Artículo de método

La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS

DOI:

10.3791/53176

⸱

11 de julio de 2016

 ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) y las técnicas moleculares (secuenciación del gen 16S rRNA) permiten la identificación de patógenos bacterianos raros en diagnósticos rutinarios. El objetivo de este protocolo radica en la combinación de ambas técnicas que conduce a datos más precisos y confiables.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hay un número de patógenos bacterianos raras y, por lo tanto, se ha descrito suficientemente que se presentan para causar infecciones graves, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. En la mayoría de los casos, sólo unos pocos datos, publicados en su mayoría como informes de casos, los cuales están disponibles investigar el papel de los agentes patógenos tales como un agente infeccioso. Por lo tanto, con el fin de aclarar el carácter patógeno de tales microorganismos, es necesario llevar a cabo estudios epidemiológicos que incluyen un gran número de estas bacterias. Los métodos utilizados en un estudio de este tipo de vigilancia tienen que cumplir los siguientes criterios: la identificación de las cepas ha de ser precisa, según la nomenclatura válida, deben ser fáciles de manejar (robustez), económico en el diagnóstico de rutina y tienen que generar comparables resultados entre diferentes laboratorios. En general, hay tres estrategias para la identificación de cepas bacterianas en condiciones de rutina: 1) la identificación fenotípica caracterizar la Biochemical y metabólicas propiedades de las bacterias, 2) técnicas moleculares, tales como la secuenciación de genes 16S rRNA y 3) la espectrometría de masas como un enfoque basado en la novela proteoma. Desde espectrometría de masas y enfoques moleculares son las herramientas más prometedoras para la identificación de una gran variedad de especies bacterianas, se describen estos dos métodos. Se discuten los avances, limitaciones y problemas potenciales cuando se utilizan estas técnicas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificación segura de patógenos raras en el diagnóstico de rutina se ve obstaculizada por el hecho de que los métodos de cultivo y bioquímicos clásicos son engorrosos y, a veces cuestionable. Además, un laboratorio de microbiología de diagnóstico tiene que procesar un gran número de patógenos, que van desde unos pocos cientos a varios miles, a diario, lo que requiere el uso de sistemas automatizados. Además de la gestión de un diario de alto rendimiento, se necesita la identificación precisa de especies bacterianas. Esto se justifica ya que difieren en su patrón de susceptibilidad antimicrobiana y, por tanto, la identificación correcta proporciona al médico información esencial para elegir los antibióticos apropiados (por ejemplo, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

Sistemas automatizados de identificación microbiana (AMIS) se aplican conjuntos estandarizados de reacciones enzimáticas para caracterizar las propiedades metabólicas de las bacterias aisladas 13,15,16,26,27. Aunque los cartuchos utilizados en estos sistemas utilizan un gran número de diferentes reacciones bioquímicas, por ejemplo, 47 en la tarjeta de GN de las AMI utilizado en este estudio 52, esta estrategia permite la identificación segura sólo para un conjunto limitado de bacterias. Por otra parte, la base de datos, un sistema experto avanzado, se centra claramente en la detección de bacterias competentes y altamente relevantes de importancia médica 13,15,16,36. Dos sistemas adicionales, se utiliza ampliamente en los laboratorios, se aplican también este enfoque bioquímico para la identificación de bacterias. Estudios recientes demuestran una exactitud de identificación comparables entre los Amis utilizados en este estudio y uno de los competidores (93,7% y 93,0% respectivamente), mientras que la 3ª Amis tiene una precisión identificación de solamente el 82,4% de las especies de nivel 35. Estas discrepancias pueden ser explicadas por la calidad de las referencias de datos de identificación subyacentes, las versiones de los kits y software, las diferencias de metabolismo y la competencia del personal técnico 35,36.

Se utilizan principalmente dos sistemas automatizados MALDI-TOF MS (sistema de identificación microbiana MALDI-TOF, MMI). Estos sistemas permiten la detección de un gran número de especies bacterianas en función de su proteína de espectros de masas de huellas dactilares. Por ejemplo, la base de datos de los MMIS utilizados contiene 6.000 espectros de referencia. Sistemas de identificación basados ​​en espectrometría de masas ofrecen una detección rápida y fiable de una gran variedad de microorganismos patógenos incluyendo raras 11,48,51. Hasta la fecha sólo unas pocas comparaciones directas están disponibles entre las MMIS utilizados en este estudio y su competidor 19,33. De acuerdo con DÆK et al. Ambos sistemas proporcionan una alta tasa similar de exactitud de identificación, pero los MMIS utilizados en este estudio parece ser más fiable en la identificación de especies 19.

genes distintos Del mismo modo, las técnicas moleculares direccionamiento bien conservadas, sino también ( Por ejemplo, 16S rDNA o rpoB) permiten una clara identificación de las especies 3,22,61. Entre estos, el 16S rDNA es la limpieza de genes más ampliamente utilizado debido a su presencia en todas las bacterias 34. Su función se mantiene sin cambios y, por último, con aproximadamente 1.500 pb, que es el tiempo suficiente para ser adecuado para la bioinformática 14,34. Muchos investigadores consideran que el análisis del gen 16S rRNA como el "estándar de oro" para la identificación de bacterias 21. Esto es debido al hecho de que algunos laboratorios utilizan técnicas de hibridación ADN-ADN hasta la fecha para la identificación de bacterias raras o nuevas 14,34. Además, más y más bases de datos están disponibles, que puede ser utilizado para el análisis de genes 16S rRNA 50. Sin embargo, ha de tenerse en cuenta que los sistemas de detección basados ​​16S rDNA tienen una sensibilidad limitada en comparación con protocolos de PCR estándar. Además, el enfoque molecular es sofisticado, consume tiempo y requiere personal altamente capacitado, así comoinstalaciones de los laboratorios dedicados y es, por lo tanto, no se implementan fácilmente en el diagnóstico de rutina 55. Además, se ha demostrado que la combinación de al menos dos métodos diferentes de identificación bacteriana conduce a la identificación de cepas de alta precisión. La combinación de secuenciación de MALDI-TOF MS y 16S rDNA permite la identificación de un gran número de diferentes especies bacterianas con alta precisión. Recientemente se presentó la combinación de análisis de genes MALDI-TOF MS y 16S ARNr de identificación bacteriana estudiar las cuestiones epidemiológicas y patógenos raros 56.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Extracción de ADN bacteriano

  1. Preparación de la solución PBS
    1. Pesar 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2 H 2 O y 8,80 g de NaCl en un matraz y llenar con agua destilada hasta un volumen final de 1.000 ml. Ajustar el pH a 7,4. Para uso final filtrar la solución a través de una prueba de bacterias (0,22 m) de filtro.
  2. Las bacterias Extracción de ADN de bacterias Gram-negativas
    1. Streak el material del paciente en un medio de cultivo apropiado (por ejemplo, Columbia agar sangre), identificar y aislar los patógenos potenciales.
    2. Preparar cultivo puro y llevar a cabo la tinción de Gram para determinar morfotipo y para confirmar la pureza y de la cultura 49.
    3. Elija una sola colonia bacteriana y transferirlo con un 1 l de un solo uso asa de siembra en un tubo de reacción de 2,0 ml estéril que contiene 1 ml de solución de PBS.
    4. Incubar esta suspensión en una thermomixer a 95 ° C durante 10 minutos. Después de la incubación, dejar que el extracto bacteriano (que contiene el ADN disuelto) enfriar a temperatura ambiente y, o bien utilizarla directamente para la amplificación o almacenar a -20 ° C para su uso posterior (Figura 1a).
  3. Las bacterias Extracción de ADN de bacterias Gram-positivas
    1. Streak el material del paciente en un medio de cultivo apropiado (por ejemplo, Columbia agar sangre), identificar y aislar los patógenos potenciales. Realizar tinción de Gram con el fin de confirmar morfotipo de la cultura.
    2. Preparar cultivo puro y llevar a cabo la tinción de Gram para determinar morfotipo y para confirmar la pureza del cultivo.
    3. Elija una sola colonia bacteriana con un asa de siembra estéril y 1 l suspenderlo en 500 l de PBS solución en un tubo de 2,0 ml de reacción.
    4. Añadir 500 l de vidrio-cuentas y transferir el tubo a un homogeneizador oscilante, que funciona a la frecuencia máxima y la amplitud (50 Hz), por 5 min. Utilizar perlas de vidrio de 1,0 mm de diámetropara interrumpir las paredes celulares bacterianas.
    5. Incubar este tubo durante 10 min a 95 ° C y se enfría a temperatura ambiente. El uso del extracto, ya sea directamente para la reacción de PCR o almacenar a -20 ° C para su uso posterior.

2. 16S rDNA PCR

  1. Preparación de Cebadores de amplificación
    1. Utilice la TPU1 cebadores (5'-GTT AGA TGA TCM CTC TGG AG-3 '[M = A / C]) como cebador directo y RTU4 (5'-TAC CAG ATC GGT TGT TAA TCC T-3') como cebador inverso 25. Preparar una solución de imprimación de valores con DNasa y RNasa libre de agua, que tiene una concentración de 100 pmol / l (100 mM) y diluir aún más a una solución de trabajo a las 10 pmol / l. Guarde el archivo de imprimación y la solución de trabajo a -20 ° C o utilizar directamente.
  2. Preparación de la mezcla de reacción PCR
    1. Pipeta de 1 l de cada cebador, 1 l dNTP-mix (100 mM), 2,5 l de extracto de ADN, 5 l de 10x tampón de PCR (que contiene Mg 25 mMCl 2), 0,25 l de Taq-polimerasa (5 unidades / l) y 39,25 l DNasa y RNasa libre de agua de PCR en un tubo de reacción l estéril 200.
  3. Protocolo de PCR
    1. Iniciar el programa de PCR construido de la siguiente manera: En primer lugar, una etapa de incubación inicial a 95 ° C durante 5 min, que es necesario para activar la Taq-polimerasa. En segundo lugar, 35 ciclos de amplificación, que contiene un 1 min. paso de desnaturalización a 95 ° C, a 1 min. paso de reasociación del cebador a 50 ° C, y una etapa de extensión del cebador 1,5 min a 72 ° C. En tercer lugar, una extensión final de 10 min a 72 ° C. Por último, la reacción de PCR se enfría a 4 ° C.
      NOTA: Staphylococcus aureus y H 2 O sirven como control positivo y negativo (Figura 1b).
    2. Se coloca el tubo que contiene la mezcla de reacción de PCR en el termociclador e iniciar el programa.
  4. La purificación del producto de PCR
    NOTA: Con el fin de purificar el producto de la PCR, ya sea varios protocolosSe pueden usar enzimático basado o con una matriz de adsorción de sílice. La PCR de un solo paso de limpieza utilizado aquí utiliza dos reacciones enzimáticas hidrolíticas. Mientras exonucleasa I (Exo I) elimina ADN de cadena sencilla, la fosfatasa alcalina de gamba (SAP) hidroliza dNTPs no incorporados. El segundo procedimiento se basa en una técnica de adsorción de la membrana de sílice con una sal de alta unión rápida - lavar - ciclo de elución baja en sal.
    1. Añadir 1,5 l de una mezcla enzimática que contiene tanto Exo I y SAP para 25 l producto de PCR, mezclar bien y transferir a un termociclador aplicando un protocolo simple de los primeros 15 min a 37 ° C seguido de 15 min a 80 ° C. Almacenar el producto de PCR purificado, ya sea a -20 ° C o usarlo directamente como objetivo para el etiquetado de PCR.

3. ADN en gel de agarosa La electroforesis

  1. Preparación del tampón de electroforesis (TBE-buffer)
    1. Valorar 54,0 g de base TRIS (mM 445), 27,5 g (445 mM) de ácido bórico y 20 ml de una M EDTA 0,5 (10mM) solución a pH 8,0 con NaOH en un matraz y llenarlo con agua destilada hasta un volumen total de 1.000 ml. Luego se diluye este buffer 5x 1:10 con agua destilada (TBE 0,5x) para la electroforesis.
  2. Preparación del tampón de carga
    1. Mezclar 250 mg de azul de bromofenol, 250 mg FF xileno cianol y 15 g de polisucrosa (Tabla de Materiales) en un matraz. Luego llenarlo con tampón TBE 0,5x a un volumen total de 100 ml. Alícuota del colorante de carga de porciones de 1 ml y se almacena a -20 ° C para su posterior uso.
  3. Reparto del gel de agarosa
    1. Pesar 6 g de electroforesis de agarosa estándar de 300 ml de tampón TBE 0,5x (ver sección 3.1.1) en un matraz, para preparar un 2% (w / v) en gel de agarosa. A continuación, poner la mezcla de agarosa en un horno de microondas, calentar punto cerca de ebullición hasta que la agarosa se disuelve completamente y la solución aparece clara.
    2. Deje que los agarosa fundida se enfríe lo suficiente y añadir 10 l de un 1% (w / v) de bromuro de etidio Stock Solución. Verter la solución en un molde y colocar un peine de gel (permitiendo 30 pozos) en el reparto. Retire el peine cuando el gel está completamente solidificado y poner el gel en la cámara de electroforesis que contiene tampón TBE 0,5x.
      NOTA: El bromuro de etidio es tóxico y mutagénico. Por lo tanto, debe manejarse con precaución. Es aconsejable el uso de guantes de nitrilo. Hay manchas de ácidos nucleicos intercalante alternativos que se pueden utilizar como una alternativa no tóxica.
  4. En gel de agarosa La electroforesis de los productos de PCR
    NOTA: Con el fin de verificar el tamaño correcto de los amplicones de PCR y para estimar la concentración de ADN del producto de PCR purificado se separa en un gel de agarosa.
    1. Pipetear 2 l de tampón de carga en un tubo de reacción de PCR y añadir 8 l de producto de PCR. Pipetear esta mezcla en los pocillos del gel. Añadir 8 l de un marcador de tamaño de peso molecular (escalera de ADN) en un pocillo separado para estimar el tamaño del producto de PCR.
    2. Aplicaruna tensión constante a 10 V / cm y detener la electroforesis tan pronto como el marcador de azul de bromofenol ha alcanzado aproximadamente ¾ de la longitud total del gel. Visualizar los fragmentos de PCR separadas utilizando un transiluminador de UV (longitud de onda de 302 nm) y documentarlos mediante un sistema de gel-documentación. Estimar la cantidad de ADN por comparación visual con la escalera de ADN. Utilice aproximadamente 10 ng como objetivo para el etiquetado de PCR.

4. La secuenciación de Sanger

  1. Ciclo de Secuenciación PCR
    NOTA: Realice el etiquetado PCR en una reacción de 10 l usando un kit comercial (Tabla de Materiales).
    1. Añadir 2 l de mezcla maestra de reacción 5x, 2 l de la preparación de ADN, 1,5 l de TPU1 o RTU4 solución de trabajo (10 pmol / l) y 4,5 l de DNasa y RNasa libre de agua.
    2. Ponga esta mezcla de reacción de secuenciación en un termociclador de PCR y ejecutar otro. En total, 25 ciclos de proceso que consiste en una etapa de desnaturalización (96 ° C,10 seg), una etapa de recocido (45 a 60 ° C, 5 segundos) y un paso de extensión (60 ° C, 2 min). Finalmente, se enfría la reacción a 4 ° C.
  2. Purificación de la reacción de secuenciación
    1. Se purifica la mezcla de reacción de marcaje utilizando columnas de centrifugación comerciales de purificación de PCR (Tabla de Materiales).
    2. Carga de 10 l de la reacción de secuenciación en la matriz de filtración en gel pre-hidratado y realizar una etapa de centrifugación a 750 xg durante 3 min.
      NOTA: Por el uso de este procedimiento tintes terminadores no incorporados son retenidas en la matriz de gel.
    3. A continuación, secar el eluato acuoso en un concentrador de vacío. Centrifugar a 2500 xg durante 20 a 30 min a 40 ° C para completar la sequedad.
    4. Añadir 10 l de formamida desionizada altamente continuación desnaturalice a 90 ° C durante 2 min y se enfría la mezcla en hielo. Pipeta de 10 l de las muestras desnaturalizadas en una placa de 96 l. Almacenar el producto de PCR secado y limpiado a -20 ° C si el análisis espara ser llevado a cabo en un momento posterior.
  3. 16S rRNA gene secuenciación y análisis de la secuencia de ADN
    NOTA: Realizar análisis de la secuencia en un secuenciador automatizado (Tabla de Materiales). El secuenciador se usa aquí es un sistema de electroforesis capilar basado en la fluorescencia automatizado que analiza 4 muestras simultáneamente (matriz de 50 cm 4-capilar) con un polímero líquido 67 (Figura 1c).
    1. Coloque la placa de microtitulación en el secuenciador. Escribir una hoja de muestra (placa de registro) como se establece en 2, guardarlo y comenzar la secuencia de arranque / análisis siguiendo los pasos dados en 1.
      NOTA: Duración de una secuencia de ejecución es de 2 horas y proporciona datos de 800 a 1.000 pb.
    2. Abra el software de análisis de secuenciación (Tabla de Materiales). Los datos de secuencia se dan como un archivo de texto (.seq) y un archivo que contiene el electroferograma incluyendo valores de calidad (QV) (.ab1).
      NOTA: Base de llamada es automáticamente porformado por el software de análisis de secuenciación y el electroferograma subyacente se comprueba visualmente (por ejemplo, la altura del pico, la separación de pico) antes de la secuencia se utiliza para otras aplicaciones.
    3. Comparar el archivo de secuencia de ADN almacenada para el algoritmo BLAST nr base de datos NCBI utilizando (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

NOTA: El espectrómetro de masas utiliza un 337 nm N 2 de láser y es operado por un software específico de control (Tabla de Materiales). Los espectros se registraron en el modo lineal y un intervalo de masas entre 2.000 a 20.000 Da está cubierto. Interpretación de los datos y la asignación de las puntuaciones de las muestras se lleva a cabo en tiempo real mediante un software de análisis (Tabla de Materiales) (Figura 1d).

  1. Preparación de las bacterias por MALDI-TOF MS análisis
    1. Cultivar las bacterias de interés (por ejemplo, Myroides odoratimimus) en Colagar sangre Umbia que contiene sangre de caballo 5% a 37 ° C durante 18 a 24 horas, dependiendo de la cepa bacteriana (Figura 2a). Realizar tinción de Gram para verificar el morfotipo del organismo bajo investigación, así como la pureza de la cultura.
    2. Utilice un palillo de madera para la transferencia de una sola colonia bacteriana a un pocillo de una diana de acero de 96 pocillos (Figura 2b y 2c). Punto 1 l de ácido fórmico al 70% en la parte superior del organismo se secó al aire en la diana de acero y dejar secar durante aproximadamente 2-3 minutos.
    3. Entonces, superponer el punto con una solución de matriz de 1 l, que contiene 50 mg / ml CHCA (α-ciano-4-hidroxicinámico) en un disolvente orgánico (50% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético 2,5%, 47,5% H 2 O).
      NOTA: El método de superposición de ácido (en el método de preparación de la placa) se puede utilizar para mejorar la calidad de los espectros de masas. Se ha demostrado que para las bacterias Gram-positivas tales como un "ataque ácido" aumenta la puntuación de VAlues de los espectros medidos 45.
      NOTA: Como alternativa, un sistema de preparación automática de muestras (Tabla de Materiales) se puede usar en el que los puntos de contacto libre de 1 l 70% de solución de ácido fórmico y, después de un primer ciclo de secado, la solución de matriz de 1 l se aplican en el frotis bacteriano. Las muestras se secan a continuación en condiciones estandarizadas a 60% de humedad relativa y están listos para usar para el análisis.
    4. Deje que el frotis con matriz superpuesta de secado al aire de nuevo durante unos 5 minutos en una campana. Este frotis bacteriana con la matriz aplicada es ahora estable durante muchas horas.
      NOTA: frotis bacteriana sin matriz puede no ser estable debido a la degradación de proteínas.
  2. Realizar el análisis MS MALDI-TOF
    1. Introducción de muestras
      1. Abra el software de control de nuestros MMIS Materiales (Tabla).
      2. Airear el puerto de carga de muestra del espectrómetro de masas pulsando el botón IN / OUT del instrumento.
      3. Abra la puerta de carga después de un clic e introduzca la placa diana MALDI-TOF MS con la mancha bacteriana seca más la matriz.
      4. Cerrar el puerto y evacuar de nuevo. Observar al vacío y cuando llega a 4,5 x 10 -6 mbar iniciar la medición.
    2. Análisis de las muestras
      1. Abra el software de análisis de nuestros MMIS (Tabla de Materiales) y haga clic en el menú "Archivo". Seleccione "Nueva clasificación" y un nuevo "asistente de clasificación en tiempo real MALDI Biotyper" ventana se abre. Escriba el nombre del proyecto, por ejemplo "Proyecto_1 medición Myroides, en el campo" Nombre del proyecto "y pulse el botón" Nuevo ". Bajo el nuevo cuadro de diálogo llamado" Nuevo proyecto "nombre del proyecto de verificación y proceder pulsando el botón" OK ".
      2. En el "asistente de clasificación Biotyper MALDI tiempo real" observar la ventana de "colocación de analitos" abierta. Seleccione posiciones de destino (por ejemplo, A1, A2, A3 ...), haga click cualquier posición seleccionada (indicado por un cuadrado azul) y seleccionar "Añadir muestras". En la vista de tabla de tipo abierto automáticamente en nombre de la muestra, identificación de la muestra y, opcionalmente, un comentario. Haga clic en el botón "Siguiente" para continuar.
      3. En el "asistente de clasificación Biotyper MALDI tiempo real" observar la ventana "Selección de métodos MALDI Biotyper" abierta. Seleccione "Bruker Taxonomía" de "proyectos de tamaño mediano de los árboles de la taxonomía" y haga clic en "Siguiente" para continuar.
      4. En el "asistente de clasificación Biotyper MALDI tiempo real" observar la ventana "Resumen del proyecto" abierto. Compruebe las entradas insertadas dadas anteriormente para el proyecto actual clasificación. Comience la clasificación ejecutar pulsando el botón "Finalizar" (Figura 2d - f). La medición se inicia automáticamente cuando se alcanza el vacío apropiado.
      5. Siga la carrera de clasificación hasta que la medida se ha realizado correctamente. Ver la tabla de resultados en tque "MALDI Biotyper Realtime Myroides Proyecto de Clasificación de medición Proyecto_1" abrir el menú "Ver" y haga clic en "Resultados".
      6. Ver las "Bruker MALDI Daltonics Biotyper Clasificación Resultados" como archivo HTML en el navegador web por defecto. Imprimir y guardar los resultados.
    3. Medir una norma de prueba diariamente antes de análisis de la muestra para calibrar el instrumento y realizar instrumento semanal de validación (instrumento de auto-test).
      NOTA: Durante la medición MALDI-TOF espectros se analizó en tiempo real por el software de análisis (Tabla de Materiales). Una lista de las diez especies con sus respectivos puntajes se da y se introduce en el sistema de información de laboratorio (LIS) para la presentación de informes.
    4. Evaluar críticamente los resultados de MALDI-TOF MS (ver resultados representativos) y, en su caso, se incluyen otras pruebas, tales como perfiles de susceptibilidad a los antibióticos y biochemical- o secuenciación del gen 16S rRNA y, si es necesario, para la tinción de Gramla asignación de una especie bacteriana al informe microbiológico.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF MS es una novela, método rápido y barato para el diagnóstico de rutina microbiológicos. La identificación de especies bacterianas mediante MALDI-TOF MS produce espectros compuesto principalmente de proteínas ribosomales, sino también otras proteínas muy conservadas "con funciones de mantenimiento de la casa afectadas en grado mínimo y por las condiciones ambientales" .El 17 de la base de datos de este MMIS contiene un amplio conjunto de espectros de referencia e incl...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanto MALDI-TOF MS y la secuenciación de genes 16S rRNA ofrecen la posibilidad de identificar un gran número de diferentes bacterias. MALDI-TOF MS es un método rápido y barato, que es fácil de manejar y de grandes bases de datos de espectros de masa bacteriana están disponibles. Por esta razón, MALDI-TOF MS es un método eficaz y fiable rápida, el costo de llevar a cabo estudios de cribado se centraron en patógenos bacterianos raras 17,20,39,51. En un estudio prospectivo comparando MALDI-TOF MS con otros métod...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer al Prof. Enno Jacobs por su continuo apoyo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CHROMASOLV, agua de grado HPLC, 1 LSigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Alemania270733
Lyser de tejidos LTQiagen, Hilden, Alemania85600Homogeneizador oscilante
Perlas de vidrio 1,0 mmVWR International, Darmstadt, Alemania412-2917
Thermomixer 5436Eppendorf, Hamburgo, Alemania2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen, Hilden, Alemania51306
Kit de núcleo de PCR Taq (1.000 U)Qiagen, Hilden, Alemania201225
Imprimación delantera TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')biomers.net, Ulm, Alemania  -
Imprimación inversa RTU4 (5&agudo;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&agudo;)biomers.net, Ulm, Alemania  -
Mastercycler Eppendorf, Hamburgo, Alemania- Termociclador
Tubo de reacción 1,5 mlSARSTEDT, Nü mbrecht, Alemania72.692
Tubo de reacción 2 mlSARSTEDT, Nü mbrecht, Alemania72.693.005
PCR 8er-CapStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania711040X
PCR 8er-SoftStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania711030X
Sharp R-ZV11 Sharp Electronics, Hamburgo,Alemania-Microondas
Titriplex III (EDTA Na2-sal deshidratada; 1 kg)Merck, Darmstadt, Alemania1084211000
SeaKem LE AgaroseBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania849006
SmartLadder SF - 100 a 1.000 bpEurogentec, Lü ttich, BélgicaMW-1800-04
Azul de bromofenol (25 g)Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, AlemaniaB0126
Xileno cianol FF (10 g)Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, AlemaniaX4126
ComPhor L Maxi Biozym, Hessisch Oldendorf,Alemania-Solución
de bromuro de etidio al 1% (10 ml)Carl Roth, Karlsruhe, Alemania2218.1
Gel Doc 2000Bio-Rad Laboratories, Mü nchen,Alemania-Gel-sistema de documentación 
ExoSAP-IT (500 reacciones)Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Reino Unido78201
Buffer (10x) con EDTA Life Technologies, Darmstadt, Alemania402824 BigDye
Terminator Kit v1.1Life Technologies, Darmstadt, Alemania4337450
Formamida Hi-Di (25 ml)Life Technologies, Darmstadt, Alemania4311320
Kit de giro DyeEx 2.0 (250)Qiagen, Hilden, Alemania63206
3130 Analizador genéticoLife Technologies, Darmstadt, Alemania-Secuenciador
MicroAmp placa de reacción óptica de 96 pocillos con código de barrasLife Technologies, Darmstadt, Alemania4306737
3130 Analizador genético, base de placa de 96 pocillosLife Technologies, Darmstadt, Alemania4317237
3130 Analizador genético, retenedor de placa de 96 pocillosLife Technologies, Darmstadt, Alemania4317241
3130 Analizador genético, pocillo septos de placaLife Technologies, Darmstadt, Alemania4315933
3130 Analizador Genético, Polímero POP-7, 7 mlLife Technologies, Darmstadt, Alemania4352759
3130 Analizador Genético, Matriz de 4 Capilares, 50 cmLife Technologies, Darmstadt, Alemania4333466
Software de análisis de secuenciación 5.4Life Technologies, Darmstadt, Alemania-
microflexBruker Daltonik, Bremen,Alemania-NuestromMIS
VITEK MSbioMé rieux, Nü rtingen, Alemania  2nd mMIS
flexControl 3.4Bruker Daltonik, Bremen,Alemania-Softwarecontrol de dispositivos
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)Bruker Daltonik, Bremen, Alemania-Softwareanálisis
α-ácido ciano-4-hidroxicinámico, HCCA, 1  gBruker Daltonik, Bremen, Alemania201344
Norma de calibración de péptidos IIBruker Daltonik, Bremen, Alemania222570
MSP 96 blanco acero pulidoBruker Daltonik, Bremen, Alemania8224989
peqGREENpeqlab 37-5010
MALDI Biotyper Galaxy Bruker Daltonik, Bremen, AlemaniaNº de pieza 1836007 Sistema automatizado de preparación de muestras
Vitek 2 bioMé rieux, Nü rtingen, Alemania  Nuestro aMIS
MicroScan Beckman Coulter, Krefeld, Alemania2nd aMIS
BD Phoenix™ Sistema Automatizado de MicrobiologíaBD, Heidelberg, Alemania3rd aMIS
i>Staphylococcus aureus subsp.  aureus  Rosenbach (ATCC®   25923&comercio;)Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), LGC Standards, Molsheim, FranciaControl positivo para PCR 
de de <

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521(2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491(2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412(2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289(2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985(2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. , PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095(2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Secuenciaci n del gen ARNr 16SIdentificaci n de pat genos bacterianosDetecci n de bacterias rarasAn lisis por espectrometr a de masasT cnicas molecularesMicrobiolog a diagn sticaEnfoque basado en el proteomaPerfil bioqu micoSecuenciaci n de Sanger

Artículos relacionados