En este estudio presentamos un sistema de cultivo in vitro que puede generar eficientemente pDCs mediante el co-cultivo de progenitores linfoides comunes con células alimentadoras AC-6 en presencia de ligando Flt3.
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Artículo de método
En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6
En este artículo
Resumen
Resumen
Células dendríticas plasmacitoides (PDC) son potentes interferón de tipo I (células productoras de IFN-I) que se activan en respuesta a la infección o durante las respuestas inflamatorias. Por desgracia, el estudio de la función PDC se ve obstaculizada por su baja frecuencia en los órganos linfoides, y los métodos existentes para la generación in vitro DC favorecen predominantemente la producción de los CDC sobre PDC. Aquí presentamos un enfoque único para generar eficientemente PDC de progenitores linfoides comunes (CLPS) in vitro. Específicamente, el protocolo descrito detalles cómo purificar CLPs desde la médula ósea y generar PDC por cocultivo con AC-6 células alimentadoras gamma-irradiado en presencia de ligando de Flt3. Una característica única de este sistema de cultivo es que los CLPs migran por debajo de las células AC-6 y se convierten en células de adoquines en la zona de formación de, un paso crítico para la expansión de PDC. Morfológicamente distintos países en desarrollo, a saber, PDC y CDC, se generaron después de aproximadamente 2 semanas con una composición de 70-90% PDC en condiciones óptimas. Típicamente, el número de PDC generados por este método es más o menos 100 veces del número de CLPs sembradas. Por lo tanto, este es un sistema novedoso con el que para generar robustamente el gran número de PDC necesarias para facilitar estudios adicionales en el desarrollo y la función de estas células.
Introducción
Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígeno profesionales que desempeñan un papel importante en el control de las respuestas inmunitarias 1. Mientras que los países en desarrollo son heterogéneos, que se pueden clasificar en dos poblaciones, convencional DC (CDC) y los DC plasmocitoides (PDC) 2,3. Además de los órganos linfoides, CDCs y PDC también se encuentran en tejidos incluyendo pulmón, intestino, piel y 2. La morfología de los CDC y PDC difiere, con CDC expositoras proyecciones dendríticas como y la forma de PDC son como células más plasma. Además, el marcador DC ratón común, CD11c, está más altamente expr....
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Protocolo
C57BL / 6 ratones de tipo salvaje se compraron desde el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (NLAC), Taiwán. Todos los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos. Protocolos y procedimientos de uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Nacional de Taiwán Colegio de Medicina (Número de Permiso: 20120075). Además, los investigadores hicieron todo lo posible para reducir el potencial de dolor, sufrimiento o angustia en los animales, mientras que la realización de experimentos. Todos los procedimientos descritos se llevaron a cabo a temperatura ambiente, mientras que ....
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Resultados
Un total de 4-6x10 7 células BM normalmente están aislados de los fémures y tibias de un solo 6/8 semanas de edad, de tipo salvaje C57BL / 6 mouse. Para resolver CLPs, células totales BM se tiñeron con anticuerpos conjugados con PE contra marcadores de linaje (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119, y MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC y anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analizados y ordenados con un clasificador de células. La estrategia de clasificación de CLP se mues.......
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Discusión
Aquí se describe un sistema de cultivo in vitro para la generación de DCs robusta, y PDC, en particular, a partir de un pequeño número de CLPs. La singularidad de este sistema de cultivo se debe a la utilización de AC-6 células, una línea celular estromal, como alimentadores. Este enfoque ha sido demostrado para proporcionar no sólo las citoquinas, tales como IL-7, SCF, M-CSF y FL 20, sino también el contacto célula-célula 21 necesario para apoyar el desarrollo DC. AC-6 células se han util.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos a los Dres. Markus Manz y Irving Weissman para proporcionar reactivos. También reconocemos el servicio prestado por el análisis de citometría de flujo y Cell Sorting Core Instalación de la Primera y Segunda Laboratorio Core en la Universidad Nacional de Taiwán Facultad de Medicina y Hospital NTU, respectivamente. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) y los Institutos Nacionales de Investigación de la Salud, Taiwán (INDH-EX102-10256SI y INDH-EX103-10256SI).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anti-ratón Ly6g/Ly6c (PE), clon RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | marcador |
| Anti-ratón NK1.1 (PE), clon PK136 | Biolegend | 108708 | marcador de linaje |
| Anti-ratón CD11b (PE), clonM1/70 | Biolegend | 101208 | marcador de linaje |
| Anti-ratón CD19 (PE), clon eBio1D3 | Biolegend | 115508 | marcador de linaje |
| Anti-ratón B220 (PE), clon RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | marcador de linaje/FACS |
| Anti-ratón CD3 (PE), clon 17A2 | Biolegend | 100308 | marcador de linaje |
| Anti-ratón CD8a (PE), clon 53-6.7 | Biolegend | 100707 | marcador de linaje |
| Anti-ratón MHC-II (PE), clon NIMR-4 | Biolegend | 107608 | marcador de linaje |
| Anti-ratón Ter119 (PE), clon TER-119 | Biolegend | 116208 | marcador de linaje |
| Anti-ratón Thy1.1 (PE), clon HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | marcador de linaje |
| Anti-ratón M-CSFR (APC), clon AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| C-Kit antiratón (PerCP/Cy5.5), clon 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-ratón Sca-1 (FITC), clon D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-ratón IL-7Ra (PE/Cy7), clon A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-ratón CD11c (PerCP/Cy5.5), clon N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Antiratón CD11b (FITC), clon M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Clasificador de células | |
| FACS tubo de clasificación | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software de análisis de flujo |
Referencias
- Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A.
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Reimpresiones y permisos
