Artículo de método

La detección de Intracelular expresión génica en células vivas de murino, humano y porcino Origen Utilizando nanopartículas fluorescencia marcado

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DOI:

10.3791/53268

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13 de noviembre de 2015

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1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe una técnica novedosa que permite la detección de la expresión génica intracelular después de la endocitosis de nanopartículas marcadas con fluorescencia directamente en células vivas. El método no requiere manipulación de las células y no está restringido con respecto al gen o especie objetivo.

Resumen

La reprogramación de células somáticas a células madre pluripotentes inducidas (iPS) se ha realizado con éxito en diferentes especies de mamíferos, incluyendo ratones, ratas, humanos, cerdos y otros. La verificación de clones de iPS se basa principalmente en la detección de la expresión endógena de diferentes genes de pluripotencia. Estos genes representan principalmente factores de transcripción que se encuentran en el núcleo de la célula. Tradicionalmente, la prueba de su expresión endógena se suministra mediante tinción inmunohistoquímica después de la fijación de las células. Este enfoque requiere replicar los cultivos de cada clon en esta etapa temprana para preservar los clones validados para experimentos posteriores. El presente protocolo describe un enfoque con nanopartículas específicas de genes que permite la evaluación de la expresión génica intracelular directamente en células vivas mediante fluorescencia. Las nanopartículas consisten en una partícula central de oro acoplada a una hebra de captura que lleva una secuencia complementaria al ARNm objetivo, así como una hebra reportera apagada. Estas nanopartículas se endocitan activamente y el ARNm objetivo desplaza la hebra reportera, que luego comienza a emitir fluorescencia. Por lo tanto, la expresión de genes objetivo específicos se puede detectar directamente bajo el microscopio. Además, la fluorescencia emitida permite la identificación, aislamiento y enriquecimiento de células que expresan un gen específico mediante citometría de flujo. Este método se puede aplicar directamente a células vivas en cultivo sin necesidad de manipular las células objetivo.

Introducción

En 2006, un nuevo enfoque fue descrito para reprogramar células somáticas en un estado pluripotente. Después de la preselección de una matriz de potencial reprogramación factores de fibroblastos murinos se podrían convertir con éxito a la denominada células madre pluripotentes inducidas (iPS) por transducción retroviral y la sobreexpresión de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Posteriormente esta técnica efectivamente se ha reproducido utilizando células somáticas de las diferentes especies de mamíferos, incluyendo seres humanos 2, monos, ratas 3 4, 5 perros, ovejas y cerdos 6 7. Además, modificado protocolos omitir o sustituir el factor de transcripción c-MYC potencialmente oncogénico se han publicado 8, 9.

Independientemente de la reprogramación inicial de acercarse a la verdad pluripotencia de las colonias en crecimiento tiene que ser confirmado, una tarea laboriosa y requiere mucho tiempo. Un inconveniente importantede la mayoría de estos análisis es que no se pueden realizar en células vivas. Factores de pluripotencia establecidos, tales como Oct4, Sox2, NANOG o REX1 representan factores de transcripción localizados en el núcleo y su detección requiere la fijación de las células antes de la inmunohistoquímica o la lisis celular para el análisis de RT-PCR 10 -. 12 Después de esto, estas células se pierden para el futuro experimentos que requieren cultivos replicados de cada colonia.

Por lo tanto, una tecnología para analizar la pluripotencia en células vivas es altamente deseable. Varios enfoques de hecho se pueden realizar directamente en células vivas utilizando anticuerpos dirigidos contra antígenos basados ​​en membranas (por ejemplo. TRA-1 a 60, SSEA4) 12, fluorescente informó colorantes para detectar fosfatasa 13 o moléculas pequeñas alcalinos que etiquetan específicamente madre embrionarias (ES) y las células iPS 14. Sin embargo, los anticuerpos pueden, sin embargo, afectar adversamente a las células y cada metod está restringido a un único marcador de pluripotencia. Por último, las balizas moleculares fluorescentes, los oligonucleótidos de doble antisentido con estructuras de horquilla, que permiten tinción en vivo de las células, se han descrito 15. Aunque este enfoque puede ser aplicado a muchos genes, la técnica requiere nucleofection de una única suspensión celular, que no es aplicable a las crecientes iPS colonias.

Hace un par de años las nanopartículas de genes específicos se han descrito para analizar la expresión de survivina en células de cáncer de mama SKBR3 humanos 16. Este manuscrito describe un nuevo enfoque innovador para la detección de marcadores de pluripotencia en ES vivos y las células iPS a través del uso de conjugados de nanopartículas de oro. Estas nanopartículas se componen de una partícula central de oro con una cadena de captura unido lleva la secuencia de ARN complementaria y una hebra reportero marcado con Cy3. La señal fluorescente de la hebra reportero se inactivó mediante la partícula de oro central. Además, apropiadonanopartículas sirven como controles negativos y positivos, respectivamente (Figura 1). Para una aplicación de las nanopartículas simplemente se añaden al medio de cultivo (Figura 2) y entran en las células a través de endocitosis (Figura 3). Si se expresa el ARN diana que desplaza la hebra reportero que entonces emite una señal fluorescente. Este método no requiere la manipulación de la célula diana y la expresión del gen diana se puede monitorizar ópticamente bajo un microscopio de fluorescencia directa en células vivas. Además, la tecnología se puede aplicar a cualquier gen diana deseada a través de especies en el caso de las células iPS y por lo tanto se puede emplear en muchas áreas de investigación diferentes. Finalmente, los análisis de citometría de flujo permite la identificación y el enriquecimiento de células positivas Cy3.

Protocolo

1. Preparación de Medios, Reactivos y condiciones de cultivo celular

  1. 293 células de riñón embrionario humano HEK
    1. Cultura células HEK 293 (CRL-1573, ATCC) en medio F-12 DMEM / Ham suplementado con 5% de FCS, L-glutamina (2 mM), y penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 g / ml).
    2. Para el paso de las células, lavar las células una vez con PBS, añadir 0,05% de tripsina / EDTA y se incuba durante 3 min a 37 ° C y 5% de CO 2. La transferencia de células en un tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 min a 1200 rpm (300 x g) y se transfieren unos 5x10 5 células en un matraz de cultivo T25 fresco.
  2. Fibroblastos embrionarios murinos (MEF)
    1. Añadir 1 ml de una solución de gelatina 0,1% a 6 pocillos individuales y se incuba a temperatura ambiente (RT) durante 1 hr. Aspirar el líquido y se almacenan a temperatura ambiente hasta su uso.
    2. Cultura MEFs en DMEM suplementado con 10% de FCS, L-glutamina (2 mM), L-glucosa (4,5 g / l), piruvato de sodio (1 mM), y penicilina (100 U /ml) / estreptomicina (100 mg / ml) en placas de 6 pocillos recubiertos de gelatina.
    3. Distribuir MEFs en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer hasta confluencia. Añadir mitomicina (5 mg / ml) durante 2,5 horas para detener a las células. Medio Aspirar, lavar las células dos veces con medio MEF completa y añadir 3 ml de medio MEF a cada 6 pocillos. Estas células sirven como un alimentador de capa de células murinas y iPS porcinos.
  3. Cultura de ES murinos y células iPS
    1. Para preparar ratón medio de cultivo ES, complementar medio DMEM con 15% de FCS, L-glutamina (2 mM), L-glucosa (4,5 g / l), aminoácidos no esenciales MEM (1x), β-mercaptoetanol (0,1 mM) y el factor inhibidor de la leucemia (1.000 U / ml).
    2. Enjuague 6-pozos con MEFs crecimiento detenido una vez con DMEM sin suero, añadir 2 ml de ratón ES medio y las células iPS murinas (20% de las células de un plato confluente). Cada día las células de lavado una vez con DMEM libre de suero y añadir 2 ml de ratón fresco medianas ES.
    3. Para el paso de las células, lavar cada pocillo una vez con DMEM sin suero, añadir 00,25% de tripsina / EDTA y se incuba durante 3 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2. La transferencia de células en un tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 min a 1200 rpm (300 x g), Resuspender las células en 500 l del ratón medio ES y añadir 100 l de la suspensión de 2 ml ratón medio ES en un fresco 6 pocillos con una MEF alimentador de capas.
  4. Cultura de cerdo células iPS
    1. Para preparar cerdo medio iPS, complementar DMEM / Ham F-12 medio con 20% de suero de knockout, L-glutamina (2 mM), aminoácidos no esenciales MEM (1x), β-mercaptoetanol (0,1 mM), y penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 g / ml). Filtrar a través de un filtro de 0,22 M y se almacena a 4 ° C durante 2 a 3 semanas. Tras la primera utilización, añadir bFGF (10 ng / ml de concentración final).
    2. Enjuague 6-pozos con MEFs crecimiento detenido una vez con DMEM libre de suero / F-12 y añadir 1,5 ml de cerdo iPS medio de Ham y porcina células iPS (10% de las células de un plato confluente). Cada día de lavado de las células una vez con DMEM libre de suero / Ham F-12 y añadir 1,5 ml de cerdo fresca medianas iPS.
    3. Para preparar tampón de disociación añadir 2,5% de tripsina, colagenasa IV (10 mg / ml), suero knockout (20%) y CaCl 2 (1 mM) para Ca 2 + libre de PBS. Lavar las células dos veces con PBS y se incuban con tampón de disociación durante 5 min a 37 ° C y 5% de CO 2. La transferencia de células en un tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 min a 1200 rpm (300 x g).
    4. Resuspender las células iPS de porcino en 500 l fresca de cerdo medio iPS y añadir 50 l de la suspensión a 1,5 ml de cerdo medio iPS en un nuevo máximo de 6 pocillos con un alimentador de capa MEF. Cada día de lavado de las células una vez con DMEM libre de suero / de Ham F-12 y añadir 1,5 ml de cerdo fresca medio iPS.
  5. Cultura-alimentador libre de células iPS humanas
    1. Descongelar el vial original que contiene la preparación de la membrana basal a 4 ° C y se diluye con enfriado con hielo libre de suero DMEM / Ham F-de 12 a 8 mg / ml, alícuota y se almacena a -20 ° C hasta su uso posterior.
    2. Descongelar una alícuota de la basepreparación de membrana ción a 4 ° C y se diluye con DMEM / F12 de Ham enfriado con hielo libre de suero (90 mg / ml). Pipetear 1 ml de esta solución en placas de cultivo de 3 cm y agitar suavemente para asegurar que toda la superficie está cubierta. Selle platos con parafilm y se almacena a 4 ° C durante un máximo de una semana. Antes de la utilización para el cultivo celular incubar platos para 30 min a 37 ° C o 3 horas a RT para permitir la polimerización de la preparación de la membrana basal.
    3. Aspirar medio de los platos recubierto con la preparación de la membrana basal y lavar dos veces con DMEM libre de suero / Ham F-12. Añadir 1,5 ml de medio E8 a la placa de cultivo y las células iPS humanas (10% de las células de un plato confluente). Cada día de lavado de las células una vez con DMEM libre de suero / F-12 y añadir 1,5 ml de medio E8 fresca de Ham.
    4. Para el paso de las células, lavar los platos dos veces con PBS y se añade 1 ml de PBS / EDTA 0,5 mM. Incubar los platos durante 5 min a RT. Monitorear las células bajo un microscopio. Nota: Cuando las colonias comienzan a redondear y appear tener agujeros que están listos para la transferencia.
    5. Aspirar el líquido, añadir 1,5 ml de medio E8 y separar las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. La transferencia de células a un tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 min a 1200 rpm (300 x g), resuspender en 500 l medio E8 y añadir 50 l de la suspensión a 1,5 ml de medio E8 en una placa de cultivo fresco recubierto con la preparación de la membrana basal .

2. Diseño de Target-secuencias entre especies Fronteras

  1. Seleccione secuencias de cDNA porcino de los genes diana (GAPDH, NANOG, GDF3) humana de referencia, y murino y realizar un análisis de la alineación de múltiples secuencias CLUSTAL.
    Nota: Esto indicará las secuencias homólogas entre especies.
    1. Utilice los siguientes valores para la alineación múltiple: penalización por hueco (fijo) 10, penalización por hueco (variable) 5, la transición ponderación 0, rango de pena de la separación brecha de 8,% de identidad en caso de retraso 40, número máximo de iteraciones a realizar 3.
  2. Enviar secuencias diana deseados al fabricante (véase la Tabla de Materiales) para el diseño de la sonda y la fabricación.
    Nota: El fabricante se confirme la compatibilidad de secuencia deseada con la tecnología. Si secuencia deseada no es compatible, el fabricante sugiere secuencias alternativas.
    1. Asegurar que las regiones homólogas que pueden ser utilizados como posibles secuencias de la cadena de captura tienen una longitud de 27 pb.
      Nota: Es aconsejable pedir varias nanopartículas con diferentes líneas de captura para un gen diana seleccionada, ya que sólo el experimento celular verdadera dará una prueba definitiva de la funcionalidad de una secuencia individual. Por lo tanto, se evaluaron dos secuencias diferentes para GAPDH y GDF3 mientras que tres diferentes nanopartículas se ensayaron para evaluar la expresión NANOG. Su ubicación y las secuencias exactas han sido publicados en otra parte 17. El fabricante fabrica comercialmente el nanopartículos con secuencias deseadas y les proporciona en formato liofilizado.

3. La reconstitución de nanopartículas y adición de Cultivos Celulares

  1. Guarde nanopartículas liofilizadas sobre el recibo a 4 ° C en la oscuridad.
  2. Reconstituir las nanopartículas mediante la adición de 50 l de agua doble destilada que da una concentración final de 100 nM. Una vez reconstituido tienda nanopartículas a temperatura ambiente en la oscuridad. Nota: En esta condición son estables durante al menos un año. Almacenamiento de muestras reconstituidas a 4 ° C puede afectar negativamente a su estabilidad.
  3. Pre-diluir la solución de nanopartículas de valores con PBS a una concentración de 2 (células HEK 293) o de 8 Nm (iPS y las células madre embrionarias) en el día de la solicitud. Nota: Esta concentración es 20 veces mayor que la concentración final en la placa de cultivo. En las células ES y células iPS, 400 pM de nanopartículas indujo una señal fluorescente fácilmente detectable bajo el microscopio. Para las células HEK 293, aconcentración de 100 pM es suficiente.
  4. Pipetear 12,5 l de nanopartículas prediluidas a un 237,5 l medio de cultivo celular completa de 24 pocillos que contiene. Para los pozos de diferentes tamaños, ajustar los volúmenes en consecuencia. Agite la placa cuidadosamente para garantizar la igualdad de la distribución de las nanopartículas. Se incuban las células durante la noche (O / N) a 37 ° C y 5% de CO 2 en un ambiente humidificado.
  5. Al día siguiente, los cultivos celulares para analizar genes específicos de Cy3 fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 546 nm (emisión de 575 a 640 nm) bajo un microscopio de fluorescencia. Nota: El periodo requerido para obtener una suficientemente fuerte fluorescencia puede depender del tipo de célula y el gen diana. En estos experimentos, esto se observó entre 16 y 20 horas después de la aplicación de la sonda.

4. Identificación de Cy3 positivos celulares Poblaciones por Citometría de Flujo

  1. Crecer HEK 293 o células madre embrionarias murinas utilizando las condiciones especificadas en el apartado 1.1 o 1.3, respectively. Un día antes de la FACS análisis de añadir GAPDH específicos de nanopartículas a diferentes concentraciones de células HEK 293 (véase la Figura 6A) y en 400 pM para las células ES murinas. Se incuban las células O / N a 37 ° C y 5% de CO2 en una atmósfera húmeda.
  2. Analizar los cultivos celulares para la fluorescencia inducida por Cy3-gen específico bajo un microscopio de fluorescencia.
  3. Separe células HEK 293 como se especifica en el punto 1.1.2. Centrifugar, transferir a un tubo de 1,5 ml y resuspender en 200 l PBS enfriado con hielo / 0,5% BSA / 2 (tampón FACS) mM EDTA. Mantenga celdas oscuras en hielo hasta que el análisis de citometría de flujo.
  4. Separe las células ES murinas como se especifica en el punto 1.3.3. Centrifugar, transferir a un tubo de 1,5 ml y resuspender en 200 l PBS enfriado con hielo / 0,5% de BSA / EDTA 2 mM. Mantenga celdas oscuras en hielo hasta que el análisis de citometría de flujo.
  5. Pulse las células a través de un filtro de 30 micras para prevenir la agregación de células y añadir yoduro de propidio (concentración final 2 mg / ml) 2 minantes del análisis FACS para excluir las células muertas.
  6. Para analizar las células Cy3-positivos primera establecidos puertas jerárquicos en la FSC-A / SSC-Un subconjunto, la FSC-H / FSC-W-subgrupo y el subgrupo SSC-H / SSC-W. Utilice el avance y la dispersión lateral para excluir los desechos celulares y células que no se encuentran dispersos. Excluir las células muertas por su tinción con yoduro de propidio mostrar PE contra PE-Texas Red. Realizar la puerta tipo final sobre células Cy3-PE positivos (Figura 4).

Resultados

En un primer intento de verificar y comprobar la detección intracelular de expresión de genes específicos en células vivas utilizando nanopartículas decidimos realizar experiencias piloto utilizando un gen casa de mantenimiento de constitutivamente expresado (GAPDH) en células 293 HEK humano. La concentración de las nanopartículas utilizadas en estos experimentos fue elegido de acuerdo a la recomendación del fabricante. La adición de una sonda específico de GAPDH al medio de cultivo a una concentración final 100 pM indujo una clara Cy3-fluorescencia en estas células, que era visible bajo un microscopio de fluorescencia después de la incubación O / N (Figura 5A). Dos controles se incluyeron en estos experimentos para corroborar el resultado. Uno de control comprende de un denominado nanopartícula "scramble", donde la hebra reportero no tiene una secuencia coincidente en células de mamífero o eucariotas. La nanopartícula "scramble" determina el fondo inespecífico fluorescence debido a la posible degradación de la sonda o de temple incompleta de la fluorescencia. La adición de la sonda scramble produjo una única señal marginal fluorescente, que es insignificante (Figura 5B). Un control "absorción" fluorescente de forma permanente ayuda a determinar la capacidad de las células para incorporar las nanopartículas por endocitosis que puede variar entre los diferentes tipos de células. Estas partículas de control positivo produjeron una señal fluorescente brillante en células HEK 293 (Figura 5C). Por lo tanto, se confirmó la viabilidad de la tecnología para grabar una señal fluorescente específica de un gen intracelular con una señal de fondo despreciable. Se debe mencionar que la diferencia entre la señal de fondo y la fluorescencia específica disminuye con el tiempo. Los aumentos de fondo debido a la sonda degradación o extinción incompleta mientras que la fluorescencia específica se desvanece poco a poco (Figura 5D). Las mismas nanopartículas específicos de GAPDH tienenha probado en cultivos de fibroblastos primarios de murino, porcina y ovina origen 17. Estas células producen una señal de fondo mucho más alto que las células HEK 293, mientras que la fluorescencia específica de la diana es más bien débil, posiblemente debido a la relativamente baja capacidad proliferativa de estos cultivos.

Estas experiencias piloto nos llevó a usar esta tecnología para la detección de la expresión de genes pluripotencia en células iPS derivadas de diferentes especies. Para este propósito se analizaron NANOG y GDF3, ambos de los cuales se sabe que se expresa en las células pluripotentes 18. Al principio, las células iPS derivadas de fibroblastos punta de la cola de un promotor cardiaca línea de ratones transgénicos Nkx2.5 19 fueron investigados. Para ambos genes se obtuvo una señal fluorescente fuerte (Figura 6A) y una insignificante Cy3-fluorescencia del control scramble (datos no mostrados). Resultados similares se obtuvieron en células iPS humanas y porcinas (Figura 6B y C). Es importante destacar que la señal de fluorescencia fue restringido a las colonias iPS y no etiquetar los fibroblastos utilizados como una capa de alimentación para ratón y iPS porcina (ver flechas en la Figura 6A y C). El análisis de la expresión génica NANOG también reveló que no todos secuencia prevista en silico para ser "buena" por fin es funcional. Uno de los tres diseños de un NANOG específicos de nanopartículas inducidas casi no hay señal fluorescente comparable a la del control scramble a pesar de un 100% de coincidencia de secuencia en las células iPS murinos (Figura 6D). Un resultado similar se obtuvo en células iPS de origen porcino y humano con esta sonda (datos no mostrados). Por lo tanto, las nanopartículas se pueden usar para detectar la expresión de genes a través de especies pluripotencia fronteras mientras que la funcionalidad de cada sonda diseñada solo necesita ser evaluado de antemano.

Los prometedores resultados de la in situetiquetado de células vivas en placas de cultivo celular nos llevó a analizar la expresión génica cuantitativamente por citometría de flujo. Con este fin se añadieron nanopartículas específicos de GAPDH en concentraciones graduadas a HEK 293 monocapas con el fin de comparar la eficiencia de etiquetado dentro de la población de células diana. Según la evaluación realizada por microscopía fluorescente una fluorescencia inducida por Cy3 mejorada fue visto con la concentración más baja en comparación con células que no recibieron las nanopartículas. Concentraciones crecientes de las nanopartículas indujeron una fluorescencia depende claramente concentración de células HEK 293 in situ (Figura 7A). Someter a estas células a un análisis de citometría de flujo confirmó la eficacia de marcado dependiente de la concentración. La frecuencia de células positivas Cy3 aumentó significativamente (más de siete veces) cuando la concentración más alta de nanopartículas se aplicó (Figura 7B). En otros experimentos ES células de la cardiaco Nkx2.5potenciador de la línea de ratones transgénicos 19 se utilizaron para analizar la expresión de genes de pluripotencia por citometría de flujo. Experiencias piloto con 400 pM del control captación positiva rindieron claramente Cy3 ES vivo colonias positivas en el microscopio y citometría de flujo detecta casi el 40% de las células positivas Cy3 (Figura 7C). En contraste, comparable a las células no tratadas aproximadamente 0,1% de células tratadas con el scramble manchado positivo (datos no mostrados). Del mismo modo la adición de nanopartículas específicos para GAPDH, Nanog y GDF3 induce una señal de fluorescencia distinta en colonias individuales en la placa de cultivo celular. La frecuencia de células positivas para Cy3 Gapdh como se determinó por citometría de flujo fue comparable a la observada para ambos genes pluripotencia (Figura 7C). Este resultado es esperable como también se cree Nanog y GDF3 que se expresa constitutivamente en células madre embrionarias pluripotentes. Por lo tanto, estos datos claramente indiCate que las células que expresan un gen en particular se pueden identificar por análisis de citometría de flujo, cualitativamente y por su cantidad relativa.

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Figura 1: Representación esquemática de la estructura de las nanopartículas. (A) Estructura de una nanopartícula-gen específico. (B) nanopartículas Scramble (control negativo). (C) La captación de nanopartículas (control positivo). Adaptado de Lahm et al. 17, reimpreso con el permiso de Wiley.

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Figura 2: Aplicación de nanopartículas a los cultivos celulares Una solución adecuadamente diluida de nanopartículas se pipetea simplemente al medio de cultivo.. Después de O / incubación células fluorescentes específicos del gen N son visibles bajo af microscopio luorescent.

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Figura 3:. La absorción activa de nanopartículas por las células a través de endocitosis (A) Las células fagocitan activamente las nanopartículas por endocitosis (B) mRNA diana se une a la cadena de captura y desplaza el reportero fluorescente..

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Figura 4: Estrategia de apertura de puerta para citometría de flujo. (A) Estrategia para HEK 293 células. (B) Estrategia de células madre embrionarias murinas. Los datos fueron adquiridos mediante dispositivo 1 para las células HEK 293 o dispositivo 2 de células madre embrionarias murinas y se analizaron posteriormente por una herramienta de software (véase la Tabla de Materiales).

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Figura 5:. Análisis de GAPDH-expresión en células HEK 293 Una nanopartícula específico de GAPDH se añadió a las células a 100 pM (concentración final) y la fluorescencia se registró después de O / N de incubación (A) GAPDH nanopartícula específico de (B.. ) Scramble (control negativo). (C) Captación (control positivo). (D) Cinética de scramble y el control de la absorción. La fluorescencia se determina en los puntos de tiempo indicados después de la adición de nanopartículas específicos de GAPDH. Las barras de escala representan 50 micras.

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Figura 6:. Análisis de Pluripotencia expresión génica en células iPS de especies diferentes nanopartículas específico para NANOG o GDF3 se añadieron a las células a 400 pM (conce definitivantration) y la fluorescencia se registró después de O / N de incubación. () Las células iPS murino A. (B) células iPS humanas. (C) células iPS porcino. Las flechas en (A) y (C) designan células alimentador de capa de fibroblastos no marcado. (D) de la fluorescencia en las células iPS murinos después de la adición de la NANOG-diseño SF3 nanopartícula. Las barras de escala representan 50 micras.

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Figura 7: nanopartículas Etiquetada células vivas pueden ser identificados por citometría de flujo. (A) vista microscópica de Cy3 HEK positivo 293 células después de la adición de diferentes concentraciones de nanopartículas. (B) Frecuencia de células positivas Cy3 determinados por citometría de flujo. (C) tinción vivo de murinos colonias de células ES y la determinación de la frecuencia de Cy3 positivo las células. Se añadieron nanopartículasa una concentración final de 400 pM. Las barras de escala representan 50 micras.

Discusión

El presente trabajo describe el uso de marcado con fluorescencia nanopartículas que permiten la evaluación fiable de la expresión génica intracelular directamente en células vivas de diferentes especies de mamíferos con diverso origen histogenético bajo un microscopio de fluorescencia. Este enfoque tiene un par de ventajas en comparación con otros métodos publicados. En primer lugar el investigador no está limitado con respecto a cualquiera de los genes diana o tipo de célula. Todos los métodos de detección de anticuerpos basados ​​están restringidas a un solo epítopo. Aunque fluorescentes balizas moleculares también pueden diseñarse para un amplio espectro de genes, este método requiere la disociación de las células y la posterior nucleofection 15. En contraste, la aplicación de nanopartículas de genes específicos no requiere ningún tipo de manipulación de la célula diana que envuelve las nanopartículas activamente por endocitosis. Durante la posterior pases las partículas de oro dejan gradualmente las células y el cultivo se pueden utilizar en downstream experimentos.

Sin embargo, la tecnología también todavía tiene algunas limitaciones. Algunos marcadores, obviamente, no son detectables debido a su naturaleza carbohidrato tal como SSEA-1 o TRA-1-81 20. En la actualidad, una gran variedad de nanopartículas está disponible comercialmente. Estas partículas han sido previamente probado por su funcionalidad en los experimentos celulares. El objetivo del presente trabajo fue diseñar sondas personalizadas que se pueden utilizar en todas las especies de las fronteras. Al seguir este tipo de enfoque o en el diseño de una sonda para un nuevo gen diana uno tiene que ser consciente de que la funcionalidad de un in silico predijo la sonda debe ser evaluado a fondo en vitro. La sonda NANOG-SF3 que mostró una homología del 100% a la homología de secuencia no funcionaba en absoluto mientras NANOG-SF1 con una sola base de no coincidentes en el murino y secuencia porcina produce una señal de fluorescencia agradable. Otra cuestión se refiere a la absorción eficiente de las nanopartículas. Las partículas entranlas células por endocitosis, un proceso que está influenciada por el tamaño de las nanopartículas 21, el tipo de célula y el estado de diferenciación 22 y la capacidad celular para llevar a cabo phago- y macropinocitosis 23. La concentración óptima para obtener una señal de fluorescencia satisfactoria tiene que ser probado para cada aplicación individual o línea celular. Con ese fin, el primer experimento debe ser siempre la aplicación del control captación para evaluar la compatibilidad de las sondas dentro de los tipos de células y condiciones de cultivo antes de pasar a la detección específica de la diana de la expresión génica.

Un punto fundamental para obtener resultados fiables al aplicar este protocolo para una novela línea celular o población celular es la inclusión de controles adecuados. El control de la captación de fluorescencia nunca proporcionará un indicio que las concentraciones de nanopartículas inducirán una señal fluorescente suficiente en la población de células diana. La fluorescencia se debe evaluard al día siguiente ya que la señal se desvanecerá con el tiempo 17. Al mismo tiempo el control scramble sin una contraparte en el genoma eucariótico aplicado a una concentración idéntica debe inducir una señal de fondo despreciable. Como tercera de control, es aconsejable utilizar una nanopartícula específico para un gen de mantenimiento (por ejemplo, GAPDH, β-actina). Estas nanopartículas sirven como un control positivo que el enfoque se puede utilizar para detectar la expresión de genes específicos en la población celular diana seleccionada. Si estos controles resultan satisfactorias se puede esperar obtener señales fluorescentes específicas fiables utilizando nanopartículas específicas para otros genes diana. La concentración de las nanopartículas aplicadas también puede ser crítico, ya que se ha demostrado que regular a la baja la secuencia diana 24. Sin embargo, este efecto requiere concentraciones mucho más altas (5 nM) que las concentraciones utilizadas en los experimentos presentados aquí (400 pM). A esta concentración la nanoflares no afectan ARNm objetivo gen o los niveles de proteína y concentraciones de hasta 2 nM no perjudiquen la proliferación de las células HEK293 y células madre embrionarias murinas 17. Además, un análisis de la expresión del genoma completo no reveló cambios significativos en la expresión génica 25. Por lo tanto, en concentraciones de hasta 1 nM las nanoflares no deberían exhibir efectos adversos importantes.

Una aplicación muy prometedor de esta tecnología es la posibilidad de etiquetar cualquier población de células dada que está marcado por un gen específico. Recientemente, las nanopartículas de genes específicos de éxito han sido utilizados para teñir selectivamente miocitos ventriculares en vivo 26, subpoblaciones de células de melanoma 27, monocitos y células cerebelosa 28 culturas 29. Tales poblaciones de células de fluorescencia de marcado pueden ser ordenados y se purificaron por citometría de flujo como células vivas. En el campo de la oncología es imaginable para aislar las células tumorales metastásicas en vivo en modelos animalesen base a su expresión de CEA, más valioso para la búsqueda de metástasis potencial de promoción de genes o estructuras diana. Recientemente hemos demostrado que las colonias iPS murinas verdaderamente reprogramadas pueden ser identificados in situ con Nanog específicos de nanopartículas basadas en la intensidad de fluorescencia detectada 17. Por lo tanto, la identificación de las colonias de iPS reprogramadas verdaderamente se podría realizar en las plataformas de alto rendimiento, que utilizan la detección de fluorescencia robótica y los dispositivos de picking para identificar las colonias más prometedores. Esta tecnología parece ser adecuada en muchas áreas de investigación para seleccionar subpoblaciones celulares específicos y parece posible aplicar las nanopartículas en plataformas de alto rendimiento. En conclusión, este protocolo representa un nuevo enfoque marcado con fluorescencia usando nanopartículas que permite la detección de la expresión génica intracelular directamente en células vivas. Esta tecnología puede ser una herramienta valiosa para purificar, ampliar y más carácterize subpoblaciones celulares raras en muchas áreas de investigación.

Divulgaciones

HL ha recibido las nanopartículas de EMD Millipore Corporation de forma gratuita. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Lynette Henkel por su excelente apoyo en la realización del análisis de citometría de flujo. Agradecemos al Dr. Don Weldon y al Dr. Victor Koong (Temecula, CA) por la lectura crítica del manuscrito y sus útiles comentarios. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Alemana de Investigación, KR-3770-7/1 y KR-3770-9/1 (M. K.), la Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), la Beca de Investigación Dr. Rusche 2014 de la Deutsche Stiftung für Herzforschung y la Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), y el Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A y DZHK B 14-013SE (M. K.).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM/Ham F12 medio con glutamina estableBiochrome GmbHFG4815
Suero fetal de terneraLife TechnologiesSV30160.03
Penicilina/Estreptomicina (100x)MilliporeA2213
Piruvato de sodio (100x)Life Technologies11360-039
DMEM glucosa alta con glutamina estableBiochrome GmbHFG0435
Mitomicina CRoche10 107 409 001previene la división celular de los aminoácidos
no esenciales MEM de MEF (100x)Life Technologies11140-050
b-MercaptoethanolSigmaM3148
Factor inhibidor de la leucemia (107 U/ml)MilliporeESG1107factor de crecimiento para células ES e iPS murinas, Previene la diferenciación
0,25% Tripsina/EDTA (1x)Life Technologies25200-056separa los cultivos celulares adheridos
Suero knockoutInvitrogen10828-028suplemento para cultivo de células iPS humanas y porcinas
bFGFPeprotech100-18B factor decrecimiento para células iPS humanas y porcinas
Colagenasa IVWorthingtonLS004188disociación de células iPS porcinas
MatrigelCorning354277superficie efectiva para el cultivo sin alimentador de células iPS humanas, denominada membrana de preparación basal en el manuscrito
Medio E8Stem Cell Technologies05940medio definido para el cultivo sin alimentador de células iPS humanas
15575-038
SmartFlareEMD Millipore Corporationartículo personalizadoDetección de la expresión génica intracelular en células vivas, denominadas nanopartículas en el manuscrito
Microscopio de fluorescenciaZeissAxiovert 200M
HeraCell 150i CO2 IncubadoraThermo Scientific51026282
Gelatina (de piel de cerdo)SigmaG6144mejora la fijación de MEFs a la superficie
Yoduro de propidio (1 mg/ml)SigmaP4864marca las células muertas en los análisis de citometría de flujo
BD FACS Aria IlluBecton DickinsonA4544referido como dispositivo 1 en la Figura 4
NaviosBeckman Coulter775213referido como dispositivo 2 en la Figura 4
FloJo vX 10.0.7r2Treestarsoftware para el análisis de datos de citometría de flujo
en sondas Matrigel EDTA 0.5 M Invitrogen

Referencias

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
  4. Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
  5. Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
  6. Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
  7. Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
  9. Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
  10. Marti, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  11. Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
  12. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  13. Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
  14. Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
  15. Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
  16. Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
  17. Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
  18. Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
  19. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  21. Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
  22. Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
  23. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nat. Mater. 13 (2), 125-138 (2014).
  24. Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
  25. Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
  26. Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
  27. Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
  28. Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
  29. Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).

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