Generación del paciente con cáncer de próstata Derivado modelos de xenoinjertos de células tumorales circulantes

Resumen

Este manuscrito detalla un método utilizado para generar xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de próstata (PDX) a partir de células tumorales circulantes (CTC). La generación de modelos PDX a partir de CTCs proporciona un modelo experimental alternativo para estudiar el cáncer de próstata; Es el tumor más comúnmente diagnosticado y una causa frecuente de muerte por cáncer en los hombres.

Resumen

Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente (PDX) están ganando popularidad en la investigación del cáncer y se utilizan para la evaluación preclínica de fármacos, la identificación de biomarcadores, los estudios biológicos y las estrategias de medicina personalizada. Las células tumorales circulantes (CTC, por sus siglas en inglés) desempeñan un papel fundamental en la metástasis tumoral y se han aislado de pacientes con varios tipos de tumores. Recientemente, las CTC se han utilizado para generar modelos experimentales de PDX de cáncer de mama y próstata. En este manuscrito se detalla el método para la generación de modelos PDX de cáncer de próstata a partir de CTCs desarrollados por nuestro grupo. Las ventajas de este método sobre los modelos PDX convencionales incluyen la independencia de la recolección de muestras quirúrgicas y la generación de modelos experimentales en varias etapas de la enfermedad. La centrifugación en gradiente de densidad seguida de lisis de glóbulos rojos y depleción por citometría de flujo de células mononucleares CD45 positivas se utiliza para enriquecer CTC a partir de muestras de sangre periférica recogidas de pacientes con enfermedad metastásica. A continuación, las CTC se inyectan en ratones inmunodeprimidos; Los xenoinjertos generados posteriormente pueden utilizarse para estudios funcionales o recolectarse para la caracterización molecular. La limitación principal de este método es el método de selección negativa utilizado para el enriquecimiento de CTC. A pesar de esta limitación, la generación de modelos PDX a partir de CTC proporciona un modelo experimental novedoso para ser aplicado a la investigación del cáncer de próstata.

Introducción

Paciente xenoinjertos derivados son modelos experimentales cada vez más populares utilizados para la investigación del cáncer. Pueden ser utilizados para la caracterización de biomarcadores y vías biológicas, la evaluación pre-clínica de la eficacia del fármaco, y la creación de avatares para terapias contra el cáncer personalizados ^1,2. Anteriormente, otros grupos de investigación han desarrollado modelos PDX ya sea mediante la implantación o la inyección de suspensiones de células tumorales individuales o explantes tumorales en ratones inmunocomprometidos conjunto ^1. Estos PDX modelos requieren colección quirúrgica del tumor sólido fresca, ascitis maligna o derrame pleural de un paciente sometido a un procedimiento quirúrgico que es costoso y expone al paciente a un mayor riesgo de morbilidad iatrogénica.

Un reciente desarrollo significativo en la investigación del cáncer ha sido la detección, aislamiento y caracterización de células tumorales circulantes. Estas células tumorales escapan de la masa del tumor primario y entran en la circulacióndonde juegan un papel crítico en la metástasis y la recaída, la causa más común de cáncer de la mortalidad relacionada ^3. La evaluación y caracterización de CTC de varios tipos de tumores sólidos han proporcionado información clínica para el diagnóstico, el pronóstico y el seguimiento de la enfermedad residual ^3. Una variedad de enfoques que se utilizan actualmente que dependen de cualquiera de las propiedades físicas, la expresión de biomarcadores, o características funcionales de las CTC se puede utilizar para aislar de manera eficiente CTC ^4. Métodos existentes macroescala de aislamiento CTC incluyen centrifugación en gradiente de densidad, filtración físico con poros del filtro y la separación contra moléculas de la superficie. Las metodologías de aislamiento CTC más utilizados se basan en la captura basada en anticuerpos de los CTC. Tanto selección positiva y negativa de los marcadores de la superficie celular puede emplearse para aislar CTC partir de sangre periférica. La selección positiva para las CTC en la circulación periférica utiliza comúnmente marcadores epiteliales (por ejemplo, EpCAM), que unare expresado en los CTC, pero las células no hematopoyéticas. La desventaja de este método es que las CTC con potencial metastásico a menudo han sido objeto de epitelio-mesenquimal transición (EMT), que regula a la baja marcadores de superficie ³ epiteliales. Con el fin de aislar las CTC con potencial metastásico, una metodología de selección negativa que emplea el marcador de superficie hematopoyético, CD45, para agotar la población celular normal de leucocitos se puede utilizar ^5.

El cáncer de próstata es el cáncer más comúnmente diagnosticado y la principal causa de muerte por cáncer en los hombres ^6. Los mecanismos de la progresión del tumor y la agresividad no se conocen y por lo tanto la generación y caracterización de modelos experimentales que recapitular la heterogeneidad molecular de cáncer de próstata son de gran interés. Modelos PDX de cáncer de próstata han sido generada previamente por injerto de células de cáncer de próstata humanos en immunocomratones prometidos ^7,8. Sin embargo la generación de tales modelos se ha visto obstaculizada por la baja tasa de injerto de cáncer de próstata en ratones inmunocomprometidos, que se atribuye principalmente a la naturaleza indolente de la enfermedad. Recientemente, las CTC se han utilizado para generar el cáncer de mama ^9, cáncer de pulmón y cáncer de próstata ^{10 11 modelos} PDX. Estos estudios de prueba de concepto introducido la posibilidad de generar PDX modelos independientes de la necesidad de la recolección de la muestra quirúrgica. En este artículo se describe con detalle un método para la generación de este nuevo modelo experimental.

Protocolo

Este protocolo se ha realizado en nuestra institución con la aprobación del comité de ética de investigación institucional y cumple con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano.

1. Recolección de sangre periférica de pacientes con cáncer de próstata avanzado

Nota: Seleccione pacientes con cáncer de próstata metastásico. Obtener el consentimiento escrito del paciente y registrar las características clínicas de los pacientes, incluyendo la edad en el aislamiento y la quimioterapia previa y tratamientos hormonales. Los pacientes con enfermedad metastásica serán potencialmente tienen mayor concentración de CTC en sangre periférica.

1. Recoger muestras de sangre después de consentimiento informado y bajo una Junta de Revisión Institucional adecuado protocolo aprobado. Use guantes de látex y una bata de laboratorio durante todo el procedimiento.
2. Conecte 25 G aguja de mariposa y el tubo de soporte de la aguja. Utilice un algodón con alcohol para limpiar el área devena antecubital entre el bíceps y el antebrazo, a continuación, aplicar torniquete en el brazo del paciente.
3. Inserte la aguja en la vena antecubital mariposa y empuje el tubo de extracción de sangre en el soporte de la aguja para comenzar colección. Recoger aproximadamente 10 ml de sangre en tubos de recogida que contienen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para evitar la coagulación.
4. Retire la aguja de mariposa de paciente y aplicar presión con una gasa estéril sobre el sitio de la punción de la vena durante 1 min. Sitio de la cubierta con un vendaje estéril.

2. Aislamiento de células mononucleares

Nota: La sangre recogida desde el paso 1 contendrá las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (por ejemplo, linfocitos y monocitos) además de las CTC mononucleares.

1. Toda Pipetear 50 ml de sangre en tubo cónico de poliestireno con un 5 ml pipeta serológica y añadir Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) en una proporción de 1: 1. Suavemente mezcla pipeta para homogeneizar.
2. Añadir 15 ml de una solución preparada comercialmente (Ficoll-Paque) para separar componentes de la sangre por la baja velocidad de centrifugación en gradiente de densidad a un tubo cónico de 50 ml de poliestireno vacío.
3. Pipeta suavemente sangre entera y mezcla de HBSS, desde el paso 2.1, en el tubo de poliestireno desde el paso 2.2, para formar la capa superior distinta. Set pipeta para ajuste más bajo para reducir al mínimo la mezcla de soluciones, esto asegurará la separación eficiente.
4. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a TA (25 ° C). Establecer desaceleración valor más bajo para evitar la mezcla de las soluciones después de la separación. La aceleración puede ser ajustado a cualquier velocidad.
5. Después de la centrifugación, identificar la delgada franja de color gris blanco de la capa de PBMC y CTC intercalado entre el plasma en la solución de la parte superior y la separación en la parte inferior del tubo.
6. Recoger las células de la raya blanco-gris en el paso 2.5 en un tubo de 50 ml de poliestireno usando una pipeta de transferencia de plástico.
7. Añadir HBSS a 50 ml tubo cónico de poliestireno con PBMCs y CTC y centrifuge de nuevo a 400 xg durante 10 min RT para lavar.
8. Decantar pellet líquido y resuspender en 50 ml de HBSS y se centrifuga de nuevo a 400 xg durante 3 min a TA para lavar.
9. Descartar el sobrenadante, resuspender el sedimento restante con 5 ml de glóbulos rojos Tampón de lisis y se incuba la disolución durante 5 min a TA.
10. Retire la célula de sangre roja tampón de lisis por centrifugación a 400 xg durante 3 min a TA.
11. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de PBS 1x suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) para bloquear antes de la tinción de anticuerpos.

3. Las células mononucleares de tinción con CD45-FITC anticuerpos de fluorescencia de células activadas (FACS)

1. Cuantificar el número de células viables (azul de tripano negativas) (del paso 2,11) utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Prepare un 1 x 10 ⁶ células / ml suspensión (en PBS 1x con 10% de SFB) y colocarlo en hielo durante 1 hora.
2. Distribuya el cuantificadosuspensión de células de la etapa anterior en dos tubos. Tubos de etiqueta como el control y la tinción de CD45.
3. En el tubo de control, añadir IgG1k-FITC (2,5 mg / ml) a una dilución de 1: 250. En el tubo de tinción CD45, CD45 añadir FITC (2,5 mg / ml) conjugado anticuerpo primario a una dilución de 1: 250 y se incuban las suspensiones de células en hielo durante 30 min. Etiquetado antígeno CD45 se utiliza para excluir células hematopoyéticas.
4. Centrifugar las células a 400 xg durante 3 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
5. Lavar las células dos veces, mediante la suspensión de cada sedimento con PBS estéril 1 x suplementado con 10% FBS seguido de centrifugación a 400 xg durante 3 min a 4 ° C.
6. Resuspender las células en una solución de 1 ml de 1x PBS que contenía 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a una concentración de 10 mg / ml.
7. Filtrar la solución final a través de las tapas colador 35 micras a 12 mm tubos de poliestireno x 75 mm.

4. Aislamiento de próstata por CTCFACS

Nota: Utilice un citómetro de flujo para recoger CTC negativos en vivo CD45.

1. Controles de ajustar la compensación utilizando células del tubo etiquetado, "Control".
2. Crear puertas que excluyen escombros y grupos de células que utilizan parámetros de dispersión frontal y lateral de dispersión adecuados.
3. Establecer las puertas FITC utilizando las suspensiones de células del tubo etiquetado ", CD45-FITC."
4. Células viables (Gate-DAPI negativo) con el Pacífico azul-Un canal.
5. Recoger negativo de la población CD45 en un tubo cónico estéril de 15 ml de poliestireno que contiene 2 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% de FBS.
6. Centrifugar la suspensión de células tumorales de próstata ordenados a 400 xg durante 3 min, a continuación, volver a suspender los gránulos en 200 - 500 l de RPMI suplementado con 10% FBS.

5. La inyección de CTC en ratones y Monitoreo de Crecimiento Xenoinjerto

Nota:Realizar todos los procedimientos con animales en el cumplimiento de los protocolos aprobados por el comité de cuidado de los animales institucional. Este protocolo se ha realizado en nuestra institución bajo un uso Protocolo específico Animal aprobado por nuestro Comité de Cuidado de Animales de conformidad y el cumplimiento de todas las normativas e institucionales agencias, regulaciones y directrices pertinentes.

1. Mezclar la suspensión de células tumorales de próstata ordenados con la matriz extracelular en una proporción de 1: 1 y el lugar en hielo.
2. Anestesiar ratón antes de la implantación subcutánea en una cámara de suministro de 5% (v / v) isoflurano inhalado en 1 L / min de oxígeno. Asegurar la anestesia adecuada mediante la comprobación de la pérdida de la córnea y la punta reflejo en el ratón.
3. Usando una aguja de 25 G y una jeringa de 1 ml, inyectar 250 l de células tumorales de próstata y la matriz extracelular por vía subcutánea suspensión celular en ambos flancos superiores de 8-10 semanas de edad de ratón inmunodeficiente masculino. Inyectar 250 l independientemente de la concentración de CTC como el volumen de inyección es la ivalor mportante. Administración Máxima SQ en el ratón no es más de 1 ml.  
4. Monitorear los ratones mediante la realización de la palpación semanal de los sitios de inyección de ratón para el crecimiento de las densidades nodulares subcutáneas y midiendo el peso ratones dos veces a la semana.
5. La eutanasia a los ratones mediante asfixia con dióxido de carbono seguido por dislocación cervical y cosecha subcutáneos xenoinjertos de cáncer de próstata humano cuando el tamaño del tumor es más de 0,5 cm y menos de 1 cm en su mayor diámetro para asegurar el tejido tumoral suficiente para los análisis moleculares y el paso en serie. La eutanasia a los ratones con signos de sufrimiento o pérdida de peso del 15% a pesar de ningún tumor es palpable.

Resultados

Este protocolo dará lugar a la generación de modelos de PDX aislados CD45 próstata negativa CTC cancerosas. Basado en el método de selección negativa utilizado en nuestro protocolo es necesario para excluir las células muertas usando DAPI mancha. El porcentaje de células CD45 negativas detectado por citometría de flujo es variable y depende de la carga del tumor del paciente (Figura 1A). La tinción inmunofluorescente de células no clasificadas utilizando CD45 y DAPI (para identificar los núcleos celular...

Discusión

Este manuscrito describe un método para la generación de modelos de cáncer de próstata a partir de PDX CTC. El uso de CTC para la generación de PDX modelos tiene varias ventajas potenciales importantes en comparación con los métodos existentes. En primer lugar, la colección accesible de CTC de la sangre periférica permite la generación de modelos experimentales del mismo paciente en diferentes estadios de la enfermedad. En segundo lugar, la recogida de sangre representa un método más seguro y barato p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Instituto Conmemorativo de Roswell Park (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicilina Estreptomicina	Gibco Life Technologies	15140-122
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µ m Filtro de células	BD Falcon	352340
50 ml tubo cónico de poliestireno	Crystalgen	23-2263
Tampón de lisado de glóbulos rojos	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Tubos de poliestireno con tapón de filtro de células	BD Falcon
BD Vacutainer Tubos de recolección de sangre de lavanda con EDTA
Juego de recolección de sangre alado BD con botón pulsador Aguja retráctil calibre
BD Vacutainer Portaagujas
Torniquete
Guantes
de látex o sin látexhisopos con
2 x 2 gasas de
Venda
Aguja de 25 G Jeringa
de

35223523de un usode látex desechablealcoholalgodónadhesiva 1 ml