Interrupción Anti-virulenta de patógenos biopelículas utilizando Engineered Quórum para saciar lactonasas

Resumen

Las enzimas que apagan el quórum son opciones antivirulentas y antibacterianas que pueden mitigar la patogénesis sin riesgo de incurrir en resistencia, al prevenir la expresión de factores de virulencia y genes asociados con la resistencia a los antibióticos y la formación de biopelículas. En este estudio, presentamos un método que demuestra la eficacia de las enzimas que extinguen el quórum en la disrupción de la biopelícula bacteriana.

Resumen

La rápida aparición de bacterias multirresistentes ha acelerado la necesidad de nuevos enfoques terapéuticos para contrarrestar las infecciones potencialmente mortales. La persistencia de la infección bacteriana a menudo se asocia con la formación de biopelículas mediada por detección de quórum. Por lo tanto, la interrupción de este circuito de señalización presenta una atractiva estrategia anti-virulencia. Se ha informado que las lactonasas que apagan el quórum son disruptores efectivos de los circuitos de detección de quórum. Sin embargo, ha habido muy pocos informes sobre el uso efectivo de estas enzimas para interrumpir la formación de biopelículas bacterianas. Este protocolo describe un método para interrumpir la formación de biopelículas en una cepa de A. baumannii S1 clínicamente relevante mediante el uso de una lactonasa diseñada para apagar el quórum. Acinetobacter baumannii es un importante patógeno humano implicado en graves infecciones intrahospitalarias en todo el mundo, y su virulencia se atribuye principalmente a la tenacidad de su biopelícula. El tratamiento con lactonasa diseñado logró una reducción significativa de la biopelícula de A. baumannii S1. Este estudio también mostró la posibilidad de utilizar enzimas de extinción de quórum modificadas en el futuro tratamiento de enfermedades bacterianas mediadas por biopelículas. Por último, el método puede utilizarse para evaluar la competencia de enzimas prometedoras que apagan el quórum.

Introducción

Las opciones de tratamiento para las enfermedades infecciosas se han complicado por el rápido aumento de bacterias resistentes a múltiples fármacos que son inmunes a una amplia gama de fármacos antibióticos ^1. Con altas tasas de morbilidad y mortalidad por infecciones con bacterias resistentes mediadas, existe la necesidad de intensificar los procesos de desarrollo de fármacos y / o explorar mejores alternativas antibacterianos para mejorar las opciones terapéuticas. Últimamente, el enfoque anti-virulencia está ganando interés dado su potencial en la prevención de la virulencia través de métodos no bactericidas, por lo tanto, la mitigación de los riesgos d....

Protocolo

1. Crystal Violet La cuantificación de Biofilm Formation en A. baumannii S1

1. Cultivar una cultura 5 ml de A. baumannii S1 en caldo Lisogenia (LB) (triptona 10 g / L, extracto de levadura 5 g / l) a 30 ° C en una incubadora con agitación (220 rpm) durante 16 hr.
2. Ajuste el cultivo de A. baumannii S1 a un OD ₆₀₀ de 0,8 deseado. Usando una placa de 96 pocillos, inocular el cultivo de bacterias (1: 100 dilución) en fresco LB que contiene 10 l de enzima purificada GKL (40 mg / ml); volumen final de la nueva cultura es de 100 l.
3. Preparar una cultura de control, así; esto no contendrá ninguna enzima....

Resultados

En la cuantificación experimento cristal violeta, se utilizaron dos enzimas de quórum de enfriamiento para demostrar la viabilidad en la interrupción de la formación de biopelículas: de tipo salvaje GKL y un doble mutante GKL mejorado (E101G / R230C). Ambas enzimas se han demostrado para demostrar la actividad lactonasa contra 3-hidroxi-decanoil-L-homoserina lactona (3-OH-C ₁₀ -HSL), la molécula de quórum importante utilizado por A. baumannii S1 ^14. Para la.......

Discusión

En ambos conjuntos de experimentos, A. baumannii S1 se cultivó en medio LB sin NaCl como una alta concentración de sal puede reducir la cantidad de formación de biopelículas por las bacterias ^15. La presencia de tales artefacto podría subestimar la cantidad de formación de biopelículas, así como los efectos de las enzimas de quórum de extinción a través de diferentes condiciones de tratamiento. El uso de una enzima catalíticamente inactiva es importante como un control negativo para eliminar.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Triptona	BD	211705
Extracto de levadura	BD	212750
Placa de 96 pocillos	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Ácido Acético	PLA00654X	escaneo de laboratorio	Precaución: Plato inflamable
	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugado WGA	Invitrogen	W11261
Hank' s solución salina equilibrada	Invitrogen	141475095
formaldehído	Sigma-Aldrich	F8775	Precaución: Corrosivo
Synergy HT Lector de microplacas	BioTek
1X-81 Microscopio de fluorescencia invertida	Olympus

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