Este protocolo describe un método para diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo completo de la retina a partir de embriones de pollo. Los cultivos de explantes son útiles cuando alta tasa de éxito, la eficacia y reproducibilidad son necesarios para probar los efectos de plásmidos para la electroporación y / o sustancias de reactivos, es decir, inhibidores enzimáticos.
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Artículo de método
Los explantes de retina enteras de pollo embriones para Tratamientos electroporación y Reactivos Químicos
En este artículo
Resumen
Resumen
La retina es un buen modelo para el sistema nervioso central en desarrollo. El gran tamaño del ojo y lo más importante la accesibilidad para las manipulaciones experimentales en ovo / in vivo hace que el pollo retina embrionaria un modelo experimental versátil y muy eficiente. Aunque la retina de pollo es fácil dirigirse in ovo mediante inyecciones intraoculares o la electroporación, la concentración eficaz y exacta de los reactivos dentro de la retina puede ser difícil de controlar completamente. Esto puede ser debido a las variaciones de la zona de inyección exacta, la fuga desde el ojo o desigual difusión de las sustancias. Además, la frecuencia de malformaciones y mortalidad después de manipulaciones invasivos tales como la electroporación es bastante alta.
Este protocolo describe un ex ovo técnica para el cultivo de explantes de retina enteros a partir de embriones de pollo y proporciona un método para la exposición controlada de la retina a los reactivos. El protocol describe cómo diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo enteros de la retina a partir de embriones de pollo. Los explantes pueden cultivarse durante aproximadamente 24 h, y ser sometidos a diferentes manipulaciones tales como la electroporación. Las principales ventajas son que el experimento no es dependiente de la supervivencia del embrión y que la concentración del reactivo introducido se puede variar y controlado con el fin de determinar y optimizar la concentración efectiva. Además, la técnica es rápida, barata y junto con su alta tasa de éxito experimental, se asegura reproducible resultados. Cabe destacar que sirve como un excelente complemento para los experimentos realizados in ovo.
Introducción
La retina es parte del sistema nervioso central y es, con su relativa simplicidad y la arquitectura celular bien caracterizada, un modelo popular para estudiar el desarrollo del sistema nervioso central. El ojo del embrión de pollo es relativamente grande en comparación con el resto del embrión. Por tanto, es de fácil acceso en ovo de manipulaciones experimentales, tales como inyecciones o electroporación, y sirve como una excelente herramienta para adquirir conocimientos sobre las células de la retina y la biología del desarrollo in vivo. A pesar de estas ventajas importantes, la supervivencia de los embriones puede ser baja cuando los experimentos....
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Protocolo
Este protocolo se realiza de acuerdo con las recomendaciones de la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología".
1. Manipulación del huevo y la recogida de los ojos
- Almacene los huevos Leghorn blancas a 12-14 ° C durante no más de 1 semana. Si está disponible, utilice un enfriador de vino refrigerada para almacenar los huevos fertilizados.
Nota: Las temperaturas más altas del almacén conducen a un desarrollo anormal de los embriones, mientras que las temperaturas más bajas aumenta la mortalidad. Tiempo de almacenamiento extendido aumenta tanto la ....
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Resultados
Este protocolo describe la preparación (Figura 1A-F) y el cultivo de los explantes de retina enteros a partir de embriones de pollo. Este protocolo se ha usado con éxito para explantes de retina a partir de embriones enteros de ST20 (E3) a ST31 (E7).
La electroporación de plásmidos de ADN en explantes de retina enteros permite para el etiquetado y el rastreo de las células progenitoras de la retina o sobre-expresión de diferentes productos génicos. Para los experimentos de e.......
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Discusión
En este trabajo se presenta un protocolo detallado para la disección, la electroporación o tratamiento químico, y el cultivo de los explantes enteros retina de embriones de pollo. Este protocolo es fácil, rápido y permite tanto una alta tasa de éxito y reproducible resultados.
Electroporación de explantes de retina enteros produce grandes áreas de células que expresan el constructo de gen de interés. Es fácil de colocar correctamente los electrodos y para exponer una parte.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
El trabajo fue apoyado por Barncancerfonden (PR2013-0104), el Consejo Sueco de Investigación (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond y St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1xPBS (tableta) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Placa de Petri | VWR | 734-0006 | |
| 100 μ l puntas de pipeta | VWR | 613-0798 | |
| Cubeta de plástico desechable de 1,5 ml | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| Placa de 24 pocillos | Sigma Aldrich | D7039 | |
| Placa de Petri de 35 mm | VWR | 391-1998 | |
| 70% etanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibidor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM en 0,01% DMSO |
| Incubadora de cultivos celulares | Thermo Forma | ||
| Leica | |||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodos | Platina, a medida | ||
| Electro porador cuadrado ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| 31331-028 | |||
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pinza | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Medio de congelación NEG50 | Cellab, Suecia | 6502 | |
| GFP que expresa plásmidos de ADN (pZGs) | |||
| Incubadora humidificada | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Alemania | 8204 | |
| Insulina | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamina | Life Technologies 25030024 | ||
| Medio de montaje ProLong Gold con DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Película de parafina | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehído | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Molde de incrustación Peel-A-Way | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicilina estreptomicina | Life Technologies | 15140-122 | |
| FosfoHistona 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilución 1/4.000 |
| Electrodos de platino (hechos a medida a partir de "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Diámetro: 4 mm, 0,1 mm de espesor |
| Electrodos Platimun | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Pipeta pasteur de polietileno | VWR | 612-2853 | |
| Agitador rotador | VWR | 444-2900 | |
| Cuchara pequeña | VWR | 231-2151 | |
| Sacarosa | VWR | 443815S | |
| Huevos | Proveedor local | ||
| Enfriador de vino | WineMaster 24, Caso, Berlín Alemania |
Referencias
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J.
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Reimpresiones y permisos
