitud completa JEV se amplifica en cuatro fragmentos de ADNc que se solapan. Ocasionalmente, las reacciones de RT-PCR podrían producir uno o más productos específicos del virus o no específicos que son en su mayoría más pequeño que el producto esperado, debido a la hibridación no específica de los cebadores durante la síntesis de ADNc / amplificación. Por otro lado, poca o ninguna espera que el producto de RT-PCR se amplificó debido a la contaminación accidental RNasa durante el aislamiento de ARN viral o impropio rendimiento RT-PCR.

El siguiente paso clave es la clonación y la modificación de una de longitud completa parcial- o ADNc JEV en BAC, que es un procedimiento relativamente sencillo que utiliza técnicas estándar de ADN recombinante. ⁶⁹ Figura 3 presenta un resultado representativo para la purificación del clon BAC que contiene un ADNc de longitud completa de JEV SA ₁₄ -14-2 por bandas en un gradiente de CsCl-EtBr.En este experimento, después de centrifugación durante 16 horas a 401.700 xg, dos bandas distintas, es decir, el E. coli ADN cromosómico anterior y el plásmido de ADN superenrollado BAC a continuación, son visibles en el centro del tubo bajo luz ultravioleta de onda larga. Un volumen mínimo (~ 400 l) de la banda de ADN BAC inferior se recogió cuidadosamente por hacer un agujero con una jeringa en el lado del tubo. Posteriormente, el EtBr se extrajo a partir del ADN de BAC por extracción butanol, y el ADN BAC-EtBr libre se concentró por precipitación con etanol.

El paso final es la determinación de la infectividad específica de los RNAs sintéticos transcritas in vitro a partir de longitud completa SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14-2) después de transfección de ARN en las células permisivas (Figura 4). Este paso consiste en tres pasos secuenciales: Paso 1, linealización de los de larga duración SA ₁₄ -14-2 cDNA en el 3 '-end del genoma viral (Figura 4A); Paso 2, la producción de los ARN sintéticos a partir del ADNc linealizado por escorrentía de transcripción (Figura 4B); y el Paso 3, rescate de los virus recombinantes en células BHK-21 transfectadas con los ARN sintéticos (Figura 4C). Experimentalmente, dos clones independientes de pBAC / SA ₁₄ -14-2 fueron linealizados con la digestión XbaI y tratados con MBN para quitar los cuatro-base 5 'saliente generado por la digestión XbaI. Los BAC linealizadas se limpiaron mediante extracción con fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol. La linealización de los dos BAC purificados se demostró en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 5A). La extracción con fenol-cloroformo debe hacerse con cuidado para asegurarse de que la BAC linealizadas son RNasa libre. Cada uno de los dos BAC linealizadas sirvió como molde de ADNc para la transcripción run-off usando SP6 RNA polimerasa en presencia de la m ⁷ G (5 ') ppp (5') Un análogo de tapa. La integridad de los ARN sintéticos se demostró mediante la ejecución de partes alícuotas de las dos mezclas de reacción de transcripción en un gel de agarosa al 0,6%, junto con una referencia 1 kb escalera de ADN (Figura 5B). En este sencillo ensayo, la banda principal de ARN prominente siempre migra justo por debajo de los 3 kb referencia banda de ADN y que parecía ser agudo. Sin embargo, la degradación de ARN tendría una apariencia manchada en el mismo gel.

Un ensayo de centro infeccioso es el estándar de oro para determinar la infectividad específica de los ARN sintéticos. Este ensayo se realizó por electroporación células BHK-21 con muestras de ARN, la siembra de la igualdad de alícuotas de las 10 veces las células diluidas en serie a electroporación en placas de 6 pocillos que contienen células ingenuas BHK-21 (3 × 10 ⁵ células / pocillo), y la superposición de agarosa sobre las monocapas de células. Después de la incubación durante 4 días, las células supervivientes se fijaron con formaldehído y se tiñeron con cristal violeta s unaolución para cuantificar el número de centros infecciosas (placas), que corresponde al número de moléculas de ARN infecciosos entregado en las células (Figura 6A). Puesto que el molde de cDNA usado para la transcripción in vitro se ha demostrado ser no infecciosa, ²⁷ una parte alícuota de la mezcla de reacción de transcripción se usó directamente para la electroporación. La electroporación es el método preferido para la transfección de ARN; Alternativamente, los ARN se pueden transfectar por otros métodos que utilizan liposomas DEAE-dextrano y catiónicos. RNA electroporación es muy eficaz, pero "arco" del pulso eléctrico se produce raramente, si sales están presentes en la reacción de electroporación o si la cubeta de electroporación se reutiliza. La expresión de proteínas virales en las células transfectadas con ARN se examinó mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando un antisuero de conejo anti-NS1 (Figura 6B). La producción de partículas virales acumulados en los sobrenadantes de células transfectadas con ARN fue unaalyzed por ensayos de placa (Figura 6C). Los resultados de estos experimentos muestran claramente que los RNAs sintéticos derivados de cDNA son infecciosos en células permisivas BHK-21, generando un alto título de virus recombinantes.

Oligonucleótido	Secuencia A (5 'a 3')	Posición b	Polaridad
1RT	TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT	2578-2603	Antisentido
1F	aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT	1.22	Sentido
1R	attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT	2532-2553	Antisentido
2RT	TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA	5975-6000	HormigaIntuyo
2F	aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT	1800-1821	Sentido
2R	attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC	5929-5950	Antisentido
3RT	ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT	9426-9451	Antisentido
3F	aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT	5500-5521	Sentido
3R	attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT	9380-9401	Antisentido
4RT	AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA	10952-10977	Antisentido
4F	aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA	9200-9221	Sentido
4R	attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC	10.956 a 10977	Antisentido
SP6F	cataccccgcgtattcccac ejército de reserva		Sentido
SP6R	ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa	01.14	Antisentido
F1F	aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG	1-17	Sentido
F1R	TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA	638-662	Antisentido
X1F	CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG	8403-8427	Sentido
X1R	AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC	9120-9148	Antisentido
X2F	GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT	9120-9148	Sentido
X2R	cacgtggacgagggcatgcc tgcag		Antisentido
ROF	CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC	10670 hasta 10694	Sentido
ROR	agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC	10954 hasta 10.977	Antisentido
unas secuencias JEV se muestran en letras mayúsculas, y las secuencias de BAC se indican en letras minúsculas. posición b nucleótidos se refiere a la secuencia completa del genoma de JEV SA 14 -14-2 (número de acceso GenBank JN604986).

Tabla 1: Los oligonucleótidos utilizados para la síntesis de ADNc, amplificación por PCR, y mutagénesis de BAC.

Figura 1.0; Estrategia para la construcción de un ADNc de longitud completa de JEV SA ₁₄ -14-2 como BAC (A) Aislamiento de ARN viral de partículas JEV.. Se muestra un diagrama esquemático del ARN genómico de JEV SA ₁₄ -14-2. (B) Síntesis de cuatro fragmentos de ADNc superpuestas (F1 a F4) que cubre la totalidad del genoma viral. (C) Subclonación de cuatro fragmentos de ADNc solapados en un vector BAC, creando pBAC / F1 a pBAC / F4. (D) La modificación de los ADNc clonados para la transcripción de escorrentía in vitro. pBAC / F1 ^SP6 es un derivado de pBAC / F1 que contiene la secuencia del promotor SP6 aguas arriba del extremo 5 'viral. pBAC / F3 ^KO es un derivado de pBAC / F3 que contiene una mutación silenciosa punto (A → T ^9134, asterisco). pBAC / F4 ^RO es un derivado de pBAC / F4 que contiene un sitio Xba I artificial escorrentía de aguas abajo del extremo 3 'viral. (E strong>) Asamblea de un álbum SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14-2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Síntesis de cuatro fragmentos de ADNc superpuestas (F1 a F4) que abarca la longitud completa de ARN genómico de JEV SA ₁₄ -14-2. Los cuatro productos de RT-PCR se evaluaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. M, escalera de ADN de 1 kb. Los tamaños esperados de los cuatro fragmentos de ADNc se indican en la parte inferior de la imagen de gel. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. La purificación del BAC que contiene un ADNc de longitud completa de JEV SA ₁₄ -14-2. El plásmido BAC está aislado de E. coli DH10B por el método de lisis alcalina y SDS-purificó adicionalmente por bandas en un gradiente de CsCl-EtBr. Se presenta un ejemplo de la gradiente de CsCl-EtBr usando un tubo de polipropileno sellable 16 × 76 mm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Visión general de la recuperación de los virus infecciosos de un álbum JEV SA ₁₄ -14-2 ADNc montado en un BAC. (A) Linealización de la plantilla de cDNA. La larga duración JEV BAC se corta conXba I y se trató con MBN. (B) Síntesis de los transcritos de ARN. El ADNc linealizado se transcribe por la ARN polimerasa SP6 en presencia del ⁷ m G (5 ') ppp (5') Un análogo de tapa. (C) La recuperación de la JEVs sintético. Los in vitro ARN transcritos se transfectaron en células BHK-21 mediante electroporación, que genera un alto título de virus sintético. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Síntesis de los ARN por transcripción in vitro utilizando un JEV BAC de longitud completa como una plantilla de ADNc. (A) Generación de los de larga duración linealizado JEV BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2. Dos clones independientes de pBAC/ SA ₁₄ -14-2 (CL.1 y CL.2) se linealizadas por digestión con Xba I y posterior tratamiento con MBN. Los BAC linealizadas se examinan por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. (B) Producción de los ARN sintéticos mediante transcripción escorrentía. Cada uno de los dos BAC linealizadas se usa como una plantilla para la transcripción de ARN polimerasa SP6 escorrentía. Las alícuotas de las dos reacciones de transcripción se ejecutan en un gel de agarosa al 0,6%. M, 1 kb escalera del ADN. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. infectividad específica de los RNAs sintéticos transcritos a partir de un BAC JEV de longitud completa y la recuperación de virus sintético. Células BHK-21 son de forma simulada a electroporación (Mock) o electroporación con los transcritos de ARN derivados from cada uno de los dos clones independientes de los de larga duración JEV BAC (CL.1 y CL.2). (A) la infectividad del ARN. Las células se recubrieron con agarosa y se tiñeron con violeta cristal a los 4 días después de la transfección. RNA infectividad se determina mediante ensayos de centro infecciosas para estimar la cantidad de ARN infecciosa electroporación en las células (panel izquierdo). Además, se muestran imágenes representativas de centros infecciosos (panel derecho). (B) Expresión de proteínas. Las células se cultivan en portaobjetos de cámara de 4 pocillos. Expresión de la proteína viral en células de ARN-a electroporación en 20 horas después de la transfección (hpt) se analizó mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando un antisuero de conejo anti-NS1 primaria y una cabra conjugado con Cy3 secundario IgG anti-conejo (rojo). Los núcleos se contratiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (azul). Las imágenes de inmunofluorescencia se superponen en sus diferenciales correspondientes imágenes de contraste de interferencia. (C) de rendimiento Virus. Las células se cultivaron en 150 mm cultura platos. La producción de viriones infecciosos acumulados en los sobrenadantes de cultivo de células de ARN-electroporación en 22 y 40 hpt es examinado por ensayos de placa. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El protocolo actual ha sido utilizado con éxito para generar de larga duración clones de cDNA infecciosos para dos cepas diferentes (CNU / LP2 ²⁷ y SA ₁₄ -14-2 ²⁸⁾ de JEV, un flavivirus cuyo cDNA funcional ha demostrado ser inherentemente difícil de construir y propagar debido a la toxicidad de la célula huésped y la inestabilidad genética del cDNA clonado ^8,74-76 Este protocolo implica tres componentes principales:. primeros, maximizando la síntesis / amplificación de una copia de ADNc fieles de la ARN viral de alta fidelidad utilizando transcriptasa inversa / ADN polimerasa; segundo, la clonación de la región viral prM-E de codificación que contiene secuencias tóxicas (datos no publicados) ^74,77,78 en un muy bajo número de copias del vector BAC a partir del ADNc inicial subclonación a las de longitud completa pasos finales de montaje cDNA; y tercero, la utilización de un BAC vector de clonación que puede acomodar un ADN extraño con un tamaño medio de 120 a 350 ^kb, 19-21 que aparentemente tolera más grande inse DNArts que hacen otros vectores de clonación. Este enfoque de clonación será generalmente aplicable a muchos otros virus de ARN de cadena positiva, particularmente aquellos con un gran genoma de ARN de ~ 10 a 32 kb. Generación de un clon de cDNA infeccioso es un paso clave en el desarrollo de un sistema de genética inversa para los virus de ARN, especialmente para los virus de ARN de cadena positiva, porque su genoma actúa como ARNm viral que se traduce en proteínas por los ribosomas de la célula huésped. Por lo tanto, la replicación viral puede ser iniciado por la introducción de un genoma de ARN de longitud molécula de ADNc derivado en una célula huésped susceptible. La disponibilidad de un clon de ADNc infeccioso JEV, cuando se combina con la tecnología de ADN recombinante, se ha incrementado nuestra comprensión de los diversos aspectos del ciclo de vida viral a nivel molecular, tales como la expresión génica y la replicación del genoma ^{73,79. 63,64} Además, una ADNc de longitud completa JEV clon ha demostrado ser una herramienta valiosa para el desarrollo de vacunas antivirales ²⁸ y vectores de suministro de genes. ^80,81

Al igual que con todos los virus de ARN de cadena positiva, hay múltiples pasos críticos en la construcción de un ADNc funcional confiable para JEV partir de la cual RNAs altamente infecciosas se pueden sintetizar in vitro. Idealmente, la secuencia de los ARN sintéticos transcritos a partir de un clon del ADNc de longitud completa debe ser idéntica a la del ARN genómico viral, en particular los 5'-y 3'-terminales secuencias que se requieren para la iniciación de la replicación viral RNA . ^{de 60-62} En el protocolo actual, el auténtico 5'-y 3'-extremos se aseguraron mediante la colocación de la secuencia del promotor SP6 aguas arriba de la primera de nucleótidos de adenina del genoma viral y el posicionamiento de un sitio artificial única restricción Xba I aguas abajo de la última timina nucleótidos del genoma viral, respectivamente. Capsulado RNAs sintéticos con el auténtico 5 'y 3' se produjeron mediante transcripción run-off de un cDNA te Xba I-linealizado y tratado con MBNmplate usando SP6 ARN polimerasa cebada con la m ⁷ G (5 ') ppp (5') Un análogo de tapa. Este protocolo puede ser modificado de varias maneras. Para la transcripción in vitro, otro ARN del bacteriófago polimerasa (por ejemplo, T3 o T7) se puede utilizar en conjunción con su secuencia promotora bien definido. ²⁷ Como un sitio run-off, un sitio de restricción diferente se puede utilizar si no está presente en el genoma viral y si ARN sintético a partir del ADNc linealizado termina con el final auténtico 3 '. La importancia de la secuencia de nucleótidos del extremo 3 'se ha demostrado por una disminución de ~ 10 veces en la infectividad del ARN cuando un ARN sintético contiene tres o cuatro nucleótidos-virus no relacionado en su extremo 3'. ²⁷ En una reacción de transcripción in vitro, tanto la m ⁷ G (5 ') ppp (5') A y m ⁷ G (5 ') ppp (5') G analógico tapa puede ser utilizado igualmente bien, aunque los últimos lugares una relación G nucleótidos extra de aguas arriba de la viral 5 '-end, pero queAdemás no altera la infectividad o replicación del ARN sintético. ²⁷ Por otra parte, la eliminación de la plantilla de ADNc a partir de los transcritos de ARN por digestión con DNasa I no es necesario para las pruebas de ARN de infectividad, porque la plantilla de cDNA en sí no es infecciosa. ²⁷

La tecnología BAC ahora se ha aplicado a la construcción de clones de cDNA infecciosos para un puñado de virus de ARN de cadena positiva, a saber, dos JEVs, CNU / LP2 ²⁷ y SA ₁₄ -14-2 ²⁸ (tamaño del genoma, ~ 11 kb); dos virus del dengue, BR / 90 ²⁶ y NGC ²⁹ (~ 11 kb); la diarrea viral bovina virus, SD1 (~ 12 kb); ²⁵ de dos virus de la peste porcina clásica, C y Paderborn (~ 12 kb); ²⁴ el virus de la enfermedad de fronteras, Gifhorn (~ 12 kb); ²⁴ el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); ³⁰ el virus de la gastroenteritis transmisible, PUR46-MAD (~ 29 kb); ¹⁶ el virus de la peritonitis infecciosa felina,DF-2 (~ 29 kb); ³² el síndrome severo coronavirus respiratorio agudo, Urbani (~ 30 kb); ⁹ el síndrome respiratorio coronavirus Oriente Medio, EMC / 2012 (~ 30 kb); ^{17 y el} coronavirus humano OC43 (~ 31 kb) ³¹ La principal ventaja de usar BAC para la construcción de ADNc es la alta estabilidad genética de los grandes, plásmidos BAC de 1 o 2 copias.; sin embargo, la naturaleza intrínseca de su número extremadamente bajo de copia es también una gran desventaja, debido a muy bajos rendimientos de ADN BAC y la consiguiente reducción en la pureza del ADN de BAC con respecto a la sede de ADN cromosómico. En el protocolo actual, el rendimiento de ADN de BAC se maximiza por el crecimiento de E. coli DH10B transformó con el pBAC BAC infeccioso / SA ₁₄ -14-2 en un medio rico en nutrientes, 2xYT. A pesar de este esfuerzo, el rendimiento promedio es de sólo ~ 15 g de ADN BAC a partir de 500 ml de caldo 2xYT. Además, la pureza del ADN de BAC se logra mejor mediante el uso de CsCl-EtBr centrifugación en gradiente de densidad para la purificación, En lugar del plásmido aislamiento basado en columnas de uso común. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la E. BAC-transformado coli no debe crecer demasiado, ya que podría poner en peligro la estabilidad genética del cDNA clonado, y un mayor crecimiento no necesariamente conducir a mayores rendimientos o ADN BAC de mayor pureza.

El protocolo descrito aquí es un optimizado, y el método aerodinámico eficiente para la construcción y propagación de una larga duración cDNA clon infeccioso genéticamente estable como un BAC de JEV, un procedimiento, una vez pensó prácticamente imposible. Esta misma estrategia de clonación se puede aplicar también a muchos otros virus de ARN de cadena positiva. En general, los clones de ADNc infecciosos nos permiten introducir una variedad de mutaciones (por ejemplo, deleciones, inserciones, y mutaciones puntuales) en un genoma de ARN viral para estudiar sus funciones biológicas en la replicación viral y la patogénesis. Este sistema de genética inversa basada en cDNA hace que sea posible desarrollar y TESt vacuna y candidatos terapéuticos dirigidos a un factor de virulencia (s) de un virus de ARN de cadena positiva particular de interés. Además, esta tecnología cDNA infeccioso también puede ser utilizado como un vector viral, capaz de expresar un gen extraño (s) de interés para muchas aplicaciones en la investigación biomédica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Clonación molecular
2xYT Caldo	Sigma-Aldrich	Y2377
[3H]UTP	PerkinElmer	NET380250UC	Radioactivo
50 ml Tubo	Thermo Scientific (Nalgene)	3114-0050
Botella de 250 ml	Beckman Coulter	356011
Agarosa	Lonza	50004
Agarosa (bajo punto de fusión)	Life Technologies (Invitrogen)	16520-100
AvaI	New England BioLabs	R0152S
AvrII	New England BioLabs	R0174S
BamHI	New England BioLabs	R0136S
BsiWI	New England BioLabs	R0553S
BsrGI	New Inglaterra BioLabs	R0575S
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Cloruro de cesio	Fisher Scientific	BP1595-1
Cloranfenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Cloroformo	Sigma-Aldrich	C2432
Papel de filtro DE-81	GE Healthcare Life Sciences	3658-023
dNTP mix	Life Technologies (Invitrogen)	18427-088
E. coli DH10B	Life Technologies (Invitrogen)	18297-010
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Bromuro de etidio	Sigma-Aldrich	E7637	tóxica y altamente mutagénica
(Kit de Maxiprep de plásmido)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-26
Ácido acético glacial	Sigma-Aldrich	A6283	Glucosa irritante
	Sigma-Aldrich	G5400
Glucógeno	Roche	10901393001
ADN polimerasa de alta fidelidad	New England BioLabs	M0491S
Isoamyl Alcohol	Sigma-Aldrich	I9392
Isopropanol inflamable	Amresco	0918
Caldo LB	Life Technologies (Invitrogen)	12795-027
Cloruro de litio	Sigma-Aldrich	L9650
Lisozyme	Amresco	0663
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
M-MLV Transcripcióna inversa	Life Technologies (Invitrogen)	18080-044
Nucleasa de frijol mungo	New England BioLabs	M0250S
Aguja (18G, 20G)	BD	305196, 305175	Biopeligroso (residuos punzantes)
NotI	New England BioLabs	R0189S Tecnologías de
ADN integrado	de oligonucleótidos	Síntesis
PacI	New England BioLabs	R0547S
pBeloBAC11	Nueva Inglaterra BioLabs	ER2420S (E4154S)
Fenol (saturado con tampón)	Life Technologies (Invitrogen)	15513-039	Tóxico y altamente corrosivo
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico	Life Technologies (Invitrogen)	15593-031	Tóxico y altamente corrosivo
Fenol:Guanidina Isotiocianato	Life Technologies (Ambion)	10296-010	Tóxico, corrosivo e irritante
Pme I	New England BioLabs	R0560S
Acetato de potasio	Amresco	0698
Inhibidor de ARNasa	Life Technologies (Invitrogen)	10777-019
rNTP Set	GE Healthcare Life Sciences	27-2025-01
Tubo de polipropileno sellable (16 y veces; 76 mm)& nbsp;	Beckman Coulter	342413
SfiI	New England BioLabs	R0123S
Sma I	New England BioLabs	R0141S
Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	S2889
Dodecil sulfato de sodio	Amresco	0227
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	S5881
SP6 ARN polimerasa	New England BioLabs	M0207S
plásmidos)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-11
Jeringa	HSW NORM-JECT	4200.000V0
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S
Tris	Amresco	0826
tRNA (levadura)	Life Technologies (Invitrogen)	15401-011
XbaI	New England BioLabs	R0145S
Nombre	Company	Número de catálogo	Comments
2. Cultivo celular
Alfa Minimal Essential	Medium Life Technologies (Gibco)	12561-049
Tubo cónico (50 mL)	VWR	21008-242
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C0775
Plato de cultivo (150 mm)	TPP	93150
Cubeta (espacio de 2 mm)	Aparato Harvard	450125
Suero fetal bovino	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldehído	Sigma-Aldrich	F1635	Glutamina tóxica y cancerígena
Life	Technologies (Gibco)	25030-081
Medio esencial mínimo	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicilina/estreptomicina	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P3911
Fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	P9791
Placa de seis pocillos	TPP	92006
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S3014
Fosfato de sodio dibásico	Sigma-Aldrich	S3264
Tripsina-EDTA (0,25%)	Life Technologies ( Gibco)	25200-056
Vitaminas	Sigma-Aldrich	M6895
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
3. EquipoSistema de
electroforesis de gel de agarosa	Mupid	MPDEXU-01
CO2 Incubadora	Thermo Scientific	Heracell 150i
Centrífuga de sobremesa	Thermo Scientific	ST16R
Electroporador	Harvard Apparatus ECM	830
Lámparas ultravioleta de onda larga (de mano)	Centrífuga de sobremesa UVP	UVGL-58
	Beckman Coulter	368826
Thermocycler	Life Technologies (Applied Biosystems)	GeneAmp PCR System 9700
Vortexer	Industrias Científicas	G-560
Baño de agua	Jeio Tech	WB-10E