Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Resumen

La técnica de Landis modificada permite la medición emparejada de la conductividad hidráulica de microvasos individuales en el mesenterio de ratas normales y modificadas genéticamente en condiciones de control y prueba utilizando técnicas de microperfusión. Proporciona un método conveniente para evaluar los mecanismos que regulan la permeabilidad de los microvasos y el intercambio transvascular en condiciones fisiológicas.

Resumen

Experimentos para medir las propiedades de permeabilidad de microvasos perfundidos individualmente proporcionan un puente entre la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que regulan la permeabilidad vascular en cultivos de monocapas de células endoteliales y las propiedades de intercambio funcionales de camas microvasculares enteros. Un método para canular y perfundir microvasos venulares de mesenterio de rata y medir la conductividad hidráulica de la pared de microvasos se describe. El equipo principal necesaria incluye un microscopio intravital con una etapa modificado grande que soporta micromanipuladores para posicionar tres Microtools diferentes: (1) una micropipeta de cristal biselado para canular y perfundir el microvasos; (2) un micro-oclusor de vidrio para bloquear transitoriamente la perfusión y permitir la medición de movimiento de circulación de agua transvascular a una presión hidrostática medido, y (3) una varilla de vidrio contundente para estabilizar el tejido mesentérico en el sitio de canulación. El Landis micro-oclusión techniq modificadoue utiliza glóbulos rojos suspendidos en el líquido de perfusión artificial como marcadores de movimiento de fluidos transvascular, y también permite mediciones repetidas de estos flujos condiciones experimentales se cambian y la diferencia de presión osmótica hidrostática y coloidal a través de los microvasos se controlan cuidadosamente. Las mediciones de la conductividad hidráulica primero utilizando un perfundido control, a continuación, después de volver a la canulación de la misma con los microvasos perfundidos de prueba permitir comparaciones de la respuesta de los microvasos bajo estas condiciones bien controladas emparejados. Los intentos de extender el método a los microvasos en el mesenterio de ratones con modificaciones genéticas esperados para modificar la permeabilidad vascular fueron severamente limitadas debido a la ausencia de largas microvasos rectas y no ramificados en el mesenterio ratón, pero la reciente disponibilidad de las ratas con modificaciones genéticas similares utilizando Se espera que la tecnología / Cas9 CRISPR para abrir nuevas áreas de investigación en que los métodos descritos en el presente documento pueden aplicarse.

Introducción

Microperfusión en la vasculatura conlleva establecer el flujo de un líquido de perfusión artificial de composición conocida controla a través de una micropipeta en un vaso sanguíneo por lo general menos de 40 micras de diámetro. El recipiente de perfundido se mantiene dentro de su entorno de tejido normal y es perfundido con la sangre del animal hasta el momento de la canulación. Cuando se utiliza junto con una serie de imágenes de vídeo o técnicas fluorométricos, en microperfusión situ permite la medición de los flujos de agua y de solutos a través de las paredes de los microvasos en condiciones donde se sabe que las fuerzas de conducción para esto....

Protocolo

Declaración de Ética: Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional.

1. Fabricación preliminar de Micropipetas, inmovilización y bloqueadores

1. Tire varios tubos capilares de vidrio de borosilicato limpias en un medio con un extractor electrónica ajustado de manera que, cuando se tira, la porción estirada del tubo es de aproximadamente 1 cm de longitud y las dos mitades son algo simétrica. Asegúrese de que el cono es consistente con las dimensiones de la figura 1. Utilice las dos mitades para micropipetas, inmovilización y bloquea....

Resultados

La Figura 4 muestra los resultados de la medición de la evolución temporal de los cambios en L _p en una rata venular microvasos canulado sucesivamente con cuatro perfundidos. ³³ La magnitud de L _p calculado a una presión constante se usó como una medida de los cambios en la permeabilidad de la pared de los microvasos, primero en el estado de control con un líquido de perfusión que contiene 1% de albúmina de suero bovino a continuación, cuando el recipiente se expone a la.......

Discusión

Los detalles de los cálculos _PL. Aunque el movimiento del fluido transvascular ocurre mientras el buque está libremente perfundido, dicho intercambio es demasiado pequeña para ser medida durante la perfusión libre porque es típicamente menos de 0,01% de la tasa de perfusión buque. Sin embargo, cuando la perfusión se detiene transitoriamente mediante la oclusión de la microvasos, el flujo de transvascular (es decir, la filtración) se mide desde el movimiento de las células rojas de marcador e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MICROSCOPIO, MESA Y PLATINA
microscopio invertido (tipo metalúrgico) con cabezal trinocular para vídeo: ejemplo	Olympus	CK-40	intente colocar los oculares más arriba en relación con la platina: hay que mirar a través de los oculares mientras se extiende hasta la parte superior de la platina sobre los micromanipuladores intermedios
microscopio invertido (tipo metalúrgico) con cabeza trinocular para vídeo: ejemplo	Leica	DMIL	intente colocar los oculares más alto en relación con la plataforma: debe mirar a través de los oculares mientras extiende la mano hasta la parte superior de la etapa sobre los micromanipuladores intermedios
, diámetro estrecho, larga distancia de trabajo objetivo: ejemplo:	Nikon Nikon	Plan E 10 veces; / 0.25 LWD
plataforma de la etapa: taller de soldadura de chapa de acero de 1/2 pulgada o 1 cm,	esto debe ser pesado para reducir la vibración
Mesa Unislide x-y: correderas de cola de paloma	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD: ejemplo	Pulnix	TM-7CN (ya no está disponible)	no se necesita color
sistema de captura de video con audio--sistema de reproducción de video genérico
(fotograma completamente quieto, movimiento de un solo fotograma)
pequeño
micrófono MICROMANIPULADORES, SOPORTES
micromanipulador, XYZ (3)	Anterior/Stoelting (ya no disponible)		busque una Z fina y un rango de recorrido más amplio en unidades gruesas para facilitar el posicionamiento
accionamiento de sonda hidráulica, unidireccional	FHC	50-12-1C	necesita comprar accionamiento manual o accionamiento electrónico
accionamiento manual del tambor	FHC	50-12-9-02
o accionamiento hidráulico, 3 vías	Siskiyou Corporation	MX610 (1 vía) o MX630 (3 vías)	ideal para brazos cortos, lleno de agua y debe enviarse de vuelta para recarga ~ cada 2 años
conectores/varillas/soportes	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB, etc.
tornillo de banco	Starrett	162C	para sujetar el
soporte de pipeta	de retención Manómetro de agua World Prescision Instruments	MPH3
~120 cm
BANDEJA DE
transparente Plexiglás para bandeja de microscopio para animales
Disco de cuarzo pulido de 3/4 de pulgada ~1/4 de pulgada de alto	Cuarzo Científico Inc.	personalizado	( o plexiglás pulido, vidrio); Asegúrese de que la altura sea menor que la distancia de trabajo del objetivo
Pegamento de plexiglás (Weld-on 4: PRECAUCIÓN CARCINOGEN)
adhesivo médico para pozo de tejido	NuSil	MED-1037
Estera térmica de caucho de silicona multiusos, 5" de largo x 2" de ancho	Calentador Cole Parmer	EW-03125-20	para bandeja de microscopio--necesita cable y controlador--versión de 240V disponible
Adaptador de cable de alimentación para calentadores y kits Kapton, 6 pies, 120 VCA	Mezclador Cole	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Controlador de voltaje variable, 10 A; 120 V de entrada, 0-140 V de salida	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
extractor de pipetas vertical	Sutter Instrument Company	P-30 con filamento
Tubo capilar de pared delgada de 1,5 mm de diámetro exterior	Sutter Instrument Company	B150-110-10
amoladora de pipetas aerible piedra y microscopio de disección--vea la referencia en el texto			o compre un paquete de Sutter Instruments o World Precision Instruments
Máquina de bruñir RX, System II	RX Máquina de bruñido Corporation	MAC-10700 Rx Máquina de sistema II	alternativa para la piedra difusora, úsela con un microscopio de disección montado en ángulo
con disco de afilado cerámico	RX Máquina de afilado RX		"tal cual" o adjunte la película de lapeado
hojas de película de lapeado, 0.3 o 0.5 mmm	3M	número de pieza 051144 80827	268X Hojas de película de lapeado imperial con parte posterior adhesiva: se puede comprar en Amazon

Cámara de video MICROSCOPIOde nicromo Uso