Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

Resumen

Los métodos presentados proporcionan instrucciones paso a paso para la realización de una colección de ensayos respirométricos basados en microplacas utilizando mitocondrias aisladas de cantidades mínimas de músculo esquelético de ratón. Estos ensayos son capaces de medir los cambios/adaptaciones mecanicistas en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal comúnmente utilizado.

Resumen

Las mitocondrias del músculo esquelético desempeñan un papel específico en muchas patologías patológicas. Como tal, la medición del consumo de oxígeno como indicador de la función mitocondrial en este tejido se ha vuelto más frecuente. Aunque existen muchas tecnologías y ensayos que miden las vías respiratorias mitocondriales en una variedad de células, tejidos y especies, actualmente existe un vacío en la literatura con respecto a la compilación de estos ensayos utilizando mitocondrias aisladas del músculo esquelético de ratón para su uso en tecnologías basadas en microplacas. Es importante destacar que el uso de ensayos respirométricos basados en microplacas está creciendo entre los biólogos mitocondriales, ya que permite mediciones de alto rendimiento utilizando cantidades mínimas de mitocondrias aisladas. Por lo tanto, se desarrolló una colección de ensayos respirométricos basados en microplacas que pueden evaluar los cambios/adaptaciones mecanicistas en el consumo de oxígeno en un modelo animal comúnmente utilizado. Los métodos presentados en este documento proporcionan instrucciones paso a paso para realizar estos ensayos con una cantidad óptima de proteínas y reactivos mitocondriales, y una alta precisión, como lo demuestra la varianza mínima en el rango dinámico de cada ensayo.

Introducción

La principal función fisiológica de las mitocondrias del músculo esquelético es producir ATP a partir de la fosforilación oxidativa ^1. Es importante destacar que las mitocondrias del músculo esquelético juegan un papel específico en la capacidad de ejercicio ^2, diabetes ^{5 3, 4} y enfermedad degenerativa de tipo II de envejecimiento. Como una sociedad que envejece, y la diabetes tipo II es la ^7ª causa de muerte en los Estados Unidos ^6, la necesidad de métodos que evalúan la función mitocondrial se ha convertido cada vez más frecuente en la investigación biomédica ^7,8. Específicamente, la medición del consumo de oxígeno tiene utilidad excepcional en la evaluación de la función mitocondrial, ya que representa la función coordinada entre los genomas mitocondriales y nucleares para expresar los componentes funcionales de la fosforilación oxidativa ^9.

Varias tecnologías existen que permiten la medición del consumo de oxígeno en las células intactas y aísland mitocondrias ^7-10. Además, los ensayos han sido desarrollados para múltiples tipos de células y tejidos, y en una variedad de especies que permiten la medición de las vías respiratorias mitocondriales y de control ^9,11,12. Sin embargo, en la actualidad existe un vacío en la literatura en cuanto a la recopilación de todos estos ensayos usando mitocondrias aisladas de músculo esquelético de ratón para el uso de las tecnologías de consumo de oxígeno basado en una microplaca. Es importante destacar que el uso de ensayos respirométricos microplacas basado está creciendo entre los biólogos mitocondriales y permite mediciones de alto rendimiento utilizando cantidades mínimas de mitocondrias aisladas ^9. Por lo tanto, una colección de ensayos respirométricos microplacas basado fueron desarrolladas que permiten la localización de dónde anomalías y / o adaptaciones pueden estar ocurriendo en la cadena de transporte de electrones (ETC). Además, dos ensayos respirométricos basados ​​microplaca adicionales fueron desarrolladas que permiten la evaluación de la coordinación between el ácido (TCA) ciclo tricarboxílico y el ETC, y entre ß-oxidación y la ETC. Es importante destacar que los métodos presentados proporcionan una manera clara y concisa para medir los cambios mecánicos en la función mitocondrial en un modelo animal de uso común.

Protocolo

NOTA: Este protocolo comienza después de que uno ha aislado mitocondrias de músculo esquelético rojo. Las mitocondrias se aislaron como se ha descrito previamente a partir de ~ 75 - 100 mg de músculo esquelético rojo ^13. Entre 5 a 10 mg / l de proteína mitocondrial se logrará de esta cantidad de tejido mediante la resuspensión del sedimento final mitocondrial en ≤ 50 l de tampón de aislamiento de las mitocondrias (IBM) 2 (Ver Frisard et al ^13).

1. Configuración

1. Preparar soluciones madre de trabajo (Tabla 1) y solución de ensayo mitocondrial (MAS) mezcla (Tabla 2) para los ensayos posteriores.
   Nota: La mayor parte de la preparación para los ensayos se puede hacer con antelación ya que la mayoría de las existencias de soluciones y el MAS se pueden almacenar.
2. Hidratar un cartucho de ensayo respirométrico en solución de calibración de 1 ml de la noche antes del experimento en una incubadora no CO ₂ a 37 ° C.
3. El día del experimento, take cabo existencias congeladas (sustratos y moduladores mitocondriales, mezcla MAS, MAS w / o BSA, Tabla 1) y deshielo en 37 ° C baño o incubadora.
4. Preparar todas las soluciones de sustrato (Tabla 3) y las inyecciones (Tabla 4-5) y ajustar el pH lo deseas (pH 7,4). Después se ajusta el pH, almacenar en hielo.
5. Programa de la multi-máquina y la medición del consumo de oxígeno a la mezcla adecuada, espere, y los parámetros de medición (Ver Tabla 6) y el fondo de la etiqueta y pozos grupo / condición introduciendo primero el software de análisis, seguido por el modo "Normal".
   1. Entra en el foro de "Invitado" y haga clic en el "Asistente de ensayo". Una vez en el "Asistente de Ensayo", haga clic en "Protocolo" para cambiar la mezcla, esperar y medir los parámetros. Etiquetar los pozos de fondo bajo el "Back. Corrección "ficha y asegúrese de seleccionar" Hacer la corrección de fondo ".
   2. Cond Etiquetaitions por primera clic en la pestaña "Grupos y etiquetas", seguido de la pestaña "Información de Grupo". Después se introducen estos parámetros, haga clic en "Finalizar", seguido de "Guardar plantilla".

2. El ensayo Run

1. Cargue las soluciones de inyección en un cartucho se realiza la prueba y comenzar la calibración introduciendo primero el software de análisis, seguido de entrar en el modo "Normal". Entra en el foro de "Invitado". Abra la plantilla guardada en el paso 1.5 en virtud de la unidad "XF", en la pestaña "Plantillas". Una vez abierto, haga clic en "Inicio" para iniciar la calibración.
   Nota: El cartucho se realiza la prueba se debe introducir en la máquina con la esquina cortada en la parte inferior izquierda. Esto tarda aproximadamente 30 min. Tenga cuidado para inyectar las soluciones en los puertos adecuados. Las inyecciones de la Tabla 4-5 se enumeran en el orden de carga.
2. Suavemente, pero mezclar bien la mitochondria de stock por agitación de la solución con una punta de pipeta 200 l, seguido por trituración con suavidad la culata con una punta de pipeta 200 l que ha tenido su orificio ensanchado mediante el corte ~ 3 mm del extremo de la punta con unas tijeras.
3. Realizar un ácido bicinconínico (BCA) de ensayo para determinar la concentración de proteína de la población mitocondrial.
4. Usando la concentración acciones adquiridas desde el paso 2.3, resuspender 10 g de proteína mitocondrial / 200 l de la mezcla de sustrato succinato / rotenona (Tabla 3). Resuspender 14 g de proteína mitocondrial / 200 l de las mezclas de sustratos restantes (esto debe hacerse para cada mezcla de sustrato) (Tabla 3). Coloque todos mitocondrial proteína / sustrato se mezcla en hielo.
   Nota: La cantidad óptima de proteína mitocondrial por pocillo para cada ensayo se determinó como se ha descrito previamente ^9. Se determinó que el piruvato / malato, carnitina palmitoil / malato, glutamato / malato unad ensayos de flujo de electrones utiliza 3,5 g de proteína mitocondrial, mientras que el ensayo de succinato / rotenona utiliza 2,5 g de proteína mitocondrial por pocillo. Por lo tanto, el investigador necesita para volver a suspender suficiente proteína mitocondrial de 4 repeticiones en este paso, ya sea 2,5 mg o 3,5 mg por 50 l se carga por pozo (Ver el paso 2.6).
5. Mezclar las soluciones mitocondrias / sustrato suavemente, pero a fondo por agitación de la solución con una punta de pipeta 200 l, seguido por trituración con suavidad la culata con una punta de pipeta 200 l que ha tenido ~ 3 mm de su extremo cortado.
6. Colocar una placa de cultivo de células en hielo y por triplicado, carga de 50 l / pocillo de cada una de las mezclas mitocondrias / sustrato. Los desarrolladores de la respirométrico ensayo basado en una microplaca recomiendan dejar un mínimo de dos (no hay mitocondrias) pocillos de blanco, preferiblemente a ambos lados en la placa de cultivo celular.
7. Haga girar la placa de cultivo celular a 2000 g durante 20 min a 4 ° C. Mientras que la placa es sfijando, calentar las soluciones de sustrato en un baño de agua a 37 ° C.
8. Después de la vuelta es completa, cargar cuidadosamente 450 l de cada solución de sustrato en la parte superior de sus respectivos pozos (es decir, cargar el piruvato / sustrato malato a los pozos que tienen mitocondrias inicialmente resuspendidos en esta solución de sustrato). Asegúrese de cargar la placa a temperatura ambiente. Nota: Los pozos en blanco deben ser cargados con 500 l de sustrato. Pozos en blanco designados para el ensayo de flujo de electrones se deben cargar con el sustrato flujo de electrones (piruvato / Malate + FCCP), mientras que los pocillos de blanco ensayo acoplado se pueden cargar con cualquier sustrato de ensayo de acoplamiento.
   Nota: Si la realización de los ensayos de flujo acoplados y electrones en el mismo plato, el investigador debe reasignar pozos de fondo para los ensayos respectivos después de la carrera de ensayo se completa con la plataforma "XF Reader" a través de la pestaña "Instrumento". Una vez dentro de la configuración de "instrumento", haga clic en la "Administración"ficha, seguido de "Corrección de fondo". Haga clic en "Finalizar Modo Configuración del instrumento" cuando haya terminado. Esto se debe a la combinación de ascorbato / TMPD puede consumir O _2, por lo tanto se necesita una corrección de fondo separada para cada tipo de ensayo.
9. Después de la 450 l de sustrato se añadió a cada pocillo, ver la capa de las mitocondrias en el pozo para asegurar que las mitocondrias se dispersan uniformemente en una sola monocapa (magnificación 20X [Ver Rogers ^9, Figura 4]). Wells que no parecen tener una monocapa uniformemente distribuida se pueden quitar post hoc.
10. Después de comprobar la adherencia mitocondrial, inserte la microplaca en el instrumento de ensayo respirométrico e iniciar el ensayo de ejecutar haciendo clic en "Aceptar".
    Nota: La calibración del paso 2.1 debe ser completa antes de que comience la carrera. Una vez que el investigador hace clic en "Aceptar", la máquina se puede extraer la placa de la utilidad que se utilizó para la calibración.
    1. Retire la placa de utilidad y coloque la placa de cultivo celular que contiene la mitocondria en la bandeja. La muesca azul en la placa de cultivo celular debe ser colocado en la esquina inferior izquierda de la bandeja. Haga clic en "continuar" para iniciar el proceso de la prueba.
11. Después de la carrera se ha completado, saque la placa de cultivo celular y el cartucho con la tecla "Eject" en la pantalla.
    1. Una vez que la placa se expulsa, retire y deseche la placa de cultivo celular y el cartucho y haga clic en "Continuar" en la pantalla. La carrera se guardará automáticamente como un archivo .xls en el archivo de "datos".
12. Abra este archivo y cambiar la pantalla de "O2" a "OCR" pulsando la flecha hacia abajo en el marco del "Y1:" marcador.
    1. Siguiente cambio "medio punto" a "Point-to-Point tarifas" bajo la "Velocidad de datos muestran como:" opción. Haga clic en "Aceptar" para aplicar estos cambios.
13. Haga clic en la ficha "Modo Grupo Bueno" en la parte inferior izquierda de la pantalla para pozos grupo de condiciones similares juntos. Por último, haga clic en el "/ muestra La media estándar de error" pestaña hacia el centro de la pantalla, a la izquierda. Alternativamente, estos comandos se pueden configurar antes del ensayo comienza en el ajuste "Asistente de ensayo".
    Nota: Cada estado tendrá una media ± desviación estándar se muestra para cada clase y cada condición. Hay mediciones de la frecuencia tomadas por condición (estado 2 [acoplamiento] / State3u [flujo de electrones] la respiración seguido de cuatro inyecciones). Utilice la media de la tasa de Estado 2 de la segunda medición, determinar Estado 4o en el punto mínimo después oligomicina inyección, utilice el punto máximo de Estado 3 y 3u Estado después de ADP y la inyección FCCP, respectivamente, y utilizar el punto mínimo de la antimicina A la respiración inducida para los ensayos de acoplamiento. Utilice el punto máximo de piruvato / inducida malato Estado respiración 3u, utilice el mínimopunto por rotenona inducida respiración, utilice el punto máximo para inducida succinato 3u Estado respiración, y utilizar el punto mínimo de antimicina A la respiración inducida por el ensayo de flujo de electrones. Todos los experimentos se realizaron 3 veces y los datos que se muestran son los resultados de un trazado representativo.

Resultados

La Figura 1 representa las tasas de consumo de oxígeno (OCR) para el piruvato / malato, succinato / rotenona, palmitoil carnitina / malato, y los ensayos de malato de glutamato / (acoplamiento ensayos). Estos trazados de ensayo se muestran como consumo de oxígeno Rate, o OCR, en función del tiempo, se correceted fondo, y se muestran como las tasas de punto a punto. Cada panel representa el consumo de oxígeno en diferentes estados mitocondriales como se describe por casualidad y Williams ^14. El primer panel representa el consumo basal de oxígeno, o del Estado 2. El segundo panel, después de la inyección de ADP, representa el máximo junto respiración, o el Estado 3. El tercer panel, después de la inyección de oligomicina A (un inhibidor del complejo V), representa la respiración debido a fugas de protones, o Estado 4o. El cuarto panel, después de la inyección de FCCP, representa el máximo de respiración desacoplado o 3u Estado. Finalmente, el quinto panel, después de la inyección de antimicina A, representa la inhibición de la respiración oxidativa. En particular, all estados mitocondriales tienen desviación estándar mínimo. Esto es debido a una mezcla completa de la población mitocondrial y las mezclas de las mitocondrias / sustrato, y el logro de una sola monocapa de las mitocondrias después de la adhesión de centrifugado (Paso 2.6). Por otra parte, la carga de las mitocondrias desiguales en cada pocillo y no alcanzar una sola monocapa de las mitocondrias en el pozo de la microplaca conduce a una mayor desviación estándar en cada estado tal como se muestra en la Figura 2.

Los trazados en la Figura 1 pantalla mesetas para cada estado mitocondrial y para cada sustrato. La meseta alcanzado después de dos ciclos de medición sugiere buena calidad mitocondrial y que las mitocondrias permanecen adheridas al pozo durante toda la duración del ensayo. Además, el logro de tasas máximas plateaued puede ser más deseable ya que esto permite al investigador para tomar el promedio de OCR en estos estados mitocondriales, reduciendo así el sesgo que pueda ocurrirseleccionando arbitrariamente un punto.

La cantidad de mitocondrias por pocillo se determinó mediante ensayos de optimización. La cantidad óptima de las mitocondrias por pocillo debe resultar en el estado 2 tasas entre de 100-200 pmol / min / pocillo y estatales 3 Tasas <1.500 pmol / min / pocillo, ya que estos valores están dentro del rango dinámico del oxígeno de múltiples pocillos de detección de oxígeno el consumo de la máquina de medición. Cargando demasiada proteína mitocondrial por pocillo puede resultar en OCRs más allá del rango dinámico del instrumento (Figura 3A). La Figura 3 representa la carga de 3,5 g de proteína mitocondrial por pocillo (rastreo azul) en comparación con la carga 2,5 g de proteína mitocondrial por pocillo (rojo rastreo) para el ensayo de succinato / rotenona. Cargando demasiada proteína mitocondrial por pozo también puede conducir al agotamiento de oxígeno dentro de la microcámara del pozo, evitando así la medición exacta de OCR para cada medición sucesiva ⁹ (Figura 3B </ strong>). Punto a punto de OCR es la tasa instantánea de cambio de la OCR. Si plana, el OCR es estable / estable, pero si disminuye, entonces no puede ser un problema biológico o técnico. El fuerte descenso de OCR en el estado 3 y la respiración 3u Estado (Figura 3A) es causada por las mitocondrias agotar el suministro de oxígeno antes de la final de la medición (Figura 3B).

La Figura 4 representa OCR frente al tiempo para el ensayo de flujo de electrones. El trazado se corrige y se muestra como se describe para la Figura 1. El primer panel en este ensayo representa la respiración 3u Estado el piruvato / malato mediante I. Complejo El segundo panel, después de la inyección de la rotenona, representa la inhibición del complejo I de la respiración mediada. El tercer panel, después de la inyección de succinato, representa sustrato estimulado 3u Estado con electrones de entrar en la ETC en el Complejo II (Complejo II respiración mediada). El cuarto panel, después de la inyección de Antimycin A, representa la inhibición del complejo III y la respiración tanto totales. Por último, el quinto panel, después de la inyección de ascorbato / TMPD, representa Complejo IV respiración mediada. Similar a los trazados en la Figura 1, todos los estados mitocondriales tener desviación estándar mínima, y cada tasa tiene o casi ha alcanzado una meseta.

Figura 1. Ensayos de acoplamiento. (A) 10 mM piruvato malato / 5 mM, (B) succinato 10 mM / 2 mM rotenona, (C) 40 M palmitoil carnitina / malato de 1 mM, y (D) 10 mM de glutamato / 10 mM malato acoplado mitocondriales trazados de ensayo de respiración tal como se determina mediante la medición de múltiples pocillos de consumo de oxígeno. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Proteína mitocondrial cargado por pozo fue de 3,5 mg para todos los ensayos, excepto succinato / rotenona, que utiliza 2,5 g de proteína mitocondrial por pocillo. Los datos representan n = 3 repeticiones biológicos vinculados. OCR Velocidad = consumo de oxígeno; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = Carbonyl cianuro 4 - (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Anti-A = antimicina A; PYR = piruvato; SUCC = succinato; ROT = rotenona; PAL-C = carnitina palmitoil; GLUT = glutamato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. altamente variable piruvato / Malate Ensayo. 10 mM de piruvato 5 mM / malato ensayo Muy variable causada por la mezcla de forma incompleta las mitocondrias de las existencias mitocondrial en el sustrato / mezcla MAS, lo que conduce a pro mitocondrial variable deproteína de carga en cada pocillo. Proteína mitocondrial cargado por pozo fue de 3,5 mg. Los datos representan n = 3 repeticiones biológicos vinculados. OCR Velocidad = consumo de oxígeno; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = Carbonyl cianuro 4 - (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Anti-A = antimicina A; PYR = piruvato. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. La sobrecarga mitocondrial de proteínas para el / Ensayo rotenona succinato. (A) las tasas de consumo de oxígeno fuera de la gama dinámica de la máquina de medición del consumo de oxígeno de múltiples pocillos causada por la carga de 3,5 g de proteína mitocondrial por pocillo (rastreo azul) en comparación con la carga 2,5 g de proteína mitocondrial por pocillo (rastreo rojo). (B ) BueyyGen tensión cercanos a cero después de ADP y las inyecciones FCCP causados ​​por la carga de proteína mitocondrial excesivo (3,5 mg) por pocillo (trazo azul) en comparación con la carga de una cantidad óptima (2,5 g) de proteína mitocondrial por pozo (trazo rojo). Los datos representan n = 3 repeticiones biológica emparejadas por cantidad de proteína mitocondrial. OCR Velocidad = consumo de oxígeno; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = Carbonyl cianuro 4 - (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Anti-A = antimicina A; SUCC = succinato; ROT = rotenona; _O 2 = oxígeno; mm Hg = milímetros de mercurio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Ensayo de flujo de electrones. 5 mM piruvato / 1 mM malato + 4 M FCCP, electrón fbajo mitocondrial trazado ensayo de respiración según lo determinado por la medición de múltiples pozos de consumo de oxígeno. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Proteína mitocondrial cargado por pozo fue de 3,5 mg. Los datos representan n = 3 repeticiones biológicos vinculados. OCR Velocidad = consumo de oxígeno; Anti-A = antimicina A; Asc = ascorbato; TMPD = N, N, N ', N' -tetrametil- p-fenilendiamina. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivo	Stock Concentración	MW	Volumen final	Misa Agregado	Comentarios / Descripción
	(M)	(g / mol)	(ml)	(go ml)
EGTA, pH 7,2	0.1	380,35	100 ml de 1M Tris Base	3.801 g	Almacenar a 4 ° C
HEPES	1	238.3	250 ml de DiH 2 O	59. 57 g	Almacenar a 4 ° C
MgCl2, hexahidratado	1	203,31	250 ml de DiH 2 O	50,82 g	Almacenar a 4 ° C
Piruvato pH 7,4	0.1	88.06 (Viene como una solución de 14,11 M)	40 ml de DiH 2 O	0,283 ml de ácido pirúvico	Hacer alícuotas de 1 ml y se almacena a -20 ° C, hace fresco cada dos semanas
Succinato pH 7,4	0.5	118.09	100 ml de DiH 2 O	9,4 g de Doácido ccinic	Hacer alícuotas de 1 ml y se almacena a -20 ° C
Malate, pH 7,4	0.5	134.09	100 ml de 95% de etanol	6,7 g de ácido málico	Hacer alícuotas de 200 ly se almacena a -20 ° C
TMPD	0.01	164.25	10 ml	0,0164 g	Hacer 300 alícuotas y almacenar a -20 ° C; Mezclar con una cantidad equimolar de ascorbato para mantener TMPD reducida
Cloruro de palmitoil L-carnitina	0.01	436,07	1,14 ml de 95% de etanol	0,005 g	Hacer 40 alícuotas y se almacena a -20 ° C
Oligomicina A	0,006	791.06	0,987 ml de 95% de etanol	0,005 g	Hacer 20 alícuotas y se almacena a -20 ° C
FCCP	0.01	254,17	3,9 ml de 95% de etanol	0,01 g	Hacer 40 alícuotas y se almacena a -20 ° C
Rotenona	0,001	394.4	10 ml de 95% de etanol	0,0039 g	Conservar a -20 ° C
Antimicina A	0,005	548,63	9.12 ml de 95% de etanol	0.025 g	Conservar a -20 ° C
K + ADP	0.5	501,32	3,9 ml de DiH 2 O	1,0 g	Conservar a -20 ° C
Ácido málico, pH 7,4	0.5	134.09	40 ml	2,68 g	Hacer alícuotas de 200 ly se almacena a -20 ° C

Imagenes Soluciones

Reactivo	Stock Concentración	Misa Agregado	Molaridad final / Porcentaje
	(M)	(go ml)
La sacarosa	-	11,98 g	70 mM
Manitol	-	20,04 g	220 mM
Fosfato de potasio monobásico	-	0,34 g	5 mM
MgCl2, hexahidratado	1	2,5 ml	5 mM
HEPES	1	1,0 ml	2 mM
EGTA	0.1	5,0 ml	1 mM
Esencialmente Fatty Acid Free-BSA	-	1,0 g	0,20%

. Tabla 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: alícuotas de 25 ml y se almacena a -20 ºC * Nota: Excluir BSA para la mezcla MAS utilizado para las inyecciones de ensayo.

Sustrato Medio	Concentración final	Cantidad de acciones (l)	Monto del MAS * (ml)
Piruvato / Malate	10 mM / 5 mM	Piruvato: 1000	9
		Malate: 100
Succicinate / rotenona	10 mm / 2 M	Succinato: 200	10
		Rotenona 20
* Piruvato / Malato + FCCP	5 mM / 1 mM / 4 mM	Piruvato: 500	10
		FCCP: 4
		Malate: 20
Palmitoil L-carnitina / Malate	40 mM / 1 mM	Palmitoilcarnitina: 40 Malate: 20	10
El glutamato / Malate	10 mM / 10 mM	El glutamato: 400	10
		Malate: 200

Tabla 3. Soluciones por sustrato pH 7.4: Hacer fresca del día del experimento. * Solución de ensayo de flujo de electrones.

Medio de inyección	Concentración	Cantidad de acciones (l)	Cantidad de MAS (ml)	Cantidad inyectada en el cartucho	Concentración final
					(Después se inyecta en la placa)
ADP	50 mM	300 l	3	50 l	5.0 mM
Oligomicina A	20 M	10 l	3	55 l	2.0 M
FCCP	40 M	12 l	3	60 l	4.0 M
Antimicina A	40 M	24 l	3	65 l	4.0 M

Tcapaces 4. Las inyecciones para ensayos acoplados pH 7,4:. Hacer fresco el día del experimento. * Ensayos de acoplamiento incluyen (pero no se limitan a) piruvato / malato, succinato / rotenona, palmitoil carnitina / malato, y glutamato / malato.

Medio de inyección	Concentración	Cantidad de acciones (go ul)	Monto del MAS (ml)	Cantidad inyectada en el cartucho	Concentración final (después de inyectada en la placa)
Rotenona	20 M	60 l	3	50 l	2.0 M
Succinato	50 mM	300 l	3	55 l	5.0 mM
Antimicina A	40 M	24 μ; l	3	60 l	4.0 M
TMPD / Ascorabte	1 mM, 100 mM	TMPD: 300 l	3	65 l	100 mM, 10 mM
		Ascorbato: 0.059 g

Tabla 5. Las inyecciones para Electron ensayo de flujo pH 7,4:. Haga fresco el día del experimento

Comando	Tiempo (min)	# De ciclos
Calibre
espera	10 min (para permitir que la placa se caliente desde el paso adherencia)
Mezclar	1 minuto	2
Yoasure	2 minutos
Inyectar A
Mezclar	1 minuto	2
La medida	2 minutos
Inyectar B
Mezclar	1 minuto	2
La medida	2 minutos
Inyectar C
Mezclar	1 minuto	2
La medida	2 minutos
Inyectar D
Mezclar	1 minuto	2
La medida	2 minutos

Tabla 6. Protocolo Run Instrument.

Discusión

Los métodos presentados en este artículo ofrecen paso a paso las instrucciones para la realización de una colección de microplacas basado en ensayos respirométricos utilizando mitocondrias aisladas 75-100 mg de músculo esquelético del ratón. Estos ensayos pueden realizarse con alta precisión como se evidencia por la desviación estándar hermético entre pocillos por triplicado. Es importante destacar que estos ensayos respirométricos permiten la localización de dónde anomalías y / o adaptaciones pueden estar ocurriendo en el ETC, ciclo de Krebs, vía β-oxidación, transportadores de sustratos, etc., en un modelo animal de uso común.

Es importante destacar la justificación del uso de diversos combustibles y los inhibidores utilizados en este protocolo. El piruvato / malato y ensayos respirométricos malato de glutamato / permiten la evaluación del complejo I mediada por la respiración, así como la evaluación de sus respectivos transportadores, y en el caso de glutamato, la desaminasa ^15. Alternativamente, la combinación desuccinato / rotenona permite la evaluación de flujo respiratoria mitocondrial a través de Complejo II de la ETC desde rotenona inhibe el complejo I y succinato proporciona electrones al complejo II a través de la reducción de dinucleótido de flavina adenina (FADH ₂₎ ^15. Estos ensayos proporcionan información específica sustrato como a la eficiencia de acoplamiento y la respiración máxima. El ensayo de flujo de electrones es único en que la combinación de sustratos e inhibidores permite la evaluación de múltiples complejos durante el flujo respiratoria mitocondrial ^9. La mezcla de sustrato inicial de piruvato / malato + FCCP permite la evaluación de la respiración máxima impulsada por el Complejo I, mientras que la inyección de la rotenona seguido de succinato permite la respiración máxima evaluación impulsado por Complejo II. La inyección de antimicina A, un inhibidor del complejo III, seguido por la inyección de ascorbato / TMPD permite la para la evaluación de la respiración impulsado por Complejo IV ya que el ascorbato / TMPD es unadonador de electrones al citocromo C / Complejo IV. Si bien no se obtiene información sobre la eficiencia de acoplamiento, el método es ideal para muy pequeños tamaños de muestra que impiden la ejecución de múltiples sustratos de forma independiente. Finalmente, el uso de carnitina palmitoil / malato permite la evaluación de la coordinación entre la β-oxidación y el ETC desde el equivalente reducir producido a partir de la oxidación del ácido palmítico (β-oxidación) se introduce en la ETC a través de la electrónica de la transferencia de flavoproteína ^15. Cabe señalar que los ensayos de flujo de acoplamiento y el electrón también se podrían usar en tándem para identificar los cambios en la función mitocondrial debido a algún tipo de intervención (tratamiento de drogas, la manipulación genética).

La alta precisión alcanzadas para estos ensayos se debe principalmente a una mezcla completa de las mitocondrias, ya sea antes de la determinación de proteínas, o con las soluciones de sustrato. En este sentido, una vez que las mitocondrias se resuspendend en el solutio sustratons, es fundamental para mezclar esta solución a fondo antes de cargar la placa de cultivo celular como se describe en el paso 2.2 con una punta de pipeta de orificio ensanchado. El no mezclar las mitocondrias bien dará lugar a una gran variación dentro del ensayo. Además, el uso de una punta de pipeta orificio estrecho creará fuerzas de cizallamiento mientras se mezcla la mitocondria y aumenta el potencial de dañar las membranas mitocondriales y la liberación de citocromo C. El paso de la adhesión (2.7) es también un paso crítico en este protocolo. El fracaso para hacer girar la placa cargada de cultivo celular a largo / suficientemente rápido dará lugar a la adhesión incompleta de la mitocondria al pozo, lo que conduce la mayor variabilidad entre los pozos y mediciones.

El protocolo descrito ha sido optimizado para incluir: cargar una cantidad óptima de proteína mitocondrial por pozo, utilizando las concentraciones / métodos de preparación adecuados para hacer soluciones madre y del sustrato, alterando el proceso de la prueba para asegurar pla estado mitocondrialteaus, y la mezcla adecuada de las acciones y mitocondrial / sustrato mezclas mitocondriales. Antes de estos esfuerzos de optimización, los autores encontraron con dificultades en el proceso de la prueba. A continuación se analizan los métodos de solución de problemas / modificaciones que fueron útiles en la optimización de este protocolo. Con respecto a la carga óptima, carga demasiado pequeñas mitocondrias no obtener una respuesta robusta, al cargar demasiado las mitocondrias, se agotará la de oxígeno dentro de la microcámara y dar lugar a mediciones inexactas. Rogers et al ⁹ proporciona ejemplos de la determinación de las cantidades de carga óptimos de mitocondrias por pocillo para ensayos respirométricos basado en una microplaca. Más a menudo, demasiado mitocondrias se carga por pozo como lo demuestra el estado 2 tasas de más de 100 a 200 pmol / min / pocillo y el estado 3 tarifas> 1500 pmol / min / pocillo. Si se produce más de carga, lleve a cabo un experimento con diferentes concentración de proteína mitocondrial (por ejemplo, entre 1 -. 10 g) para obtener OCRs dentro del r dinámicaange de la máquina de medición del consumo de oxígeno. Preparación y las concentraciones correctas de sustratos y acciones es de suma importancia. Utilice siempre una forma ácida de sustratos / inyecciones y ajustar el pH con hidróxido de potasio o HCl; / No se recomiendan los buffers de sodio soluciones. Además, los sustratos resuspender / existencias en DMSO o etanol al 100% resultará en el fracaso de medición o error. Asegúrese de utilizar etanol al 95% cuando se indique. Es común que la carnitina palmitoil para precipitar fuera del etanol al 95% después de descongelar la madre congelado, causando así una gran variabilidad. Asegúrese de calentar el stock de carnitina palmitoil y agitar bien antes de usar. Además, un resultado del ensayo altamente variable piruvato / malato puede ser debido a la piruvato Stock ser> 2 semanas de edad. Asegúrese de rehacer alícuotas congeladas de piruvato cada 2 semanas. El proceso de la prueba fue modificado para mediciones de 2 min para asegurar mesetas estatales mitocondriales. Si se desea la observación del agotamiento de ADP, el investigador puedeextender el tiempo de medición en la pestaña "Protocolo" en el marco del foro "Asistente de ensayo". Por último, una gran variabilidad se produce cuando las soluciones de la Bolsa y las mitocondrias mitocondrial además de sustrato no se homogeneizan completamente antes de la carga. Si la variabilidad entre los pozos es alta después de que el proceso de la prueba, asegúrese de mezclar completamente la solución de sustrato antes de la siguiente experimento. Nunca vórtice las soluciones mitocondrias / sustrato, y no agitar, puré, y se tritura suavemente con una punta de pipeta de orificio ensanchado.

Hay algunas limitaciones de esta técnica que vale la pena destacar. En primer lugar, el número de pocillos en la placa de cultivo celular utilizado para estos ensayos es relativamente bajo (es decir., 24 pozos y al menos 2 designado para pozos en blanco). Si se desea llevar a cabo todos los 5 de estos ensayos en un plato, el investigador sólo es capaz de examinar las respuestas de un ratón a la vez. Sin embargo, cabe señalar que el 96 instrumentos así están disponibles para higher rendimiento. En segundo lugar, hay fortalezas y debilidades inherentes en la evaluación de la disfunción mitocondrial en las mitocondrias aisladas en comparación con ¹ en células intactas. Algunas debilidades incluyen tener relevancia fisiológica menos en comparación con las células intactas y que inducen artefactos del proceso de aislamiento. Por último, el éxito de este método depende de la calidad del proceso de aislamiento mitocondrial.

Aunque algunos de estos ensayos se han desarrollado ya sea en diferentes sistemas o han sido validados en otros modelos animales, los métodos presentados en este documento son la primera para sintetizar todos los ensayos mencionados anteriormente para el uso óptimo en una de múltiples pocillos máquina de medición del consumo de oxígeno a través del ratón músculo esquelético. Es importante destacar que todos los 5 de estos ensayos se pueden realizar con la cantidad de mitocondrias aisladas de ~ 75 - 100 mg de músculo esquelético de ratón, proporcionando así un alto rendimiento con un material mínimo. De gran importancia, la capacidad de los múltiples pocillostecnologías de consumo de oxígeno para llevar a cabo ensayos con cantidades mínimas de las mitocondrias, en combinación con un método de aislamiento optimizado, permite al investigador para llevar a cabo una multitud de otros experimentos con el resto del tejido de músculo esquelético (por ejemplo., transferencias de Western, RT-PCR, ensayos enzimáticos, etc.), que es a menudo una lucha con este modelo animal.

En conclusión, los métodos presentados en este documento proporcionan paso a paso las instrucciones para la realización de una colección de microplacas basado en ensayos respirométricos utilizando cantidades mínimas de músculo esquelético del ratón. Es importante destacar que los métodos presentados requieren cantidades mínimas de tejido y las mitocondrias. Una vez dominado, las técnicas descritas en este documento permitirá a los investigadores determinar un mecanismo potencial de un producto compuesto o de genes en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal de uso común.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sacarosa	Sigma Aldrich	S7903	Tienda en RT
D-Manitol	Sigma Aldrich	63559	Tienda en RT
Fosfato de potasio monobásico, mínimo 99.0%	Sigma Aldrich	P5379	Tienda en RT
Cloruro de magnesio hexahidratado, reactivo ACS, 99.0-102.0%	Sigma Aldrich	M9272	Tienda en RT
HEPES Titulación	mínima del 99.5%Sigma Aldrich	H3375	Tienda en RT
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	Tienda en RT
Essentially Fatty	Tienda Sigma Aldrich	A6003	en 4 °
Libre de ácido C- Ácido
, 98%	Sigma Aldrich	107360	Almacenar en 4 & deg; C
Ácido succínico	Sigma Aldrich	S9512	Tienda en RT
L(-) Ácido málico, BioXtra, ≥ 95%	Sigma Aldrich	M6413	Tienda en RT
Ácido L-glutámico	Sigma Aldrich	G1251	Tienda en RT
N,N,N′,N′-Tetrametil-p-fenilendiamina	Sigma Aldrich	T7394	Tienda en RT
99%, polvo [TMPD]
Palmitoil L-carnitina cloruro Sigma	Aldrich	P1645	Tienda en -20 ° C
Oligomicina A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Tienda a -20 ° C
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)	Sigma Aldrich	C2920	Almacene en 2 - 8 & deg; C
fenilhidrazona
≥ 98% (TLC), polvo [FCCP]
Antimicina A de streptomyces sp.	Tienda Sigma Aldrich	A8674	a -20 ° C
Adenosina 5′-difosfato sal monopotásica deshidratada [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Almacenar en -20 ° C
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Tienda en RT
Pierce™ Kit de ensayo de proteínas BCA	Thermo Scientific	23225	N/A