Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo adaptado que se puede utilizar para generar un gran número de células T asesinas naturales invariantes murinas a partir del bazo de ratón. El protocolo describe un enfoque mediante el cual las células iNKT esplénicas pueden enriquecerse, aislarse y expandirse in vitro utilizando un número limitado de animales y reactivos.

Resumen

La capacidad de secretar citocinas rápidamente tras la estimulación es una característica funcional de la invariante natural killer T (iNKT) linaje de células. Por lo tanto, las células iNKT se caracterizan como una población innata de las células T capaz de activar y adaptativa de dirección respuestas inmunes. El desarrollo de técnicas mejoradas para la cultura y la expansión de las células iNKT murinos facilita el estudio de la biología de las células iNKT en in vitro y en sistemas modelo in vivo. Aquí se describe un procedimiento optimizado para el aislamiento y expansión de las células esplénicas murinas iNKT.

Se eliminan los bazos de ratones C57BL / 6 ratones, diseccionaron y tensas y la suspensión celular resultante se acoda sobre medios de gradiente de densidad. Después de la centrifugación, las células mononucleares del bazo (CMN) se recogen y (CD5 ⁺⁾ linfocitos CD5 positivas son enriquecidos por usar perlas magnéticas. células iNKT dentro de la fracción CD5 ⁺ son posteriormente teñidas con ^5; GalCer-cargado tetrámero CD1d y se purificó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). FACS ordenadas células iNKT son entonces cultivaron inicialmente in vitro usando una combinación de citocinas murinas recombinantes y receptor de células T unido a placa (TCR) estímulos antes de ser expandido en presencia de IL-7 murina recombinante. Usando esta técnica, aproximadamente 10 ⁸ células iNKT se pueden generar dentro de 18-20 días de cultivo, después de lo cual se pueden utilizar para los ensayos funcionales in vitro, o in vivo experimentos de transferencia en ratones.

Introducción

Murine células asesinas naturales invariantes T (iNKT) son una población distinta de los linfocitos T innatas seleccionados en el timo por timocitos corticales que expresan CD1d ^1,2. iNKT células expresan un receptor de células T (TCR) compuesto de una cadena invariante Vα14-Jα18 TCR se combina con cualquiera de Vß8, Vβ7 o Vβ2 TCR ^3, que es capaz de reconocer endógena, así como antígenos lipídicos extranjeros en el contexto de CD1d. Por ejemplo, las células murinas iNKT reconocen y se activan por una llamada isoglobotrihexosylceramide antígeno de lípidos endógenos (iGb3) ^4, así como α-galactosylceramide (αGalCer) ^5,6, un glicolípido aislado de esponjas marinas. TCR dependiente de la activación de células iNKT promueve el cebado de la respuesta inmune adaptativa, y como resultado, las células iNKT han demostrado ser funcionalmente implicado en la mejora o desarrollo de una gama de patologías incluyendo la enfermedad reumática ⁷ y el cáncer ^{8. Actualmente, los ligandos de células iNKT sintéticos constituyen prometedores nuevos adyuvantes de vacunas que pueden ser capaces de regular una serie de condiciones inmunopatológicas.}

Previamente se ha demostrado que las células iNKT pueden ser generados in vitro tras el aislamiento a partir de tejido de ratón sin embargo; muchos de estos estudios emplean el uso de células primarias presentadoras de antígeno (APC) y / o líneas celulares ^9, Vα14 TCR transgénicos (Tg) ¹⁰ ratones, timomas o para la generación de hibridomas de células derivadas de iNKT ^11,12. Por otra parte, un gran número de ratones, los altos volúmenes de reactivos tales como dímeros CD1d cargados-αGalCer y largos tiempos de cultivo hacen algunos protocolos publicados menos ética y económicamente atractiva ^9,13.

En este informe se describe un método adaptado para el aislamiento y en la expansión in vitro de células iNKT de bazo de ratón. Más específicamente, el protocolo describe un métodopara enriquecer células iNKT de bazo de ratón que reduce los ratones, los reactivos y el tiempo necesario para la clasificación de células FACS, y propone un enfoque optimizado para la expansión de las células iNKT esplénica ordenados in vitro.

Protocolo

En este estudio, se utilizaron adultos (6-8 semanas) hembra C57Bl / 6 ratones. Los animales fueron alojados y criados de acuerdo con las directrices del vivero Universidad de Gante. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Ética Animal Institucional.

1. Preparación de células mononucleares (CMN) de ratón Bazo

1. Sacrificar el ratón por dislocación cervical.
2. Coloque el mouse hacia abajo en el tablero de disección y fijar la cierva y patas delanteras con alfileres.
3. Esterilizar la superficie de la piel con 70% (vol / vol) de etanol / H ₂ O.
4. Cortar la piel a lo largo de la línea media abdominal al tórax y exponer el bazo usando instrumentos quirúrgicos estériles.
5. Después de recortar los tejidos grasos circundantes, colocar el bazo en una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS) a TA.
6. Diseccionar el bazo utilizando un bisturí estéril y transferir las piezas en un filtro de nylon de 70 micras colocado dentro de una tina 50 mle.
7. El uso de un émbolo de la jeringa 2 ml, puré suavemente las piezas de bazo a través de la filtro de células y lavar con 5 ml de PBS 1x.
8. Añadir 3 ml de Ficoll-Paque a un tubo de 15 ml y superponer el medio de gradiente de densidad con el 5 ml de suspensión celular.
9. Centrifugar a 400 xg durante 20 min a TA sin freno.
10. La transferencia de la interfase a un tubo de 15 ml fresca, añadir 10 ml de PBS frío 1x y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
11. Resuspender las células en 2 ml de 1x PBS que contenía 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (tampón FACS). Transferencia de 10 l de la suspensión celular a un tubo pequeño, se mezcla con 10 l de 0,4%

2. Enriquecimiento, detección y purificación de células de ratón iNKT

1. Enriquecimiento de esplénicas de ratón CD5positive (CD5 ⁺⁾ linfocitos.
   1. (Opcional) Manchas 10 ⁵ células con FITC-conjugado anti-CD5 (4 l de 1:30 dilución / 10 ⁶ células)durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad, se lava con 200 l de tampón FACS y resuspender en 500 l de tampón FACS. Preparar una solución de trabajo 20 mM de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS 1x, añadir 1 l del mismo a 10 ⁵ células en tampón FACS y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. Adquirir 10 ⁴ células pre-enriquecido en el citómetro de flujo.
      1. Usando FCS-H y FCS-W, electrónicamente puerta en las células ^{del lo} FSC-W para excluir dobletes de células y agregados (Figura 1a). Entonces electrónicamente puerta hacia fuera ^{+ células} (muertos) DAPI dentro de la W-FSC ^lo población (Figura 1B), y utilizan SSC-A y FCS-A para seleccionar electrónicamente la población de linfocitos por tamaño (Figura 1C).
      2. El uso de células dentro de la puerta de linfocitos, trazar SSC-A versus CD5 y electrónicamente puerta CD5 ⁺ linfocitos como se muestra en la Figura 1D. Adquirir el resto de la muestra pre-enriquecido en el citómetro de flujo.
   2. Ajustar los recuentos de células a 10 ⁷ células por 90 l de tampón FACS y añadir 10 l microperlas anti-CD5.
   3. Se incuba a 4 ºC durante 15 min, se lava una vez con 4 ml de tampón FACS y resuspender en 500 l de tampón FACS frío. Enriquecer para CD5 ^{+ linfocitos} utilizando separación celular magnética (MACS) columnas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
   4. Opcional) Stain 10 ⁵ células con FITC-conjugado anti-CD5 (4 l de dilución 1:30 / 10 ⁶ células) y DAPI como en 2.1.1. Adquirir 10 ⁴ linfocitos enriquecidos en el citómetro de flujo y verifique que las puertas electrónicas creadas en 2.1.1. seleccionar CD5 ⁺ linfocitos en la fracción celular enriquecida. Adquirir 10 ⁵ células en el citómetro de flujo y analizar el porcentaje CD5 ^{+ linfocitos} presentes en la fracción enriquecida como se muestra en la Figura 1E - H.
2. Detección y aislamiento de ratón iNKT ceLLS por FACS.
   1. Resuspender CD5 ^{+ linfocitos} enriquecidos en una concentración de aproximadamente 10 ⁶ células por 20 l en tampón FACS que contiene anti-CD16 / CD32 (4 l de dilución 1:50 / 10 ⁶ células) y αGalCer PE-conjugado / tetrámero CD1d (1 g / 10 ⁶ células).
   2. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
   3. Diluir los anticuerpos de ratón (mAb) anti-CD3ε V500 (4 l de dilución 1:20 / 10 ⁶ células), anti-CD19 E450 (4 l de dilución 1:50 / 10 ⁶ células) y anti-CD8a E450 (4 l de dilución 1:50 / 10 ⁶ células) en tampón FACS, añadir a CD5 ^{+ linfocitos} e incubar durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
   4. Lavar las células con 1 ml de tampón FACS mediante centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 4 ml de tampón de FACS a una concentración final de 10 ⁷ células / ml.
   5. Filtrar las células a través de un filtro de células de 30 micras y colocar las células en hielo.
   6. Calibrar el citómetro de flujo para la clasificación de células de acuerdo con las recomendaciones del fabricante ^14,15.
      Nota: La calibración de un citómetro de flujo para la clasificación de células requiere entrenamiento y puede ser realizada por un operador con experiencia, o un técnico capacitado.
   7. Añadir 10 l de una solución de trabajo 20 mM de DAPI por cada 10 ⁶ células y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. Adquirir aproximadamente 10 ⁴ CD5 ^{+ linfocitos} enriquecidos en el citómetro de flujo. Puerta electrónicamente en las células ^{del lo} FSC-W para excluir dobletes de células y agregados (Figura 2a). Entonces electrónicamente puerta a cabo DAPI ⁺ CD8 ⁺ CD19 ⁺ células (canal volcado) dentro de la FSC-W ^lo población (Figura 2B), y el uso de SSC-A y FCS-A para seleccionar electrónicamente linfocitos (Figura 2C) como se describe en 2.1.1.1 .
      1. Terreno αGalCer / CD1d tetrámero por CD3ε y electrónicamente puerta αGalCer / CD1dcélulas tetrámero ⁺ CD3ε ⁺ iNKT como se muestra en la Figura 2D. Células presentes en la fracción celular enriquecida Adquirir no más de 2 x 10 ⁵ CD5 ⁺ linfocitos enriquecidos para determinar el porcentaje αGalCer / CD1d tetrámero ⁺ CD3ε ⁺ iNKT.
   8. Utilizando las puertas electrónicas creadas en 2.2.7., Células FACS tipo αGalCer / CD1d tetrámero ⁺ CD3ε ⁺ iNKT en el citómetro de flujo a 70 psi utilizando una boquilla de 70 micras, con un caudal de '1.5'. Recoger las células iNKT ordenados en un tubo de FACS que contiene 1 ml de 100% de FCS. Posteriormente enjuague células iNKT ordenadas por el lado del tubo de FACS utilizando 10 ml RMPI 1640 y centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
   9. Resuspender las células ordenadas iNKT en 1 ml de medio RPMI 1640 y adquirir 40 l del mismo sobre un citómetro de flujo para evaluar la pureza de las células iNKT ordenados. Seleccione FSC-W ^lo DAPI ^- linfocitos como se describe en 2.2.7. (Figura 2E - G) y electrónicamente puerta αGalCer / células tetrámero ⁺ CD3ε ⁺ iNKT CD1d, como se muestra en la figura 2H.

3. Cultura y expansión de células de ratón iNKT

Día 0

1. Escudo una placa de pocillos de fondo plano con 96 anti-CD3ε purificada (3 mg / ml) por pocillo durante 1 hora a RT. Lavar dos veces con 200 l de 1x PBS y una vez con 200 l de medio RPMI 1640 completo (10% FCS vol / vol, 100 U / ml de penicilina-estreptomicina, 5,5 mM β-mercaptoetanol).
2. Contar el número de células viables según iNKT (paso 2.2.8) utilizando 0,4% como en un hemocitómetro 1.11., Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 5 x 10 ⁵ células / ml en RPMI 1640 medio completo que contiene IL-2 murina (10 ng / ml) recombinante, IL-12 murina (1 ng / ml) recombinante soluble y anti-CD28 de ratón (5 mg / ml). Platosorted células iNKT a 10 ⁵ células / pocillo en placas revestidas anti-CD3ε y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ durante 2 días.

Dia 2

3. Transferir las células a una placa fresca sin recubrimiento de fondo plano de 96 pocillos y la cultura de las células bajo condiciones de reposo en medio completo RPMI 1640 a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ durante 2 días.

Día 4

4. Desalojar a los células de la placa por pipeteado suave y transferir las células a un tubo de 15 ml fresco. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C, se resuspenden a 5 x 10 ⁵ células / ml en RPMI completo 1640 que contienen IL-7 murina (5 ng / ml) recombinante, y la placa 10 ⁵ células / pocillo en una Flat- fondo placa de 96 pocillos durante 4 días a 37 ° C en una incubadora de CO _2.

Día 8

5. Recoger las células en un tubo nuevo, centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 5 x 10 ⁵ células / ml en medio completo RPMI 1640 que contenía soluble anti-CD28 (5 g / ml).
6. Escudo una placa de fondo plano 96 con anti-CD3ε purificada (3 mg / ml) por pocillo y lavar como en 3.1. Placa 10 ⁵ células / pocillo en CD3ε anti-placas recubiertas y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ hasta 11 días.

Día 11-18

7. Repita los pasos 3,4 a 3,6.

Día 19-20

8. Transferir las células a un tubo de 15 ml fresca, centrifugar a 300 xg y resuspender en 5 x 10 ⁵ células / ml en medio RPMI 1640 completo.
9. Células de la placa en 10 ⁵ células / pocillo en una placa de pocillos de fondo plano 96 y permitir que las células en reposo durante 2 días a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ antes de su uso en un experimento.

4. Producción de citoquinas por el ratón células iNKT Utilizando un CD1d PlatEnsayo de e-unido

1. Escudo una placa de pocillos de fondo plano 96 con 100 l de murina recombinante CD1d (10 g / ml en PBS 1x) por pocillo e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
2. Lavar cuatro veces con 200 l de 1x PBS, añadir 200 l de 2% de FCS en 1x PBS (solución de bloqueo) por pocillo y se incuba durante 2 horas a 37 ° C.
3. Eliminar la solución de bloqueo, añadir 200 l de αGalCer (5 ng / l) por pocillo, y se incuba la placa a 37 ° C durante 16 horas. [Para la preparación de la solución αGalCer, añadir 1,085 μ 1x PBS a 55 g de αGalCer disuelto en vehículo que contiene 96 mg / ml de sacarosa, 10 mg / ml y desoxicolato de sodio 5 mg / ml tween 20].
4. Después de la incubación, desechar la solución αGalCer y lavar el pozo dos veces con 200 l 1x PBS seguido de 200 l completa medianas RPMI 1640.
5. Recoger las células iNKT expandidas in vitro en el día 21, de centrifugación las células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en completa RPMI 1640 a una concentración de 0,5 x 10 ⁶ células / ml.
6. Añadir 200 l de la resuspensión de células iNKT por pocillo y se incuba durante 72 horas a 37 ° C en una incubadora de CO _2.
7. Recoger el sobrenadante y la medición de las citoquinas de interés por el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Resultados

Aislamiento de células mononucleares del bazo utilizando un gradiente de densidad tarda aproximadamente 1 hora y se elimina el uso de reactivos necesarios para lisar los glóbulos rojos (GR). Se obtiene un alto rendimiento de células viables utilizando este método y los escombros generados durante el esfuerzo del órgano es eliminado. Típicamente, la frecuencia de células iNKT dentro de la piscina de linfocitos del bazo oscila entre 1 y 5% del total de linfocitos T sin embargo, esto puede variar dependiendo del estado de ...

Discusión

Los pasos críticos en el actual protocolo incluyen el aislamiento y posterior enriquecimiento de CD5 ^{+ linfocitos} (Sección 1 y 2), FACS clasificación (Sección 3) y el recubrimiento inicial de células iNKT (Sección 4). De los pasos realizados en la Sección 1, recuerda a la capa cuidadosamente la suspensión celular esplénica sobre el medio de gradiente de densidad tal que una interfase celular distinta se genera después de la centrifugación. El enriquecimiento posterior para CD5 ^{+ linfocitos} por sepa...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Material
il-2 murino recombinante	eBiosciences	14-8021
IL-12 murino recombinante	eBiosciences	39-8122-65
IL-7 murino recombinante	eBiosciences	14-8071
purificado anti-ratón CD3e (145-2C11)	eBiosciences	16-0032-86
purificado anti-ratón CD28 (37.51)	eBiosciences	16-0281-85
e450-conjugado anti-ratón CD19 (eBio1D3)	eBiosciences	48-0193-82
e450-conjugado anti-ratón CD8α (53-6.7)	eBiosciences	48-0081-82
CD5 anti-ratón conjugado por FITC (53-7.3)	eBiosciences	11-0051-81
V500-anti-ratón conjugado CD3&épsilon; (500A2)	BD biosciences	560771
microperlas anti-ratón CD5 (Ly-1)	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
purificado anti-ratón CD16/32 (2.4G2)	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS Columnas	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Azul Tripano, 0.4% (peso/volumen)	Gibco	15250-061
RPMI 1640 mediano	Gibco	12633-020
1x PBS	Gibco	10010-056	[Ca2+/Mg2+ - gratis]
Suero fetal de ternera	Gibco	10270
L-Glutamina	Gibco	25030-123
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Albúmina	sérica bovinaSigma-Aldrich	A7906-100MG
β-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
Equipment Placa
de 96 pocillos F-bottom	Greiner-bio one	657-160
Placa de 24 pocillos	Greiner-bio one	665-180
Placa de 6 pocillos	Greiner-bio one	655-180
15 ml falcon tubo	Greiner-bio one	188-271
50 ml tubo halcón	Greiner-bio one	227-261
70 µ m filtro	Greiner-bio one	542-070
30 µ Filtro m	Millipore	SVGP01050
Separador MiniMACS	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Columnas	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Incubadora de CO2 con camisa de agua	Hemocitómetro VWR
Kit de disección	VWR
VWR BD FACSAria III	BD Biociencias