Es fundamental en neurobiología y neurovirología tener un sistema in vitro fiable y replicable que sirva como modelo traslacional para lo que ocurre in vivo en las neuronas humanas. Este protocolo describe cómo cultivar y diferenciar células de neuroblastoma humano SH-SY5Y en neuronas viables para su uso en aplicaciones in vitro.
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Artículo de método
La diferenciación de la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma humano
En este artículo
Resumen
Resumen
Tener sistemas apropiados in vivo e in vitro que proporcionen modelos traslacionales para las enfermedades humanas es un aspecto integral de la investigación en neurobiología y neurociencias. Los modelos experimentales in vitro tradicionales utilizados en neurobiología incluyen cultivos neuronales primarios de ratas y ratones, líneas celulares de neuroblastoma, incluidas células B35 de rata y Neuro-2A de ratón, células PC12 de rata y cultivos de corte a corto plazo. Si bien muchos investigadores se basan en estos modelos, carecen de un componente humano y los efectos experimentales observados podrían ser exclusivos de las especies respectivas y pueden no ocurrir de manera idéntica en los humanos. Además, aunque estas células son neuronas, pueden tener cariotipos inestables, lo que hace que su uso sea problemático para estudios de expresión génica y estudios reproducibles de señalización celular. Por lo tanto, es importante desarrollar modelos más consistentes de las enfermedades neurológicas humanas.
El siguiente procedimiento describe un método fácil de seguir y reproducible para obtener cultivos neuronales humanos homogéneos y viables, mediante la diferenciación de la línea celular de neuroblastoma humano cromosómicamente estable, SH-SY5Y. Este método integra varios métodos descritos anteriormente1-4 y se basa en la eliminación secuencial del suero de los medios. La línea de tiempo incluye la inanición gradual del suero, con la introducción de proteínas de la matriz extracelular y factores neurotróficos. Esto permite que las neuronas se diferencien, mientras que las células epiteliales se seleccionan en contra, lo que da como resultado un cultivo neuronal homogéneo. Los resultados representativos demuestran la diferenciación exitosa de las células de neuroblastoma SH-SY5Y de un fenotipo inicial de célula similar a un epitelio a un fenotipo neuronal más expansivo y ramificado. Este protocolo ofrece una forma fiable de generar poblaciones homogéneas de cultivos neuronales que pueden utilizarse para posteriores análisis bioquímicos y moleculares, lo que proporciona a los investigadores un modelo traslacional más preciso de la infección y la enfermedad humana.
Introducción
La capacidad de utilizar en sistemas de modelos in vitro ha mejorado en gran medida el campo de la neurobiología y las neurociencias. Las células en cultivo proporcionan una plataforma eficiente para caracterizar la funcionalidad de las proteínas y los mecanismos moleculares subyacentes fenómenos específicos, para entender la patología de la enfermedad y la infección, y para realizar evaluaciones preliminares de análisis de drogas. En la neurobiología, los principales tipos de modelos de cultivo celular incluyen cultivos neuronales primarios derivados de ratas y ratones, y las líneas celulares de neuroblastoma, tales como células B35 de la rata 5,....
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Protocolo
1. Consideraciones generales
- Véase la Tabla de Materiales / Equipos para obtener una lista de los reactivos necesarios. Realizar todos los pasos bajo estrictas condiciones de asepsia.
- Utilice suero bovino fetal inactivado por calor (hiFBS) para todas las preparaciones de medios de comunicación que incluyen FBS. Para calentar-inactivate, calentar una parte alícuota de 50 ml de FBS a 56 ° C durante 30 min, invirtiendo cada 10 min (véase también la Tabla 1).
Nota: Cuando se utiliza sin FBS inactivación térmica, el fenotipo epitelial progresa más rápidamente a través de cultivos de células SH-....
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Resultados
En la actualidad, hay muchos casos en el campo de la neurobiología y Neurovirology donde se utilizan células SH-SY5Y diferenciadas como un modelo funcional para neuronas humanas 27-36, y de manera importante, las células indiferenciadas pueden carecer de fenotipos tales como la absorción viral óptima 2 que son necesaria para la correcta interpretación. Es fundamental que al utilizar células SH-SY5Y o cualquier otro sistema neuronal in vitro, las células se diferencian en neuronas apropiada.......
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Discusión
El protocolo anterior proporciona un método sencillo y reproducible para generar cultivos neuronales humanos homogéneas y viables. Este protocolo utiliza técnicas y prácticas que se integran varios métodos publicados anteriormente 1-4 y objetivos para delinear las mejores prácticas de cada uno. La diferenciación de las células SH-SY5Y se basa en la privación de suero gradual; la adición de ácido retinoico, factores neurotróficos y proteínas de la matriz extracelular; y la división de serie para seleccionar pa.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos por las contribuciones de Yolanda Tafuri en la optimización de las condiciones para la diferenciación de SH-SY5Y, y por el apoyo de la Dra. Lynn Enquist, en cuyo laboratorio se inició este trabajo. Y. Tafuri contribuyó con las imágenes que se muestran en la Figura 3. Este trabajo contó con el apoyo del Centro de Recursos Bioinformáticos de Recursos de Patógenos Virales (ViPR) de los NIH-NIAID, el Centro de Recursos Bioinformáticos (MLS y L. Enquist) y el AI095384 K22 (MLS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Ver Tabla 1 para la preparación |
| Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μ g)/B3795 (5 y mu; g) | Ver Tabla 1 para la preparación |
| dibutiril cíclico AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | Ver Tabla 1 para la preparación |
| DMSO | ATCC | 4-X-Minimum | |
| Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650-Fetal | |
| Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Ver Tabla 1 para la preparación |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061-Glutamina | |
| Hyclone | SH30034.01-Cloruro | ||
| de potasio (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | Ver Tabla 1 para la preparación |
| la solución MaxGel Extracellular Matrix (ECM) | Sigma | E0282 | Ver paso 11 del protocolo |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049-Penicilina | |
| /Estreptomicina (Pen/Estreptococo) | Life Technologies | 15140-122-Ácido | |
| retinoico (RA) | Sigma | R2625 | Debe almacenarse en la oscuridad a 4 & grados; C porque este reactivo es sensible a la luz |
| Células SH-SY5Y ATCC | CRL-2266-0.5 | ||
| % Tripsina + EDTA | Life Technologies | 15400-054-Falcon | |
| 35 mm TC platos | Falcon (Una marca Corning) | 353001 | - |
Referencias
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J.
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Reimpresiones y permisos
