La investigación traslacional del cáncer depende de la extracción de tejidos humanos. Se ha trabajado mucho en la optimización de los métodos de extracción para el análisis ex vivo. Aquí, describimos los métodos de procesamiento de tejidos que permiten la máxima salida de datos a partir de muestras limitadas.
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Artículo de método
Trabajar con Tejidos Humanos para la Investigación del Cáncer Traslacional
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Resumen
Resumen
La investigación médica para beneficio humano se ve obstaculizada en gran medida por la necesidad de tejidos y sujetos humanos. Sin embargo, al obtener el consentimiento para los especímenes humanos, las muestras preciosas deben manipularse con el mayor cuidado para garantizar la integridad de los órganos, tejidos y células en el más alto grado. Desafortunadamente, el procesamiento de tejidos, por definición, requiere la extracción de tejidos del huésped, un cambio que puede causar un gran estrés celular y tener importantes repercusiones en los análisis posteriores. Estas tensiones podrían dar lugar a que el espécimen ya no sea representativo del sitio del que se extrajo. Por lo tanto, se debe seguir un protocolo estricto mientras se procesan estos especímenes para garantizar la representatividad. También se deben tener en cuenta los ensayos deseados para garantizar que se utilice una técnica óptima para el procesamiento de la muestra. A continuación se describe un protocolo para la recuperación de tejidos, el procesamiento y diversos análisis que se pueden realizar en el tejido procesado con el fin de maximizar la producción posterior a partir de muestras de tejido limitadas.
Introducción
La investigación médica se ha beneficiado enormemente del estudio tanto de líneas celulares humanas como de modelos animales. Las líneas celulares permiten un mejor control de los componentes de un sistema, así como el uso de células del organismo adecuado. El trabajo con células humanas, aunque más representativo, presenta una instantánea drásticamente simplificada de los mecanismos que pueden ser responsables de la salud y la enfermedad, ya que las líneas celulares pueden no recapitular el impacto de otras células, componentes estromales y órganos que puedenafectar las respuestas. Por otro lado, los modelos animales, aunque no son del todo precisos en la ....
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Protocolo
Declaración de ética: Este protocolo está aprobado por el MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas.
1. Adquisición de muestras
- Recoja muestras de tejido de investigación del tumor sobrante y del tejido normal relacionado10-12. Almacene las muestras sobre hielo húmedo para evitar la autólisis.
- Enviar todos los tejidos, dispositivos médicos y cuerpos extraños extraídos durante un procedimiento quirúrgico al Departamento de Patología para el examen necesario con el fin de facilitar un diagnóstico patológico.
- Manejar el tejido asignado para la investigación de acuerdo con las políticas y procedimientos aplicabl....
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Resultados
Los resultados mostrados a continuación ilustran la estrategia de selección por citometría de flujo para la fenotipificación inmune amplia en un tumor de melanoma procesado. El día de la tinción, la muestra de tejido se digirió y homogenizó mediante incubación con colagenasa I y DNasa I durante 60 min a 37 °C con rotación de 225 RPM. Tras la digestión, la suspensión celular se filtró a través de un filtro celular de 70 µm para eliminar restos celulares, y las células se marcaron con anticuerpos fluorescentes para citomet.......
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Discusión
En última instancia, los métodos de procesamiento deben estar dictados por la hipótesis deseada y los ensayos técnicos anticipados que se realizarán (Figura 1). La siguiente sección sirve como una descripción general para describir los posibles ensayos que se pueden realizar en dichas secciones de tejido. No es de ninguna manera una descripción exhaustiva, pero está destinado a ayudar a guiar los métodos de procesamiento de muestras y la elección de ensayos posteriores mediante la descripción de técnicas.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las contribuciones filantrópicas de la Fundación Conmemorativa John G. y Marie Stella Kenedy (Subvención #0727033) y la Alianza para la Investigación del Melanoma. Los autores desean agradecer al Banco Institucional de Tejidos (ITB) del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas por coordinar la distribución y recolección de tejidos y facilitar la investigación traslacional, así como al Dr. Ignacio Wistuba, al Dr. Víctor Prieto, al Departamento de Patología del MD Anderson Cancer Center y al Programa Moon Shot de Melanoma. Por último, los autores desean expresar su reconocimiento a todos los pacientes y familiares afectados por el melanoma....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agujas | BD | 305167 | |
| Bisturíes desechables de acero inoxidable | Miltex | 4-410 | |
| Placa de cultivo de tejidos | Corning | 353003 | |
| Casetes de biopsia | Thermo Fisher | 58931 | |
| Solución estabilizadora de ARN | Ambion | AM7021 | |
| 1,5 ml Tubos Eppendorf | Phenix | MAX-815 | |
| Tubos de 50 ml | Corning | 430290 | |
| 10% Formalina tamponada neutra | Productos médicos | StatLab 28600-5 | |
| Contenedores de formalina | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Solución de temperatura de corte óptima (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Colagenasa I | Roche | 11088793001 | |
| 70μ Filtros de células m | BD Bioscience | 352350 | |
| Placas inferiores redondas de 96 pocillos | Corning | 3799 | |
| Solución de tinción Vivo/Muerto | Life Technologies | L34957 |
Referencias
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
