La investigación traslacional del cáncer depende de la extracción de tejidos humanos. Se ha trabajado mucho en la optimización de los métodos de extracción para el análisis ex vivo. Aquí, describimos los métodos de procesamiento de tejidos que permiten la máxima salida de datos a partir de muestras limitadas.
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Artículo de método
Trabajar con Tejidos Humanos para la Investigación del Cáncer Traslacional
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Resumen
Resumen
La investigación médica para beneficio humano se ve obstaculizada en gran medida por la necesidad de tejidos y sujetos humanos. Sin embargo, al obtener el consentimiento para los especímenes humanos, las muestras preciosas deben manipularse con el mayor cuidado para garantizar la integridad de los órganos, tejidos y células en el más alto grado. Desafortunadamente, el procesamiento de tejidos, por definición, requiere la extracción de tejidos del huésped, un cambio que puede causar un gran estrés celular y tener importantes repercusiones en los análisis posteriores. Estas tensiones podrían dar lugar a que el espécimen ya no sea representativo del sitio del que se extrajo. Por lo tanto, se debe seguir un protocolo estricto mientras se procesan estos especímenes para garantizar la representatividad. También se deben tener en cuenta los ensayos deseados para garantizar que se utilice una técnica óptima para el procesamiento de la muestra. A continuación se describe un protocolo para la recuperación de tejidos, el procesamiento y diversos análisis que se pueden realizar en el tejido procesado con el fin de maximizar la producción posterior a partir de muestras de tejido limitadas.
Introducción
La investigación médica se ha beneficiado enormemente del estudio tanto de líneas celulares humanas como de modelos animales. Las líneas celulares permiten un mejor control de los componentes de un sistema, así como el uso de células del organismo adecuado. El trabajo con células humanas, aunque más representativo, presenta una instantánea drásticamente simplificada de los mecanismos que pueden ser responsables de la salud y la enfermedad, ya que las líneas celulares pueden no recapitular el impacto de otras células, componentes estromales y órganos que puedenafectar las respuestas. Por otro lado, los modelos animales, aunque no son del todo precisos en la reproducción de enfermedades humanas y heterogeneidad genética, ofrecen más información al permitir la entrada de sistemas animales completos en la mayoría de los modelos2,3.
Dejando a un lado las deficiencias, ambos métodos tienen sus beneficios y son complementarios. Sin embargo, el objetivo principal sigue siendo estudiar las células y los órganos humanos, en un sistema multiorgánico de cuerpo completo. En consecuencia, la investigación traslacional ha dado grandes pasos para facilitar el estudio de los órganos y tejidos humanos extraídos de los pacientes, con el fin de comprender mejor los mecanismos subyacentes a la enfermedad. La investigación traslacional ofrece la ventaja de estudiar el resultado de tratamientos y enfermedades en todo el cuerpo y en células apropiadas, proporcionando así lo mejor de ambos mundos entre el trabajo celular y animal4.
La investigación traslacional tampoco está exenta de defectos. Los especímenes recolectados de pacientes humanos, una vez retirados del huésped, se someten inmediatamente a isquemia y otros factores externos de los que, de otro modo, estarían protegidos. Esto puede dar lugar a cambios moleculares y genéticos inducidos por el estrés, y causar sesgos en estudios posteriores. Por lo tanto, se ha puesto mucho esfuerzo en la extracción y el procesamiento de tejidos a través de métodos estrictos para preservar mejor la integridad de los órganos y las células para los estudios posteriores5. Es importante destacar que las aplicaciones futuras deben considerarse detenidamente a la hora de seleccionar los métodos de procesamiento de muestras humanas, ya que ciertos métodos pueden ser perjudiciales para los componentes celulares y las vías de señalización, sin afectar a otros.
Para cualquier investigación que involucre tejidos humanos, se deben abordar los problemas regulatorios. Después de los informes Tuskegee y Belmont, hubo una creciente aceptación del hecho de que la investigación biomédica estaba asociada con riesgos inherentes que a menudo resultaban en dilemas éticos inevitables6. Se reconoció la necesidad de normas nacionales y el gobierno federal creó las Juntas de Revisión Institucional (IRB) como medio para defender los principios del Informe Belmont (Respeto a las personas, Beneficencia, Justicia).
El IRB de cualquier institución es un comité de médicos, investigadores y miembros de la comunidad que son responsables de proteger a los participantes en la investigación. Requiere que se obtenga el consentimiento voluntario de todos los participantes de los estudios de investigación biomédica, y que este consentimiento se documente en un formulario de consentimiento informado. El proceso de consentimiento informado tiene como objetivo proporcionar información adecuada a un participante, de modo que se pueda tomar una decisión informada sobre si inscribirse o no en un estudio, o continuar participando. En este sentido, el documento de consentimiento informado debe tener buena legibilidad y estar redactado en un lenguaje que pueda ser fácilmente comprensible (nivel de lectura de6º a8º grado) por la población objetivo. Se debe reducir al mínimo la posibilidad de coerción o influencia indebida, y se debe dar al sujeto tiempo suficiente para considerar la participación. El participante también debe poder ejercer su derecho a retirar el consentimiento en cualquier momento durante el curso del estudio sin penalización. El consentimiento informado voluntario es un requisito previo obligatorio para la participación de un sujeto en la investigación y también tiene efecto legal7.
De acuerdo con las regulaciones para la protección de sujetos humanos 21 CFR 50.25 (http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html8), los participantes del estudio deben ser informados del propósito de la investigación, los procedimientos involucrados en la investigación, las alternativas a la participación, todos los riesgos y molestias previsibles (incluyendo no solo lesiones físicas, sino también posibles lesiones psicológicas, sociales o daño económico, incomodidad o inconveniencia), beneficios de la investigación para la sociedad y posiblemente para el individuo, tiempo durante el cual se espera que el sujeto participe, persona a contactar para obtener respuestas a preguntas o en caso de una lesión o emergencia relacionada con la investigación, declaración que indique que la participación es voluntaria y que la negativa a participar no tendrá ninguna consecuencia ni ninguna pérdida de beneficios, como un compromiso en la atención clínica regular que el participante Por lo demás, tiene derecho a recibir como resultado de sus diagnósticos y, finalmente, una declaración sobre el derecho del sujeto a la confidencialidad y el derecho a retirarse del estudio en cualquier momento sin ninguna consecuencia. Las muestras de tejido de los participantes que retiren su consentimiento durante el transcurso del estudio no deben almacenarse en bancos y deben agotarse inmediatamente. La renuncia a uno o más elementos del consentimiento informado puede obtenerse del IRB para algunos proyectos de investigación que prácticamente no podrían realizarse sin una alteración de los elementos requeridos o para estudios en los que los elementos requeridos no son aplicables. Se debe tener mucho cuidado para garantizar la confidencialidad de los datos. La Ley de Portabilidad y Responsabilidad de Seguros Médicos (HIPAA, por sus siglas en inglés) es una ley federal que impide el uso o la divulgación de "Información Médica Protegida" (PHI, por sus siglas en inglés) sin el consentimiento por escrito de los participantes. La PHI incluye, pero no se limita a, información de salud transmitida o mantenida en cualquier forma o medio, e incluye campos que podrían usarse para identificar a una persona9.
A través de este trabajo, nuestro objetivo es delinear el protocolo que se debe seguir durante el procesamiento de tejidos, incluida la obtención y el almacenamiento, y enfatizar la importancia de seguir estas pautas estrictas para minimizar los sesgos que pueden resultar debido a las tensiones a las que se somete un tejido durante la extracción. También nos esforzamos por proporcionar una breve descripción general de los ensayos o análisis posteriores (Figura 1) que se podrían realizar en dichos especímenes para que los lectores puedan hacer un juicio calificado sobre qué ensayo (s) se adapta mejor a sus necesidades.
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Protocolo
Declaración de ética: Este protocolo está aprobado por el MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas.
1. Adquisición de muestras
- Recoja muestras de tejido de investigación del tumor sobrante y del tejido normal relacionado10-12. Almacene las muestras sobre hielo húmedo para evitar la autólisis.
- Enviar todos los tejidos, dispositivos médicos y cuerpos extraños extraídos durante un procedimiento quirúrgico al Departamento de Patología para el examen necesario con el fin de facilitar un diagnóstico patológico.
- Manejar el tejido asignado para la investigación de acuerdo con las políticas y procedimientos aplicables de investigación y almacenamiento de tejidos.
NOTA: La recolección de muestras biológicas implica la coordinación de patólogos, asistentes de patólogos, histotecnólogos y especialistas en obtención de tejidos.
2. Aseguramiento de la calidad de la patología (QA)
- Complete y verifique los registros de los pacientes como una medida temprana de control de calidad y consulte a un patólogo para revisar los registros de diagnóstico del paciente (informes de patología, portaobjetos de tejido, etc.) y las muestras de tejido. Juzgar las muestras de tejido en función de las características morfológicas de interés, como el porcentaje de tumor, la necrosis, la interfase tejido-tumoral, etc. Esto está de acuerdo con las mejores prácticas de biorepositorios10-12.
- Después de la revisión inicial, realizar revisiones periódicas de los datos del repositorio biológico y las muestras de investigación durante toda la duración de la estadía del espécimen biológico.
- Vincule los resultados y las anotaciones de las investigaciones histopatológicas y de otro tipo con las muestras y proporcione estos datos a los investigadores a través de un sistema de software de biorepositorio patentado.
NOTA: Los procesos de control de calidad garantizan la integridad de los aspectos clínicos y técnicos de las operaciones de los biorepositorios. - Realizar pruebas genéticas y moleculares para verificar y caracterizar las muestras para uso clínico.
- Recopile y analice datos basados en los comentarios de los investigadores que han estado utilizando las muestras para experimentos de laboratorio. Realice un seguimiento de las muestras mediante la tecnología de códigos de barras. Este sistema de seguimiento electrónico también se recomienda en las mejores prácticas de biorrepositorio10-12.
3. Procesamiento de muestras/tejidos
- Guarde siempre las muestras de tejido fresco en hielo húmedo y procese lo más rápido posible para limitar los cambios inducidos por la extracción de la muestra de tejido de su entorno natural. Procese las muestras de tejido tumoral normal y compatibles con el tumor por separado para evitar la contaminación cruzada.
NOTA: Con base en los protocolos de investigación, el procesamiento de muestras biológicas puede implicar la recolección de las muestras en uno o más tipos de medios. - Antes de comenzar el proceso, prepare una placa de cultivo de Petri estéril, un bisturí, así como una aguja o pinzas para el procesamiento de tejidos. Asegúrese de que los tubos hayan sido preparados, etiquetados y dispuestos para limitar el tiempo de procesamiento de la muestra (Figura 2).
- Toda la información relevante de los tejidos, como el nombre del paciente, el número, el tratamiento, la fecha de la cirugía y otra información relevante que pueda ser apropiada para el estudio, debe ser fácilmente accesible en una base de datos institucional de tejidos. La información limitada del paciente debe conservarse en el laboratorio en papel o en hojas de cálculo.
NOTA: Solo recopile información de muestras biológicas relevante para la naturaleza de la investigación, es decir, investigación biomédica básica, investigación clínica, investigación traslacional, etc. Para obtener información específica de la enfermedad, el personal del repositorio biológico debe recopilar los datos que la bibliografía actual y las organizaciones gubernamentales consideren necesarios para garantizar un diagnóstico adecuado y una investigación significativa. Esto incluye, entre otros, los grados del tumor y la estadificación del cáncer. - Planifique todos los experimentos posteriores deseados con anticipación, para decidir el tamaño de las secciones de tejido necesarias para cada tipo de análisis, así como la ubicación de las escisiones. Idealmente, aunque sea imposible, todos los análisis deben ser representativos de toda la sección de tejido para tener en cuenta la heterogeneidad del tejido y limitar el sesgo de los análisis posteriores. Coloque todos los elementos necesarios con anticipación como se muestra en la Figura 2.
- Coloque la muestra de tejido en la placa de cultivo de Petri abierta, plana contra la superficie.
NOTA: Permitir que solo el personal autorizado del repositorio biológico maneje muestras identificadas y revise los datos de salud identificados. Los investigadores deben acceder solo a los identificadores de pacientes según lo permitido por los consentimientos informados firmados y según lo regulado por el IRB. Todos los especímenes deben estar adecuadamente etiquetados y deben incluir, como mínimo, un número de identificación de tejido único y un tipo de tejido. No incluya ninguna PHI en las etiquetas, de acuerdo con las regulaciones de HIPAA. - Inspeccione la muestra desde todos los ángulos para comprender mejor su estructura y dimensiones. Fije la muestra en el fondo de la placa con la aguja y proceda a dividir el tejido a lo largo de su eje más grande y mejor representativo.
- Corte un pequeño trozo de tejido y colóquelo en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml que contenga 1 ml de solución estabilizadora de ARN. Esta muestra puede colocarse en hielo durante el resto del proceso y almacenarse a 4 °C hasta que se necesite.
NOTA: Cuando se trabaja con ARN, siempre se deben usar guantes y se deben usar puntas de filtro sin ARNasa para limitar las posibilidades de degradación y contaminación del ARN. - Coloque un casete de biopsia abierto y preetiquetado en la tapa de la placa de cultivo de Petri. Corte una rodaja de pañuelo de papel de no más de 3 a 5 mm de grosor y transfiérala al casete. Coloque el casete en formalina tamponada neutra (NBF) al 10% durante un mínimo de 72 horas. Transfiera el casete en etanol al 70% para su almacenamiento a largo plazo antes de la inclusión en parafina.
NOTA: El etiquetado de los casetes debe realizarse con lápiz o con los marcadores recomendados, ya que el uso de xileno durante el procesamiento borrará las etiquetas. - Corta un pedazo de pañuelo y colócalo en un molde de pañuelo. Cubra la sección de tejido con un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) y congélela inmediatamente a -20 °C para la criosección. Esta sección de tejido puede almacenarse a -20 °C hasta que esté lista para la criosección.
- Cortar uno o varios trozos de tejido y transferirlos a un tubo de 50 ml que contenga tampón MACS (1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,5% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)) para su posterior análisis por citometría de flujo. Para la citometría de flujo, pueden ser preferibles muestras más grandes, ya que las células pueden perderse durante la disociación del tumor, la fijación celular y la permeabilización cuando sea necesario. Generalmente, esta sección se puede tomar al final, una vez que se hayan procesado todas las demás piezas. La muestra tumoral representativa sobrante se puede utilizar para la citometría de flujo. Opcionalmente, este tubo puede almacenarse a 4 °C O/N o utilizarse para la tinción por citometría de flujo inmediatamente después de la digestión en una suspensión celular (consulte el Paso 4 - Tinción por citometría de flujo).
- Corte el resto del tejido en trozos no mayores que un tamaño máximo de 0,5 mm x 0,5 mm y transfiéralos a viales criogénicos para su congelación inmediata en nitrógeno líquido. Estas muestras congeladas pueden utilizarse para futuros análisis y fines de colaboración.
NOTA: Se debe tener especial cuidado al trabajar con nitrógeno líquido, ya que el contacto directo puede causar lesiones graves. Los ojos deben protegerse con gafas de seguridad, con protectores laterales o con un protector facial. También se deben usar guantes criogénicos para protegerse de las quemaduras por nitrógeno líquido causadas por salpicaduras y contacto directo. Los guantes deben ajustarse correctamente, pero deben estar lo suficientemente sueltos como para quitarlos rápidamente en caso de que el nitrógeno líquido salpique en ellos.
4. Tinción por citometría de flujo
- Homogeneización de tejidos
- Prepare el medio de digestión con DMEM (40 ml), DNasa I (50 U/ml) y colagenasa I (2 mg/ml). Coloque el tumor fresco o almacenado en O/N en el tampón MACS en la tapa de una placa de Petri y sumérjalo en un medio de digestión.
NOTA: Existen diferentes métodos de digestión, cada uno con ventajas (es decir, expresión de proteínas en la superficie celular, viabilidad). Asegúrese de tener el método adecuado para la aplicación posterior deseada. - Sujeta el tumor al fondo del plato con una aguja y córtalo desde el exterior hasta el centro con un bisturí, hasta que el tumor tenga una textura pastosa. Transfiera la mezcla tumoral a un tubo de 50 ml, selle y colóquelo en una bolsa de plástico para evitar fugas. Transfiera el tubo a una incubadora y gírelo a 225 RPM, 37 °C, 1 hora.
- Filtre la suspensión de células tumorales a través de un filtro de células de 70 μm. Suspensión de la célula centrífuga a 250 x g, 4 °C, 5 min. Vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de tampón FACS (500 ml de PBS, 1 ml de EDTA de 0,5 M de caldo, 10 ml de FCS o FBS).
- Cuente las células con un hemocitómetro y vuelva a suspender a una concentración de 1x107 células/ml. Transfiera 100 μl por pocillo (106 células) en una placa inferior redonda de 96 pocillos para la tinción.
- Prepare el medio de digestión con DMEM (40 ml), DNasa I (50 U/ml) y colagenasa I (2 mg/ml). Coloque el tumor fresco o almacenado en O/N en el tampón MACS en la tapa de una placa de Petri y sumérjalo en un medio de digestión.
- Viabilidad y tinción de anticuerpos
- Añadir 200 μl de solución de tinción de viabilidad a cada pocillo y mezclar. Incubar durante 30 minutos, a 4 °C, en la oscuridad. Centrifugar las células a 250 x g, 4 °C, 5 min, y aspirar el sobrenadante.
- Añadir la mezcla de anticuerpos a la concentración recomendada/titulada (según el fabricante) para los antígenos de superficie en 200 μl de tampón FACS. Incubar las células a 4 °C, 30 min, en la oscuridad. Centrifugar las células a 250 x g, 4 °C, 5 min, y aspirar el sobrenadante.
- Lavar con 200 μl de tampón FACS, centrifugar las células a 250 x g, 4 °C, 5 min, y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 200 μl de tampón FACS y proceda a la citómetro de flujo para su adquisición y análisis.
NOTA : Si realiza tinción por citometría de flujo intracelular, realice las etapas de fijación y permeabilización y la tinción intracelular entre las etapas 4.2.2 y 4.2.3. Si se realiza la tinción de citocinas, las células deben preactivarse antes de la tinción, según se recomienda, y se debe utilizar un inhibidor del transporte y la secreción de proteínas intracelulares, como la monensina, durante la activación para garantizar la retención de los factores solubles. Las células fijas pueden almacenarse a corto plazo (una semana) a 4 °C en la oscuridad antes de su adquisición en un citómetro de flujo.
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Resultados
Los resultados mostrados a continuación ilustran la estrategia de selección por citometría de flujo para la fenotipificación inmune amplia en un tumor de melanoma procesado. El día de la tinción, la muestra de tejido se digirió y homogenizó mediante incubación con colagenasa I y DNasa I durante 60 min a 37 °C con rotación de 225 RPM. Tras la digestión, la suspensión celular se filtró a través de un filtro celular de 70 µm para eliminar restos celulares, y las células se marcaron con anticuerpos fluorescentes para citomet...
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Discusión
En última instancia, los métodos de procesamiento deben estar dictados por la hipótesis deseada y los ensayos técnicos anticipados que se realizarán (Figura 1). La siguiente sección sirve como una descripción general para describir los posibles ensayos que se pueden realizar en dichas secciones de tejido. No es de ninguna manera una descripción exhaustiva, pero está destinado a ayudar a guiar los métodos de procesamiento de muestras y la elección de ensayos posteriores mediante la descripción de técnicas...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las contribuciones filantrópicas de la Fundación Conmemorativa John G. y Marie Stella Kenedy (Subvención #0727033) y la Alianza para la Investigación del Melanoma. Los autores desean agradecer al Banco Institucional de Tejidos (ITB) del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas por coordinar la distribución y recolección de tejidos y facilitar la investigación traslacional, así como al Dr. Ignacio Wistuba, al Dr. Víctor Prieto, al Departamento de Patología del MD Anderson Cancer Center y al Programa Moon Shot de Melanoma. Por último, los autores desean expresar su reconocimiento a todos los pacientes y familiares afectados por el melanoma.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agujas | BD | 305167 | |
| Bisturíes desechables de acero inoxidable | Miltex | 4-410 | |
| Placa de cultivo de tejidos | Corning | 353003 | |
| Casetes de biopsia | Thermo Fisher | 58931 | |
| Solución estabilizadora de ARN | Ambion | AM7021 | |
| 1,5 ml Tubos Eppendorf | Phenix | MAX-815 | |
| Tubos de 50 ml | Corning | 430290 | |
| 10% Formalina tamponada neutra | Productos médicos | StatLab 28600-5 | |
| Contenedores de formalina | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Solución de temperatura de corte óptima (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Colagenasa I | Roche | 11088793001 | |
| 70μ Filtros de células m | BD Bioscience | 352350 | |
| Placas inferiores redondas de 96 pocillos | Corning | 3799 | |
| Solución de tinción Vivo/Muerto | Life Technologies | L34957 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
