Interrupción Anti-virulenta de patógenos biopelículas utilizando Engineered Quórum para saciar lactonasas

Resumen

Las enzimas que apagan el quórum son opciones antivirulentas y antibacterianas que pueden mitigar la patogénesis sin riesgo de incurrir en resistencia, al prevenir la expresión de factores de virulencia y genes asociados con la resistencia a los antibióticos y la formación de biopelículas. En este estudio, presentamos un método que demuestra la eficacia de las enzimas que extinguen el quórum en la disrupción de la biopelícula bacteriana.

Resumen

La rápida aparición de bacterias multirresistentes ha acelerado la necesidad de nuevos enfoques terapéuticos para contrarrestar las infecciones potencialmente mortales. La persistencia de la infección bacteriana a menudo se asocia con la formación de biopelículas mediada por detección de quórum. Por lo tanto, la interrupción de este circuito de señalización presenta una atractiva estrategia anti-virulencia. Se ha informado que las lactonasas que apagan el quórum son disruptores efectivos de los circuitos de detección de quórum. Sin embargo, ha habido muy pocos informes sobre el uso efectivo de estas enzimas para interrumpir la formación de biopelículas bacterianas. Este protocolo describe un método para interrumpir la formación de biopelículas en una cepa de A. baumannii S1 clínicamente relevante mediante el uso de una lactonasa diseñada para apagar el quórum. Acinetobacter baumannii es un importante patógeno humano implicado en graves infecciones intrahospitalarias en todo el mundo, y su virulencia se atribuye principalmente a la tenacidad de su biopelícula. El tratamiento con lactonasa diseñado logró una reducción significativa de la biopelícula de A. baumannii S1. Este estudio también mostró la posibilidad de utilizar enzimas de extinción de quórum modificadas en el futuro tratamiento de enfermedades bacterianas mediadas por biopelículas. Por último, el método puede utilizarse para evaluar la competencia de enzimas prometedoras que apagan el quórum.

Introducción

Las opciones de tratamiento para las enfermedades infecciosas se han complicado por el rápido aumento de bacterias resistentes a múltiples fármacos que son inmunes a una amplia gama de fármacos antibióticos ^1. Con altas tasas de morbilidad y mortalidad por infecciones con bacterias resistentes mediadas, existe la necesidad de intensificar los procesos de desarrollo de fármacos y / o explorar mejores alternativas antibacterianos para mejorar las opciones terapéuticas. Últimamente, el enfoque anti-virulencia está ganando interés dado su potencial en la prevención de la virulencia través de métodos no bactericidas, por lo tanto, la mitigación de los riesgos de los mecanismos de resistencia ^2.

Quórum de detección es un "interruptor maestro" en la virulencia bacteriana y la interrupción de este fenómeno de señalización es un método anti-virulencia prometedora contra patogénesis ^3. El inicio de la virulencia requiere la acumulación de moléculas de quórum en el medio extracelular después de que se alcanza una densidad crítica población bacteriana. Como quomoléculas de ron difunden de nuevo en la matriz intracelular, la unión con sus receptores afines conduce a la activación de factores de virulencia, así como genes asociados con la resistencia a los antibióticos y la formación de biopelículas ^4. En, la interrupción del quórum de detección general, implica la inhibición de molécula de quórum y la interacción del receptor sin afectar las rutas metabólicas primarias. Por lo tanto, no tiene ninguna implicación directo sobre el crecimiento celular. Desde la aptitud no se vea comprometida, no hay presión de selección mínimos para las bacterias para evolucionar y ganar resistencia contra tales tratamientos ^5. Además, la interrupción de detección de quórum puede interferir con los mecanismos de protección bacterianas inherentes, como en el caso de la formación de biopelículas, que proporciona protección de los agentes anti-bacterianas y respuestas inmunes del huésped.

Se estima que el 99% de los microbios en la Tierra existe en matrices de biofilm como complejas, que confiere ventajas de supervivencia cruciales a los microorganismos que viven dentro de THestructuras ESE ^6. Más importante aún, la formación de estos dominios sésiles es la causa de las infecciones nosocomiales más persistentes y crónicas ^7. Acinetobacter baumannii es uno de los principales patógenos humanos que se asocia con infecciones globales adquiridas en el hospital y su virulencia se atribuye en gran parte al quórum de detección la formación de biopelículas mediada ^8. Enzimas-quorum quenching han utilizado con éxito en la interrupción de la transducción de señales mediada por-quórum dirigidas a un grupo de compuestos conocido como N-acil homoserina lactonas (AHL) que son producidas por bacterias Gram-negativas ^9. Varios estudios también han expandido en el uso de estas enzimas para bloquear la patogénesis bacteriana a través de la reducción de la expresión del factor de virulencia y el número de células en los biofilms ^10,11. Desafortunadamente, sigue existiendo una falta de demostración palpable de la utilización eficaz de las enzimas de quórum de extinción contra la formación de biofilm por patógenos bacterianos. losre ha habido intentos de utilizar inhibidores de quórum (análogos de AHL), en lugar de las enzimas de quórum de enfriamiento, para interrumpir A. la formación de biopelículas baumannii ^12. Aunque este método de uso de inhibidores de moléculas pequeñas es un enfoque válido, el mantenimiento de su biodisponibilidad en usos de traslación puede ser un desafío. Por el contrario, el uso de enzimas de quórum para saciar catalíticos podría eludir el problema biodisponibilidad como enzimas son más susceptibles a la inmovilización sobre superficies de dispositivos biomédicos para efectos terapéuticos.

Aquí se describe una evaluación de los efectos de lactonasas de quórum para saciar la ingeniería de Geobacillus kaustophilus (GKL) ¹³ en la formación de biopelículas bacterianas, mediante la tinción de cristal violeta y microscopía láser confocal de barrido (CLSM). Este estudio es la primera demostración con éxito de la interrupción del biofilm en un A. clínicamente relevante cepa baumannii S1 utilizando enzimas de quórum temple. Los métodos descritosen este estudio son útiles para evaluar la eficacia de otras enzimas de quórum para saciar en posteriores esfuerzos de desarrollo terapéuticas contra bacterias Gram-negativas patógenas.

Protocolo

1. Crystal Violet La cuantificación de Biofilm Formation en A. baumannii S1

1. Cultivar una cultura 5 ml de A. baumannii S1 en caldo Lisogenia (LB) (triptona 10 g / L, extracto de levadura 5 g / l) a 30 ° C en una incubadora con agitación (220 rpm) durante 16 hr.
2. Ajuste el cultivo de A. baumannii S1 a un OD ₆₀₀ de 0,8 deseado. Usando una placa de 96 pocillos, inocular el cultivo de bacterias (1: 100 dilución) en fresco LB que contiene 10 l de enzima purificada GKL (40 mg / ml); volumen final de la nueva cultura es de 100 l.
3. Preparar una cultura de control, así; esto no contendrá ninguna enzima. Repita condiciones similares para obtener el número deseado de repeticiones.
4. Cubra el plato con una tapa y colóquelo en un recipiente de plástico de 10 L sellada. Incubar la placa a 30 ° C durante 3 horas antes de retirar suavemente los medios de comunicación.
5. Añadir otros 100 l de medio LB fresco al pozo e incubar la placa durante 21 horas a 30 ° C.
6. Después de que el segundo período de incubación, retire con cuidado todos los medios de comunicación. Lavar la célula bacterias planctónicas con 200 l de agua estéril. Asegúrese de que sólo hay una perturbación mínima a las células durante el lavado.
7. Añadir 100 l de solución de cristal violeta al 1% a cada pocillo e incubar durante 15 min a TA. Eliminar la solución de cristal violeta lavando el bien con 200 l de agua estéril. Repita el lavado dos veces más.
8. Añadir 100 l de ácido acético 33% a cada pocillo e incubar durante 15 min con agitación suave; esto va a disolver el colorante.
9. Cuantificar la cantidad de biofilm formado por la medición de la absorbancia del violeta cristal a los 600 nm. La cantidad de cristal violeta es proporcional a la cantidad de formación de biopelículas.

2. confocal de barrido láser microscopía de A. baumannii S1 Biofilm

1. Cultivar una cultura 5 ml de A. baumannii S1 en LB a 30 ° C en una incubadora con agitación (220 rpm) durante 16 hr.
2. Anunciosólo el cultivo de A. baumannii S1 a un OD ₆₀₀ de 0,8 deseado. El uso de un 35 mm μ-plato con fondo de cristal, inocular el cultivo de bacterias (dilución 1: 100) en fresco LB que contiene 30 l de enzima purificada GKL (40 mg / ml); volumen final de la nueva cultura es de 1 ml.
3. Cubra la μ-plato con una tapa y colóquelo en un recipiente de plástico de 10 L sellada. Incubar la μ-Dish a 30 ° C durante 3 horas antes de retirar suavemente los medios de comunicación. Añadir 30 l de enzima purificada y GKL medio fresco, llevándola a un volumen total de 1 ml. Incubar durante otras 21 horas a 30 ° C.
4. Repita el paso 2.3 e incubar la μ-Dish durante otras 24 horas a 30 ° C. Luego, retire los medios de comunicación con suavidad.
5. Añadir 500 l de 5 mg / ml Alex Fluo 488 conjugado con aglutinina de germen de trigo (WGA) disuelto en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a la μ-Dish y se incuba a 37 ° C durante 30 min; esto va a manchar la biopelícula formada. Retire la solución de tinción y lavar tque Mu Plato con 2 ml de HBSS. Repita el paso de lavado una vez más.
6. Añadir 500 l de 3,7% de formaldehído disuelto en HBSS y se incuba a 37 ° C durante 30 min; Esto solucionará el biofilm sobre la μ-Dish. Lave la μ-Dish una vez con 2 ml de HBSS y luego retire la solución completamente. El μ-Dish fijo con biofilm se puede almacenar en la oscuridad a 4 ° C antes de la formación de imágenes CLSM.
7. Para imágenes CLSM y el análisis, utilizar 63 veces de aumento para generar 97 pilas por imagen con un intervalo de 0,21 micras por pila.

Resultados

En la cuantificación experimento cristal violeta, se utilizaron dos enzimas de quórum de enfriamiento para demostrar la viabilidad en la interrupción de la formación de biopelículas: de tipo salvaje GKL y un doble mutante GKL mejorado (E101G / R230C). Ambas enzimas se han demostrado para demostrar la actividad lactonasa contra 3-hidroxi-decanoil-L-homoserina lactona (3-OH-C ₁₀ -HSL), la molécula de quórum importante utilizado por A. baumannii S1 ^14. Para la...

Discusión

En ambos conjuntos de experimentos, A. baumannii S1 se cultivó en medio LB sin NaCl como una alta concentración de sal puede reducir la cantidad de formación de biopelículas por las bacterias ^15. La presencia de tales artefacto podría subestimar la cantidad de formación de biopelículas, así como los efectos de las enzimas de quórum de extinción a través de diferentes condiciones de tratamiento. El uso de una enzima catalíticamente inactiva es importante como un control negativo para eliminar...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Triptona	BD	211705
Extracto de levadura	BD	212750
Placa de 96 pocillos	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Ácido Acético	PLA00654X	escaneo de laboratorio	Precaución: Plato inflamable
	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugado WGA	Invitrogen	W11261
Hank' s solución salina equilibrada	Invitrogen	141475095
formaldehído	Sigma-Aldrich	F8775	Precaución: Corrosivo
Synergy HT Lector de microplacas	BioTek
1X-81 Microscopio de fluorescencia invertida	Olympus