Artículo de método

Rápido

DOI:

10.3791/53165

⸱

23 de septiembre de 2015

 ,  ,  , 
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe un método de hibridación in situ rápido y simplificado ideal para el cerebro con prefijo de paraformaldehído, reduciendo así la necesidad de pasos complejos prolongados mientras se utilizan tejidos frescos congelados. El método se valida mediante la identificación del gen del receptor de serotonina 5-HT2A htr2a en ratas.

Resumen

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3,4-La toxicidad de la metilendioximetanfetamina (MDMA; éxtasis) puede causar cambios específicos de la región en la expresión del ARNm serotoninérgico debido al síndrome agudo de serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT). Esta hipótesis puede probarse utilizando hibridación in situ para detectar el gen del receptor de serotonina 5-HT2A htr2a. En el pasado, tales procedimientos, que utilizaban ribosondas radiactivas, eran difíciles debido al complicado flujo de trabajo que necesita varios días para realizarse y la dificultad adicional de que la técnica requería el uso de tejidos frescos congelados mantenidos en un entorno libre de ARNasa. Recientemente, el desarrollo de sondas cortas de oligonucleótidos ha simplificado los procedimientos de hibridación in situ y ha permitido el uso de secciones cerebrales prefijadas con paraformaldehído, que están más ampliamente disponibles en los laboratorios. Aquí, describimos un protocolo detallado utilizando sondas de oligonucleótidos no radiactivos en los tejidos cerebrales prefijados. Las sondas de hibridación utilizadas para este estudio incluyen dapB (un gen bacteriano que codifica para la dihidrodipicolinato reductasa), ppiB (un gen de mantenimiento que codifica para la peptidilprolil isomerasa B) y htr2a (un gen de serotonina que codifica para los receptores 5-HT2A). Este método es relativamente simple, barato, reproducible y requiere menos de dos días para completarse.

Introducción

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El síndrome de serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT) es un trastorno neurológico agudo causado por drogas promotoras de 5-HT, como los antidepresivos1, mientras que también ocurre en situaciones de uso de MDMA con fines recreativos2. Los mecanismos moleculares responsables de los cambios de humor, los déficits de aprendizaje y memoria que ocurren en asociación con el síndrome agudo no se conocen bien3,4. La hibridación in situ es una poderosa herramienta de investigación que permite la detección y cuantificación de ARNm específicos expresados potencialmente a nivel de una sola célula. La forma convencional de realizar la hibridación in situ es utilizar una ribosonda marcada con radiactividad que hibrida específicamente el gen de interés. Sin embargo, un inconveniente importante es que el método requiere pasos complicados y lentos de preparación e hibridación de la sonda, así como el acceso a tejidos frescos congelados mantenidos en un ambiente libre deARNasa 5,6.

Las sondas de oligonucleótidos se han desarrollado recientemente para hibridar fragmentos de ARN más cortos que los necesarios para las ribosondas7. Además, las sondas producen una señal de fondo baja sin sacrificar la especificidad8. Esta tecnología de sonda recientemente desarrollada se puede utilizar en hibridación in situ en tejidos cerebrales con prefijo de paraformaldehído comúnmente disponibles en laboratorios de inmunocitoquímicos.

Aquí, describimos un protocolo para la hibridación in situ utilizando sondas de oligonucleótidos en cerebro de rata con prefijo de paraformaldehído y comparamos los hallazgos con los observados en un cerebro fresco congelado5,6. Este protocolo se utiliza para probar la hipótesis de que el abuso de sustancias MDMA causa cambios en el gen del receptor 5-HT2A htr2a mRNA en el cerebro. Comenzamos el procedimiento con tratamiento con MDMA seguido de perfusión tisular con paraformaldehído del animal, hibridación in situ de la sonda thr2a y análisis de los datos. Obsérvese que dapB (el gen bacteriano que codifica para la dihidrodipicolinato reductasa) se utiliza como control negativo, y ppiB (gen de mantenimiento que codifica para la peptidilprolil isomerasa B) como control positivo.

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Protocolo

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Procedimientos de uso de animales se describen a continuación fueron aprobados por el Cuidado y Uso Comité Institucional Animal (IACUC) de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Ross y la Florida Atlantic University. Aunque se requieren técnicas y guantes estériles, el medio ambiente RNasa libre no es necesario durante el uso de este protocolo.

1. Preparación

  1. Preparación del tejido y seccionando
    1. Asignar ratas al azar en tres grupos: fresco / solución salina (SAL; 0,9% NaCl), el prefijo / SAL y el prefijo / 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA; véanse los detalles en el cuadro 1).
    2. Administrar tres dosis de 1 ml / kg SAL y 10 mg / kg por vía intraperitoneal MDMA, respectivamente, a los grupos SAL y MDMA en el intervalo de 2 hr. Permitir a los animales para sobrevivir el tratamiento durante 6 días.
    3. El día 7, administrar 100 mg / kg de ketamina en combinación de 5 mg / kg de xilazina por vía intraperitoneal a las ratas para una anestesia profunda (es decir, la pérdida de abrir y cerrar la córnea y tail pellizcar reflejos).
    4. Para el grupo fresca / SAL, decapitar rápidamente ratas y retire el cerebro para la prueba cerebral fresco (ver detalles en la referencia 5).
    5. Para los grupos / MDMA prefijo / SAL y prefijados, hacer un corte a lo largo del esternón unos 10 -12 cm y luego exponer la punta del esternón.
    6. Mantenga el extremo del esternón con una pinza hemostática y cortar el diafragma lateralmente en ambos lados con unas tijeras afiladas y luego se corta hacia arriba a través de las costillas y paralelo a los pulmones.
    7. Con una mano, sostenga la punta ventral del corazón con pequeñas pinzas. Con la otra mano, perforar el ventrículo izquierdo con una G aguja de la jeringa 18 (nótese el lado del adaptador de la aguja está conectado con una manguera de silicio en forma de Y a SAL y paraformaldehído contenedores enfriado con hielo y bombas peristálticas; ver la referencia 9).
    8. Encienda la bomba de SAL en el nivel medio de la velocidad de flujo (~ 5 ml / min) y la punción de la aurícula derecha con las pinzas para permitir el escape de retorno circulación. Mantener SAL perfusión durante 30 min.
    9. Encienda la bomba de paraformaldehído en el nivel medio y deje que el helado de paraformaldehído al 4% a perfundir el animal durante 30 minutos.
    10. Retire instrumento perfusión y decapitar al animal. Hacer un posteroanterior cortar a través de la línea media del cráneo, y luego la solapa del cráneo para exponer la cavidad 10 del cráneo.
    11. Retire el cerebro con una espátula de la cavidad del cráneo y el cerebro colocar en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 25 ml de paraformaldehído al 4%. Mantener el cerebro dentro del tubo que contiene paraformaldehído-4 ºC en refrigerador durante 24 hr.
    12. Mueva el cerebro en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 25 ml de solución de sacarosa al 30% a 4 ºC durante 3 días. Por último, guarde el cerebro dentro de bolsas de plástico a -80 ° C hasta su uso.
    13. Montar el cerebro en un plato con los medios de incrustación y congelar los medios de incrustación contienen cerebral en un criostato a una temperatura de -26 ºC. Cortar el congeló frescan cerebral en 20 micras secciones y el cerebro paraformaldehído-prefijo en secciones de 10 micras. La transferencia de la sección a un portaobjetos de microscopio RT tocando la diapositiva a la sección.
    14. Aire seco a temperatura ambiente durante 4 hr. Guarde la sección diapositivas en una bolsa cerrada sellada a -80 ° C hasta su uso.
  2. Deshidratación
    1. Tome diapositivas de la -80 ° C congelador y asignar secciones en una de tres pruebas: HT2A, PPIB (control positivo) o dapB (control negativo); marca y las secciones de la etiqueta con un bolígrafo (no utilizan un lápiz). Sumergir los portaobjetos en 100% de alcohol a temperatura ambiente durante 5 min. Se secan los portaobjetos durante 5 minutos en una campana de humos.
  3. Pretratamiento
    1. Pipeta 20 l de reactivo de pretratamiento-1 (inactivación de la fosfatasa alcalina) a las secciones en las diapositivas. Colocar los portaobjetos en un carril de bastidor en una bandeja de humedad (nótese que la bandeja se cubre con una tapa para mantener una alta humedad para prevenir la evaporación de la reacción solution).
    2. Agite suavemente la bandeja de la humedad en un agitador horizontal a una velocidad baja durante 10 minutos. Lavar los portaobjetos dos veces con agua doblemente destilada (ddH 2 O) durante 2 min. Sumergir el portaobjetos en un vaso de 200 ml que contiene 150 ml de la Pretratamiento-2 reactivo (ruptura de los enlaces cruzados inducidos por la fijación de paraformaldehído). Hervir las diapositivas para un total de 5 min a 100 ºC (restauración inducida por calor de la estructura del ARN 11).
    3. Lavar los portaobjetos dos veces con ddH2O durante 2 min. Colocar los portaobjetos en 100% de alcohol durante 5 min. Secar los portaobjetos durante 5 minutos en la campana de humos. Use un lápiz hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor del área seleccionada en la sección de tejido (por ejemplo, las estructuras no-corticales, incluyendo el tálamo y el hipotálamo como se indica en la figura 2).
    4. Pipeta 10 l de la Pretratamiento-3 reactivo (aumentos en la penetración de la sonda) a cada área seleccionada, y cubrir la bandeja de humedad con la tapa. Colocar la bandeja en el horno de hibridaciónequipado con el agitador horizontal y fijar la temperatura del horno a 40 ºC; agite suavemente la bandeja durante 30 minutos. Lavar los portaobjetos dos veces con ddH2O durante 2 min.

2. Hibridación y Amplificación

  1. Pipeta 10 l de HTR2A, PPIB y dapB reactivos de sonda, respectivamente, en las áreas seleccionadas. Cubrir la bandeja de la humedad con la tapa para evitar la evaporación del reactivo. Agite suavemente en el agitador horizontal fijado a una velocidad baja. Incubar los portaobjetos a 40 ºC en el horno durante 2 horas.
  2. Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de la amplificación-1 reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 30 minutos.
  3. Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de reactivo de amplificación-2 en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 15 minutos.
  4. Lavar los portaobjetos dos veces won un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de reactivo de amplificación-3 en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 30 minutos.
  5. Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de la amplificación-4 de reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 15 minutos.
  6. Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de la amplificación-5 de reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 min.
  7. Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipetear 10 l de la amplificación-6 reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a TA durante 15 min. Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min.

3. Detección de la señal

  1. Pipeta 10 l de reactivo Roja para cada área seleccionada (Tenga en cuenta que el reactivo es una mezcla de rojo-B y Rojo-A en una proporción de 1:60 y se debe utilizar immediately). Colocar el portaobjetos en la bandeja de humedad en el agitador horizontal a temperatura ambiente y agitar suavemente a baja velocidad durante 10 minutos.
  2. Lavar los portaobjetos dos veces con (ddH 2 O) durante 10 min. Secar los portaobjetos a 60 ºC en el horno durante 15 minutos. Colocar los portaobjetos en xileno bajo la campana de humos durante 5 min. Pipeta 20 l de los medios de montaje a base de xileno en cada área seleccionada y cubrir con un cubreobjetos.

Capture 4. Imagen

  1. Tome microfotografías digitales de las áreas seleccionadas (por ejemplo, el hipotálamo, las Figuras 1 y 3) con un aumento de 4 × 20 × y lentes del objetivo. Guarde el archivo de imagen.

Análisis de partículas 5. Imagen

  1. Arrastre y suelte el archivo de imagen en la ventana principal de ImageJ. Ir a la barra de menú y seleccione 'Imagen', al lado seleccione 'Tipo' en el menú desplegable y seleccione "8 bits".
  2. Seleccione 'Ajuste', a continuación, seleccione 'Threshold 'para abrir el cuadro de diálogo. Ajuste el valor de la barra inferior del cuadro de diálogo de manera que se elimina el fondo no deseado. Ir a la barra de menú y seleccione "Analizar" y seleccione "Analizar Partículas 'para abrir un segundo cuadro de diálogo.
  3. Ajuste del tamaño de partícula en el 10, al lado seleccione 'Mostrar esboza "y seleccione" Mostrar resultados "y" cajas Resumir'. Por último, haga clic en 'Aceptar' para ver los datos de partículas en los cuadros de diálogo.

Cálculo 6. Hoja de cálculo

  1. Introduzca los datos en la hoja de Excel y un promedio de la cantidad de partículas en el grupo SAL como línea de base. Calcule el nivel de porcentaje de cada sección y hacer una gráfica en consecuencia (Figura 4).

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Resultados

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Utilizando las sondas de ARN oligonucleótido (<25 nt), la hibridación se puede detectar como puntos rojos en las células hipotalámicas preparados a partir de los cerebros congelados paraformaldehído prefijado y frescas. Las moléculas de ARNm HTR2A están presentes en algunas células (indicados por flechas continuas), pero no en otros (flechas abiertas). Hemos observado que no hay diferencia entre el paraformaldehído-prefijado y los tejidos congelados frescos (Figura 1). A la hibridación exito...

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Discusión

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Una de las principales preocupaciones de la prueba de hibridación in situ es elegir las técnicas apropiadas utilizadas para la preservación del ARN debido a las enzimas ARNasa. Es bien sabido que estas enzimas están ampliamente presentes en las células y el medio ambiente, lo que puede afectar los resultados. Sin embargo, la actividad enzimática se puede distinguir rápidamente colocando el tejido en la solución de hielo seco / alcohol5,12. Aunque la preservación rápida es fundamental para la hibridaci...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado por el NIH subvención (R15DA029863), la concesión de la Universidad Florida Atlantic investigación de pregrado (M30014) y la Escuela de Medicina Veterinaria de la beca de investigación de la Universidad de Ross. Nos gustaría dar las gracias al Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (Rockville, MD) para proporcionar (±) 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA ±) para este trabajo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sonda de control negativo de RNAscope-DapBDiagnóstico celular avanzado, INC310098
RNAscope Pretreat 4Diagnóstico celular avanzado, INC320046
Kit de reactivos RNAscope 2.0 HD - RojoDiagnóstico de células avanzado, INC310036
Sonda de RNAscope - Rn-PPIBDiagnóstico celular avanzado, INC313921
Rata Htr2aDiagnóstico celular avanzado, INC300031
CriostatoLeicaCM 1850
Agitador horizontalVWR88032-088
Horno de hibridaciónThermo Fisher Scientific222000
Portaobjetos de microscopio Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15
Bolígrafo hidrofóbicoVectorH-4000
MicroscopioOlympusProvis AX70

Referencias

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