El estudio de las comunidades microbianas En Vivo: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre Candida Albicans Y Pseudomonas Aeruginosa En las vías respiratorias

Resumen

Mientras que el estudio in vitro de las interacciones huésped-patógeno permite la caracterización de respuestas inmunes específicas, se requieren modelos in vivo para observar los efectos de respuestas complejas. Utilizando la exposición a Candida albicans seguida de una infección pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, establecimos un modelo murino de interacciones microbianas implicadas en la patogenicidad de la neumonía asociada a la ventilación.

Resumen

El estudio de la interacción huésped-patógeno nos permite comprender los mecanismos subyacentes de la patogenicidad durante la infección microbiana. El pronóstico del huésped depende de la participación de una respuesta inmune contra el patógeno adaptado ^1. La respuesta inmune es complejo y los resultados de la interacción de los agentes patógenos y varios tipos celulares inmunes o no inmunes ^2. Los estudios in vitro no pueden caracterizar estas interacciones y se centran en las interacciones célula-patógeno. Por otra parte, en la vía aérea ^3, particularmente en pacientes con enfermedad pulmonar crónica supurativa o en pacientes con ventilación mecánica, comunidades polimicrobianas están presentes y complican la interacción huésped-patógeno. Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans son tanto problema patógenos ^4, frecuentemente aislado de muestras traqueobronquiales y asociada a las infecciones severas, especialmente en la unidad de cuidados intensivos ^5. Interacciones microbianas tienensido reportados entre estos patógenos in vitro, pero el impacto clínico de estas interacciones aún no está claro ^6. Para estudiar las interacciones entre C. Albicans y P. aeruginosa, un modelo murino de C. colonización albicans vías respiratorias, seguido de un P. Se llevó a cabo la infección pulmonar aguda aeruginosa- mediada.

Introducción

Los modelos animales, especialmente los ratones, se han utilizado ampliamente para explorar la respuesta inmune contra los patógenos. Aunque la inmunidad innata y adquirida difirió entre roedores y humanos ^7, la facilidad en la reproducción y el desarrollo de knockouts de numerosos genes, hacen que los ratones un modelo excelente para estudiar las respuestas inmunes ^8. La respuesta inmune es complejo y resulta de la interacción de un patógeno, la flora residente microbianas y varios inmunes (linfocitos, neutrófilos, macrófagos) y no inmunes (células epiteliales, células endoteliales) tipos celulares ^2. Los estudios in vitro no permiten la observación de estas interacciones complejas y se centran principalmente en las interacciones únicas células de patógenos. Mientras que los modelos animales se deben utilizar con precaución y limitan a cuestiones muy específicas y relevantes, modelos de ratón proporcionan una buena visión de la respuesta inmune de mamíferos in vivo y pueden abordar partes de preguntas clínicas importantes ^7.

En las vías aéreas, la comunidad microbiana compleja es la asociación de un gran número de diferentes microorganismos ^6. Si bien lo que constituye un microbioma "normal" de las vías respiratorias que queda por determinar, las comunidades residentes son frecuentemente polimicrobiana, y se originan a partir de diversas fuentes ecológicas. Los pacientes con enfermedad supurativa crónica pulmonar (fibrosis quística, bronchectasis) o pacientes con ventilación mecánica exhiben una determinada flora debido a la colonización de las vías respiratorias por microorganismos del medio ambiente ^{adquiridos-9.} Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans son tanto problema patógenos ^5, aislado con frecuencia juntos a partir de muestras traqueobronquiales , y responsable de la infección oportunista grave en estos pacientes, sobre todo en la unidad de cuidados intensivos (UCI) ^4.

El aislamiento de estos microorganismos durante la neumonía aguda en los resultados de la UCI en el tratamiento anti-microbiano contra P. aeruginosa but levaduras generalmente no son considerados patógenos en este sitio ^5. interacciones in vitro entre P. aeruginosa y C. albicans han sido informado ampliamente y mostraron que estos microorganismos pueden afectar el crecimiento y la supervivencia de uno al otro pero los estudios no pudieron concluir si la presencia de C. albicans es perjudicial o beneficioso para el host ^10. Se desarrollaron modelos de ratón para abordar esta relevancia de P. aeruginosa y C. albicans in vivo, pero la interacción entre microorganismos no era el punto clave. De hecho, se estableció el modelo para evaluar la participación de C. albicans en la respuesta inmune del huésped, y el resultado.

Un modelo anterior establecido por Roux et al ya utilizado una colonización inicial con C. albicans seguido por una infección pulmonar aguda inducida por P. aeruginosa. Utilizando su modelo, los autores encontraron un papel deletéreo de prior C. albicans colonización ^11. Sin embargo Roux et al utilizarse una alta carga de C. albicans en su modelo con 2 x 10 ⁶ UFC / ratón durante 3 días consecutivos. Hemos establecido un modelo de 4 días de C. albicans colonización de las vías respiratorias, o al menos persistencia sin lesión pulmonar, en este modelo C. albicans fue recuperado hasta 4 días después de una sola instilación de 10 ⁵ UFC por ratón (Figura 2B) ^12,13. Después de 4 días, no se observó evidencia de reclutamiento de células inflamatorias, la producción de citoquinas inflamatorias ni daño epitelial. En 24 a 48 h, en la presencia de pico de C. albicans, aunque se observó una respuesta inmune innata celular y citoquinas, no hubo evidencia de la lesión pulmonar. Sorprendentemente, los ratones de este modo colonizados con C. albicans 48 h antes de la instilación intranasal de P. aeruginosa había atenuado la infección en comparación con ratones con P. infección aeruginosa solo. yondeed, ratones mostraron lesión pulmonar menor y la disminución de la carga bacteriana ^12,13.

Varias hipótesis podrían explicar este efecto beneficioso de la colonización previa con C. albicans en P. aeruginosa mediada por infección pulmonar aguda. En primer lugar, la diafonía entre especies que implica cada microorganismos sistemas de detección de quórum, el P. basada en homoserinelactone sistema aeruginosa y la basada en farnesol C. sistema albicans, fueron evaluados. En segundo lugar, C. Se estudió albicans actuando como un objetivo "señuelo" para P. aeruginosa desviar el patógeno a partir de células epiteliales del pulmón. Ambas hipótesis fueron invalidadas (datos no publicados). La tercera hipótesis es la de un "cebado" del sistema inmune innato por C. albicans responsable de una respuesta innata posterior mejorada contra P. aeruginosa. Se confirmó Esta última hipótesis. De hecho C. albicans colonización condujo a un cebado de la inmunidad innata through IL-22, secretada principalmente por células linfoides innatas, lo que resulta en un aumento de la eliminación de bacterias y reduce la lesión pulmonar ^12.

En conclusión, el anfitrión es un actor central en la interacción entre los microorganismos que modulan la respuesta inmune innata y que implican diferentes tipos de células inflamatorias. Si bien estas interacciones inmunológicas complejas pueden ser disecados in vitro las hipótesis iniciales sólo pueden ser proporcionados por apropiado en modelos in vivo. El siguiente protocolo proporciona un ejemplo de estudio in vivo de la interacción huésped-patógeno mediada que se puede adaptar a otros microorganismos.

Protocolo

El comité regional de ética regionales para los experimentos con animales ha aprobado este método, de acuerdo con el cuidado y el uso nacional e internacional de los animales en las directrices de investigación en investigación.

1. Recogida de muestras

1. Almacenamiento de las muestras
   1. Reunir todas las muestras e inmediatamente almacenar a - 20 ° C o en hielo hasta su almacenamiento en el congelador para evitar el deterioro. Coloque fosfato estéril (PBS) en el hielo para mejorar lavados bronco-alveolar (BAL) rendimiento.
2. Cirugía
   1. Esterilizar todo el equipo quirúrgico utilizando un autoclave.
      NOTA: Si es posible, se recomienda el uso de dos conjuntos diferentes de instrumentos para los pasos abdominales y torácicas para evitar la contaminación cruzada. Equipos de disección requerida se detalla en la figura 4A

2. Los ratones, bacterias y levaduras Cepas

1. Ratones de la vivienda en cumplimiento con el uso local de los animales en la redirectrices del comité de búsqueda en un estante ventilado sin exceder 5 ratones por jaula, con comida y agua ad lib, en una instalación de vivienda nivel de bioseguridad 2, debido a la utilización de nivel de bioseguridad 2 microorganismos: P. aeruginosa y C. albicans.
2. Mantener las cepas bacterianas a -80 ° C en 40% de medio de glicerol.
   1. Añadir bacterias directamente desde el almacén congelado en el tubo de cultivo que contiene 3 ml de caldo Luria-Bertani estéril usando un asa de siembra 10 l. Deja O / N a 37 ° C con agitación orbital (400 rpm) el día antes de la instilación.
   2. Cosecha bacterias por centrifugación a 2000 xg durante 5 min.
   3. Aspirar el sobrenadante en una eliminación de residuos de riesgo biológico apropiado cerrado. Observe pellet adherente blanco en el fondo del tubo de cultivo.
   4. Lavar y suspender el sedimento usando 5 ml de PBS.
   5. Repita los pasos 2.2.2 al 2.2.3 por segunda vez para realizar un segundo lavado.
   6. Resuspender las bacterias sedimentadas utilizando 1 ml de PBSy breve agitación en vórtex.
   7. Determinar la densidad de inóculo mediante densitómetro óptica a 600 nm utilizando un medidor de densidad óptica. Una densidad de 0,9 corresponde a 10 ⁹ CFU / ml para PAO1, diluir en consecuencia.
      NOTA: Este resultado tiene que ser obtenido para cada cepa utilizada mediante la determinación de la densidad de diluciones sucesivas de un inóculo calibrado.
   8. Verifique el inóculo por diluciones logarítmicas de serie y la placa 100 l de cada dilución en agar púrpura de bromocresol (BCP) placas y cultivo O / N. Administrar cada ratón por vía intranasal 50 l de la solución que contiene 1 x ⁰⁸ al 02 10 ⁸ x10 UFC por ml (5 x 10 ⁶ a 1 x10 ⁷ UFC por ratón).
3. Uso C. albicans SC5314 como una cepa de referencia. Conserve la cepa en el 40% de medio de glicerol a -80 ° C.
   1. Suplemento caldo de peptona de levadura-dextrosa-con 0,015% de amikacina para evitar la contaminación bacteriana y facilitar aún más la cuenta.
   2. Añadir la levadura utilizando 10 y# 181; l bucle de inoculación en preparados YPD caldo suplementado con amikacina O / N a 37 ° C.
   3. Cosecha de levadura por centrifugación a 2000 xg durante 5 min.
   4. Aspirar el sobrenadante en una eliminación de residuos bioharzard apropiado. Blanco pellet adherente debe ser observada en la parte inferior del tubo de cultivo.
   5. Lavar y suspender las bacterias sedimentadas utilizando 5 ml de PBS y breve agitación en vórtex.
   6. Repita los pasos 2.2.2 al 2.2.3 por segunda vez para realizar un segundo lavado.
   7. Resuspender el precipitado usando 1 ml de PBS y breve agitación en vórtex.
   8. Determinar el tamaño del inóculo mediante el recuento en un hematocitómetro Mallassez utilizando un microscopio estándar a un aumento de 40x.
      NOTA: Concentración (en UFC / ml) se obtiene mediante la siguiente fórmula: (número de levadura x 10 ⁵⁾ / (número de rectángulos de cuadrícula contados en el hematocitómetro Mallassez).
   9. Verificar por dilución logarítmica serie a 10 ^-5 y ^-6 10 para confirmar que la solución contiene 2 x 10 ⁶ CFU / ml.
   10. Placa en placas de agar YPD suplementado con 0.015% amikacina.

3. La colonización por C. Airways albicans

NOTA: Después de adaptación ambiental, los ratones se pesan dos veces al día.

1. Bajo una campana de extracción, depósito 500 l de sevoflurano en un 4 cm x 4 cm de gasa (técnica de soltar abierto) ^14.
   1. Inmediatamente colocar la gasa en el suelo de una cámara de aproximadamente 750 ml de inducción. Inmediatamente colocar una plataforma elevada de malla por encima de la gasa para evitar el contacto directo entre el animal y la gasa.
   2. Cierre tapa hermética y esperar 1 a 2 minutos para permitir la difusión de sevoflurano en la cámara.
   3. Transferir el ratón de la jaula de malla de la plataforma y cierre la tapa. Anestesia ligera con respiración espontánea conservada debería lograrse en el 30 a 45 segundos.
   4. Monitor para hipotonía mediante la observación de la pérdida del reflejo de enderezamiento momento en el que el ratón se puede quitar fesde la caja y inculcado.
2. Instilación intranasal (se puede realizar en 10 segundos por un operador entrenado).
   1. Mantenga el ratón con una mano situada en su parte posterior en posición vertical (Figura 4B).
   2. Utilizando el dedo índice, apoyar la cabeza y usar el pulgar para mantener la mandíbula cerrada para evitar la expectoración (Figura 4C).
   3. Como se describe en el paso 2.3.8, asegúrese de que el preparado C. solución albicans contiene 2 x 10 ⁶ UFC por ml durante 50 l volumen inculcado.
      NOTA: El segundo punto crítico es el volumen instilado. Un volumen inferior a 50 l podrían dar lugar a una colonización insuficiente o la instilación no homogénea de las vías respiratorias, un volumen más grande puede provocar ahogamiento / asfixia y la muerte.
   4. Inculcar el ratón por vía intranasal por acercarse a la pipeta para las fosas nasales.
   5. Pipetear una formando una burbuja que contiene la solución en las fosas nasales gota 50 l, posteriormente inhalado por el spontaneously ratón respiración.
   6. Place ratón en un área de recuperación (por ejemplo, una jaula grande desnudo bien aireado con una lámpara de calentamiento overhead). Los ratones debe ser monitoreado hasta completar despertar. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal y reflejo de enderezamiento. En este punto, el ratón puede ser devuelto a una jaula normal de la vivienda.

4. P. aeruginosa inducida agudo de pulmón Infección

NOTA: Los ratones se pesan durante los cuatro días siguientes. Normalmente, los ratones aumentan de peso durante la C. la colonización de las vías respiratorias mediada por albicans (Figura 2A).

1. Preparar la suspensión que contiene P. aeruginosa el día de la instilación después de O / N de crecimiento (sección 2.2).
2. Anestesiar brevemente utilizando inhalado sevoflurano como se describe anteriormente (sección 3.1).
   NOTA: Para llevar a cabo la infección pulmonar aguda, se recomienda la carga bacteriana se sugiere enTabla 1.
3. Inculcar el ratón como se describe anteriormente (sección 3.2), con especial atención a la recuperación después de la instilación.

5. Medida de pulmón Índice de Lesiones

1. Preparar una solución que contiene albúmina marcada con FITC. Inyectar esta solución 2 hr antes de la eutanasia de los animales.
   1. Pesar 0,2 mg de albúmina-FITC con el equipo apropiado.
   2. Añadir 0,2 mg en 1 ml de PBS. Vórtice brevemente. Si no se utiliza inmediatamente, coloque la solución en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz ambiental.
   3. Inyectar por vía intraperitoneal 200 l de solución de albúmina marcada con FITC a cada ratón.
2. Eutanasia
   1. Pesar los ratones durante el último dato de peso.
   2. La eutanasia a un solo ratón, de acuerdo con el uso local de los animales en las directrices del comité de investigación utilizando una inyección intraperitoneal de una sobredosis letal de pentobarbital: 300 l de 5,47% pentobarbital.
   3. Retire del ratón de la jaula y recibe linyección Ethal por el operador.
   4. Después de la inyección, transferir el ratón solamente a otra jaula, oculto a los otros animales. Observe el ratón hasta ausencia de movimiento. Confirmar la muerte es por ausencia de movimiento, movimiento particular respiratoria, falta de pulso.
   5. Realizar colección quirúrgica de muestras en animales muertos, por lo tanto, sin anestesia ni analgésicos.
3. Quirúrgica recogida de muestras: Etapa Torácica.
   NOTA: Para mantener condiciones estériles, se realiza toda la cirugía utilizando material estéril en un entorno de nivel de bioseguridad 2.
   1. Aplicar etanol a la piel. Realice una incisión en la piel en la línea media del esternón hasta mediados abdomen con unas tijeras. De incisión en la línea media a lo largo de la caja torácica a cada lado. Doble hacia atrás la piel a cada lado del tórax para visualizar la caja torácica.
   2. Realizar una incisión vertical de la caja torácica a cada lado subiendo hacia las clavículas con el fin de ser capaz de reclinarse toda la pared anterior del tórax con la popaum permitiendo la visualización perfecta de corazón y los pulmones (Figura 5A, 5B).
   3. Recoger la sangre utilizando una jeringa pre-heparined perforando el corazón próxima a la arteria interventricular. Retirar un mínimo de 500 l para obtener al menos 100 l de plasma. Coloque la muestra de sangre en el hielo.
   4. Realice una incisión cervical línea media para visualizar la tráquea (Figura 5B y 5C). Diseccionar cuidadosamente la fascia alrededor de la tráquea. Coloque una sutura detrás de la tráquea (Figura 5C y 5D). Posteriormente la sutura se cerrará alrededor de la aguja canulando para garantizar un lavado adecuado.
   5. Cateterizar la tráquea utilizando la aguja 20-G modificado sonda (Figura 5D y 4A). Haga un nudo quirúrgico alrededor de la tráquea canulado con la sutura colocado previamente.
   6. Para realizar lavados broncoalveolares (BAL), suave y progresivamente inyectar y extraer 500 l de helado de PBS en / de pulmón. Coloque la muestra en la ice para evitar la lisis celular.
   7. Repita el paso 5.3.6, 3 veces para obtener un total de 1.500 muestras de l fluido BAL y piscina de lavado en un tubo de centrífuga de 2 ml (Figura 5E).
   8. Retire los pulmones desde el pecho. Coloque un segmento pulmonar (tamaño debe corresponder a la mitad de un pulmón o un lóbulo) en 1,5 ml tubo de centrífuga y almacenar rápidamente a - 80 ° C.
   9. Coloque un segmento de pulmón en un tubo de hemólisis previamente pesado que contiene PBS para determinar la carga bacteriana y colocarlo en hielo.
4. Quirúrgica recogida de muestras: Etapa abdominal.
   1. Realizar otra incisión en el lado izquierdo del abdomen. Observar el bazo a través del peritoneo.
   2. Retirar el bazo y colocar en un segundo tubo de hemólisis que contiene 1 ml de PBS y el lugar en el hielo.
5. Índice de lesión pulmonar
   NOTA: permeabilidad de la membrana alveolar-capilar se evaluó midiendo marcado con FITC-albúmina de fuga desde el compartimiento vascular a la alveolar-interstcompartimento itial.
   1. Centrifugar la muestra de sangre y el fluido BAL durante 10 min a 1500 x g. Reunir los sobrenadantes en nuevos tubos de centrífuga. Los pellets corresponden a las células plasmáticas o BAL reclutados y deben ser colocados en hielo.
   2. Añadir 100 l de cada sobrenadante de la sangre (plasma, amarillo) o BAL sobrenadante a una placa de 96 pocillos transparente (300 L pozos). Coloque una lámina en la placa si no se utiliza de inmediato.
   3. Medir los niveles de fluorescencia en el plasma y sobrenadantes BAL utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (excitación, 487 nm; emisión, 520 nm).
   4. Determinar el índice de lesión pulmonar mediante el cálculo de la relación de fluorescencia [(BAL sobrenadante sobrenadante / sangre) x 100].
6. Lavado broncoalveolar (BAL) recuento celular diferencial.
   NOTA: Utilice el sedimento celular obtenido de la centrifugación de LBA en el paso 5.5.1.
   1. Si es necesario, utilice tampón de lisis de los glóbulos rojos. Añadir 500 l de tampón de lisis de los glóbulos rojos en el tubo de centrífuga que contiene el cell pellet. Vórtice brevemente y dejar 10 minutos en hielo. Añadir 500 l de PBS para detener la lisis de los glóbulos rojos.
   2. Cosecha células por centrifugación durante 10 min a 1500 x g. Aspirar el sobrenadante y suspender el sedimento celular en 1 ml de PBS estéril. Enumerar las células en un hematocitómetro Mallassez. Usando un hemocitómetro para contar las células. Concéntrese células en un portaobjetos con una citospina.
   3. Las células de la mancha utilizando kit de coloración que permite la identificación y el recuento de células (macrófagos, linfocitos, neutrófilos).
7. La carga bacteriana de pulmón y difusión bacteriana
   NOTA: Para evaluar la carga bacteriana pulmonar y diseminación bacteriana, los pulmones y el bazo fueron recogidos y almacenados en tubos de hemólisis previamente pesados ​​que contienen 1 ml de PBS (etapa 5.3.9), respectivamente.
   1. Pesar tubos de hemólisis que contienen 1 ml de PBS y, o bien los pulmones o bazo. Homogeneizar las muestras con un homogeneizador de tejidos para obtener homogeneizado de pulmón y los homogeneizados de bazo.
   2. Depósito 100 l de homo tejidogenates en tubos de centrífuga que contiene 900 l de PBS estéril para obtener diluciones logarítmicas seriadas.
   3. Placa de las dos últimas muestras diluidas apropiadas (10 ^-3 y 10 ^-2) a cada BCP-agar para P. aeruginosa o agar YPD-amikacina suplementada para C. albicans pulmonar y determinación carga bazo.
   4. Incubar las placas O / N a 37 ° C. El día siguiente, enumerar las colonias en las placas.
   5. Índice el resultado al peso del pulmón para obtener un CFU por gramo de pulmón. Pulmón tamaño de las muestras no son los mismos, los resultados deben ser expresados ​​en UFC por gramo de pulmón.
      Fórmula para el índice es: [UFC] x [peso del tubo de hemólisis y de pulmón] - [peso del tubo de hemólisis].

Resultados

Como se ha visto anteriormente en la descripción del protocolo, el experimento necesita 5 días para completar (Figura 1: línea de tiempo experimento). Un operador se solicita durante todo el plazo del experimento y puede manejar los procesos hasta un máximo de 10 ratones. Si se requieren más animales, se necesitan dos personas en particular para la recogida de muestras quirúrgica. De hecho todas las muestras deben recogerse en menos de 2 horas para evitar una mayor fuga de alveolocapilar pasiva de albúm...

Discusión

Los modelos animales, en particular los mamíferos, son útiles para dilucidar los mecanismos complejos de interacción huésped-patógeno en los campos de la inmunidad. Por supuesto, la necesidad de información sólo puede obtenerse de modelos animales deben ser esenciales; de lo contrario, el uso de animales debe ser reemplazado por modelos in vitro. Este modelo animal ilustra la idea de que sólo puede ser proporcionada por un modelo animal ya que la interacción entre los agentes patógenos está mediado por una resp...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sevorane, Sevoflurano	Abott	05458-02 botella de	plástico de 250 ml
Lector de fluorescencia Mitra  LB940	Berthold Technologies	referencia en la primera columna	sin comentarios
Bromo-cresol agar púrpura	Biomerieux	43021	20x por unidad
Pentobarbital sódico 5.47%	CEVA	6742145	botella de plástico de 100 ml
válvula de 2 cabezas	Descortezado	92831	sin comentarios
Asa de inoculación estéril 10 µ l	Dutscher	10175	x1.000
acondicionamiento Jeringas de insulina 1 ml	Dutscher	30003	por 100 acondicionamiento
2 posiciones Tubo de cultivo 8 ml	Dutscher	64300	sin comentarios
Ultrospec 10	General Electric ciencias de la vida	80-2116-30	no comment
Tubos de hemólisis 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	por 100
PBS - Tecnologías de vida salina tamponada con fosfato		10010023	envasado en 500 ml
de amikacina 1 g	Mylan	62516778	por 10
Heparina 10.000 UI en 2 ml	Pan pharma	9128701	10x por unidad
RAL 555 kit de coloración RAL	Diagnostics	361550	3 frascos de 100 mL
1,5 ml tubo de microcentrífuga	Sarstedt	55.526.006	x 1000
Transparente 300 µ l Placa de 96 pocillos	Sarstedt	82 1581500	no comment
Yest-peptona-Dextrosa Caldo	Sigma	95763	en polvo
FITC-albúmina	Sigma	A9771	en polvo
Luria Bertani Caldo	Sigma	L3022	en polvo
Aguja de calibre 25	Terumo o unisharp	A231	x 100 acondicionador
Citocentrífuga	Thermo Scientific	A78300003	ningún comentario