Circunscrita capsular del infarto de modelado mediante técnica photothrombotic

Resumen

Este manuscrito describe una técnica de modelado de infarto capsular. Aquí hemos utilizado una técnica photothrombotic modificado con baja intensidad de la luz después de la cartografía de destino antes de la cirugía. Usando esta técnica, hemos creado un modelo de infarto capsular circunscrita con deficiencia motora persistente.

Resumen

El reciente aumento en la tasa de prevalencia de accidente cerebrovascular en la materia blanca exige investigación específica en el campo. Sin embargo, la falta de un modelo animal pertinente para el accidente cerebrovascular de la sustancia blanca ha obstaculizado las investigaciones de investigación. Aquí, describimos un método novedoso para crear un infarto capsular circunscrito que minimiza el daño a las estructuras vecinas de materia gris. Utilizamos el rastreo neural previo a la cirugía con proteína fluorescente verde adenoasociada al virus (AAV-GFP) para identificar la organización somatotópica del área de las extremidades anteriores dentro de la cápsula interna. El ajuste de la intensidad de la luz en función de las diferentes propiedades ópticas de la materia gris y blanca contribuye a la destrucción selectiva de la materia blanca con una conservación relativa de la materia gris. El posicionamiento preciso de la interfaz óptico-neuronal permite la destrucción de toda el área de las extremidades anteriores en la cápsula interna, lo que conduce a un déficit motor marcado y persistente. Así, esta técnica produce lesiones de infarto capsular altamente replicables con un déficit motor persistente. El modelo será útil no solo para estudiar el accidente cerebrovascular de la sustancia blanca (WMS) a nivel conductual, de circuito y celular, sino también para evaluar su utilidad para el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas y de rehabilitación.

Introducción

Hasta hace poco, la "carrera de la materia gris (GMS) modelos" se han utilizado exclusivamente para comprender la fisiopatología del accidente cerebrovascular y para guiar el desarrollo de nuevos tratamientos. Sin embargo, ha habido una creciente prevalencia de accidente cerebrovascular que afecta a la sustancia blanca subcortical en individuos de edad avanzada, lo que constituye 15 - 25% de los ictus ^1,2. Numerosos estudios se han realizado en relación con el uso de modelos de carrera de la SGM, mientras que hay pocos estudios que han utilizado modelos de carrera de la sustancia blanca (WMS). La materia blanca en los roedores es sustancialmente menor que la materia blanca en los seres humanos o primates. En consecuencia, es más difícil de acceder selectivamente y destruir las regiones diana en la sustancia blanca ^3. Además, no hay herramientas eficaces se han desarrollado hasta la fecha para destruir selectivamente la medida prevista de la materia blanca de destino. Por lo tanto, ha sido la falta de modelos apropiados para el estudio de los trazos de la materia blanca.

st Animalmodelos roke a menudo se utilizan para controlar el progreso de la recuperación de motor para el desarrollo de nuevos rehabilitación y métodos terapéuticos. Es ideal para utilizar un modelo animal que exhibe un déficit neurológico a largo plazo concordante con las alteraciones anatómicas demostrado en el accidente cerebrovascular humana ^4,5. En este sentido, la rápida recuperación del déficit motor y la amplia participación del cerebro después del infarto lesioning puede no ser realista en la búsqueda de la investigación del accidente cerebrovascular. Anteriores modelos de infarto capsular han sido realizadas por la oclusión de la carótida interna o las arterias coroideas anterior y difusión de la endotelina-1 (ET-1) en la cápsula interna ^6-9. Sin embargo, oclusión de la arteria requiere una cuidadosa disección de las arterias, sino que produce una amplia área de la lesión del infarto, incluyendo la cápsula interna, sin déficit de comportamiento persistentes. Por otra parte, ET-1 no era difusa para destruir por completo el brazo posterior de la cápsula interna, y por lo tanto menos marcada o de persistir Behavioral déficit.

Un modelo de infarto photothrombotic ha sido ampliamente utilizado para generar diversos tipos de lesiones del infarto en el córtex y estructuras subcorticales ^10. La técnica incluye la administración intravenosa, seguido por la iluminación focal, lo que conduce a la agregación de plaquetas en los vasos pequeños y la generación de lesiones de infarto ^10. Photothrombotic técnica se ha utilizado ampliamente para crear lesiones GMS, mientras que rara vez se ha utilizado para generar lesiones WMS ^5,11. Para esta técnica, una combinación de Rosa de Bengala colorante y la luz de irradiación ha demostrado ser útil en la destrucción de la estructura diana, causando déficits funcionales correspondientes. El elemento clave de esta técnica es photothrombotic irradiación de luz, ya que determina el tamaño de las lesiones de infarto. Resultados de irradiación de luz en diferentes efectos en la materia gris y la materia blanca, debido a la dispersión de la luz es más de 4 veces mayor en ma blancatter en comparación con la materia gris ^12; En consecuencia, si la intensidad de la luz tiene una irradiancia suficientemente baja (<1,140 mW / ^mm2), se puede limitar la extensión a la lesión photothrombotic afecta a la medida en la sustancia blanca (es decir., Cápsula interna). Por ejemplo, la luz de mayor energía puede inducir infartos, tanto en la materia gris y blanca, sin embargo, menor energía de la luz puede inducir photothrombosis sólo en la sustancia blanca. Por otra parte, la penetración de la energía de la luz era muy limitado. Aproximadamente el 99% de la energía de la luz se pierde más allá de 1 mm de la fuente de luz ^13. Por lo tanto, se espera que los objetivos muy precisos, más baja energía la luz induce photothrombosis sólo en la sustancia blanca con una intrusión mínima de la sustancia gris vecino.

A continuación, se describe un nuevo método para crear lesiones de infarto en la zona de la extremidad anterior de la cápsula interna en los roedores. Se describe el método de identificación de la zona de la extremidad anterior de la ca internapsule, la tecnología de irradiación de luz, incluyendo el ajuste y la entrega de la luz, y la generación de una lesión del infarto. También describimos las pruebas de comportamiento utilizados para evaluar la integridad de la modelización capsular.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales del Instituto Gwangju de Ciencia y Tecnología (GIST), y todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en GIST.

1. Pasos Pre-Lesioning

1. Identificación de la Zona Extremidad anterior de la cápsula interna usando AAV-GFP
   1. Casa y manejar las ratas Sprague Dawley (~ 400 g, 11 - 13 semanas) de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales.
   2. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y electrodos utilizando un esterilizador apropiado (vapor o en un esterilizador de plasma). Utilice esterilizador de vapor a 121 ° C como ajuste de 30 min para la esterilización y 30 min para seco.
   3. Anestesiar al animal con una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (7 mg / kg) a través de una inyección intramuscular. Comprobar la profundidad de la anestesia por pellizco de la pata. Mantener la temperatura corporal a 37,5 ± 0,5 ° C a través de una almohadilla térmica bajoel cuerpo del animal.
   4. Colocar el animal en un marco estereotáxico usando una barra de soporte de la oreja y la boca.
   5. Limpiar y desinfectar la zona quirúrgica con un 70% de alcohol y solución de povidona yodada. Infiltrarse en el clorhidrato de lidocaína al 2% debajo del cuero cabelludo en la zona del cráneo incisión intención de reducir el dolor intraoperatorio.
   6. Aplicar ungüento oftálmico veterinario para prevenir la sequedad de los ojos. Coloque un paño estéril sobre el animal a los sitios operativos. Mantener todos los procedimientos en condiciones estériles.
   7. Realizar una incisión en la línea media del cráneo de 2 cm utilizando un bisturí y retraer la piel bilateral con retractores de alambre. Se seca el cráneo con hisopos de algodón y peróxido de hidrógeno al 30%.
   8. Hacer un agujero con un taladro de la pieza de mano sobre la zona de la extremidad anterior de la corteza motora (AP: 2.5 de bregma, ML: ± 2,5 de la línea media) y despejar las vías con micro-cureta para el virus de la inyección.
   9. Descongelar el AAV-GFP (2 x 10 ¹² moléculas de virus / ml) sobre hielo y de carga 1 l de lavirus en una jeringa de 10 microlitros. Coloque la jeringa en el marco estereotáctico.
   10. Mover la aguja en el orificio pre-hechos y bajar la aguja 1 mm de profundidad en la duramadre.
   11. Inyectar el virus lentamente (0,1 l / min) utilizando una alta precisión microbomba y dejar la aguja en su sitio durante otros 10 min para permitir que el virus se difunda hacia fuera.
   12. Después de limpiar el lugar de la operación con irrigación salina, asegurar la herida con sutura de nylon 3-0; liberar la rata desde el marco estereotáctico y la transfiere a una cámara de recuperación. Administrar ketoprofeno (2 mg / kg) a través de una inyección intramuscular para el control del dolor postoperatorio.
   13. Se mantiene la temperatura corporal (37 ° C) con el cojín de calefacción y administrar antibióticos de clase cefemes segunda generación (0,1%, 1 ml) a través de una inyección intramuscular y clorhidrato de lidocaína al 2% por vía subcutánea, según sea necesario. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantenerdecúbito esternal. casa sola al animal hasta la recuperación completa.
   14. Después de 2 - 3 semanas de recuperación, profundamente anestesiar la rata con una sobredosis de clorhidrato de ketamina (300 mg / kg) a través de una inyección intramuscular en el capó. Confirmar la muerte de los animales por la falta de respuesta de los pies pellizcos, el pulso y la respiración. Coloque la supina rata en el capó.
   15. Abra la cavidad abdominal a través de una "incisión en forma de Y 'para abrir la cavidad torácica. Sujete firmemente la aorta descendente con una pinza hemostática y la ruptura de la aurícula derecha del corazón de rata para el drenaje de sangre. Iniciar la perfusión en el ventrículo izquierdo del corazón con frío 1% de paraformaldehído por 5 min (10 ml / min) seguido de 4% de paraformaldehído durante 30 min (10 ml / min).
   16. Retire la cabeza de la rata de la carcasa con un par de tijeras. Hacer una incisión en la línea media del cuello a la nariz y eliminar los músculos del cuello usando tijeras o pinzas gubias de manera que el cráneo está expuesto. diseccionar suavemente los huesos del cráneo y duras a cabo desde el cerebro.
   17. Extraer el cerebro y colocar el cerebro de rata en un tubo cónico de 50 ml lleno con 4% de paraformaldehído durante la noche. Al día siguiente, lavar el cerebro con 1x PBS 3 veces y lo coloca en una solución de sacarosa al 30%.
   18. Después de que el cerebro se hunde completamente a la parte inferior de la solución de sacarosa al 30%, coloque el cerebro en el criomolde con compuesto OCT a -20 ° C en cryotome. Cortar el cerebro en el plano coronal a un espesor de 40 micras y un intervalo de 200 micras.
   19. Realizar tinción inmunohistoquímica GFP usando el método de deslizamiento ^14. Aplicar el anticuerpo primario (1: 200 de anti-proteína fluorescente verde, fracción IgG de conejo) para las secciones de cerebro durante la noche a 4 ° C. El 2 ^de días, se lava con 1% de fosfato de solución salina tamponada con (PBST) solución de Tween-20 3 veces y aplicar el anticuerpo secundario (1: 500 de IgG de cabra anti-conejo (H + L)) durante 1 hora. Enjuague el portaobjetos con 1% de PBST 3 veces. Coloque la cubierta de vidrio en la sección de cerebro.
   20. El uso de un microscopio de fluorescencia (longitud de onda de excitación470 nm, longitud de onda de emisión de 525 nm, un aumento de 5X), observar el AAV-GFP axones transducidas en la cápsula interna. Comparación de las ubicaciones de los axones transducidas con el Atlas de cerebro de rata ¹⁵ para determinar las coordenadas estereotácticas de los axones transducidas
2. El ajuste de la intensidad de luz adecuada para capsular del infarto Modelado pre-lesioning
   1. La construcción de la interfaz de los nervios óptico
      1. Cortar una longitud apropiada (4 cm) de una aguja espinal de calibre 27 con un estilete en el interior con una broca de corte.
         NOTA: El corte puede comprimir y aplastar la punta de la aguja espinal; retirar el estilete y pulir la punta de la aguja espinal para eliminar la porción aplastada de la aguja espinal y mantener el calibre interior de la aguja espinal.
      2. Tira de una longitud apropiada (10 cm) de la camisa de la fibra óptica (125 micras con un núcleo de 62,5 micras) de cable de conexión de un lado.
      3. Inserte el fi óptica unjackedBER en el tubo de metal (diámetro externo: 3,8 mm, diámetro interno: 3,3 mm y longitud: 17 mm), que luego se sujeta alrededor de la fibra. El tubo de metal es útil para llenar el espacio entre la fibra óptica y el cubo de la aguja espinal. Sujetar el inferior media del tubo de metal con un prensador dos veces.
      4. Aplicar el epoxi curable por calor en la fibra óptica y insertar la fibra óptica dentro de la aguja espinal. Aplicar un epoxi adicional para el espacio vacío en el centro. Curar la resina epoxi durante 20 min a 100 ° C para la fijación estable.
      5. Escindir la fibra óptica que sobresale hacia fuera de la aguja espinal y pulir la fibra óptica en la punta de la aguja espinal mediante lapeado diamante (pulido) hojas.
      6. Conecte la parte del conector FC / PC del cable de conexión al acoplador del sistema de láser verde y medir la intensidad de la luz desde la punta de la fibra óptica utilizando la potencia óptica digital y medidor de energía.

2. PhotothromBotic infarto en lesiones por la cápsula interna

1. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y electrodos utilizando un esterilizador apropiado (vapor o en un esterilizador de plasma). Utilice esterilizador de vapor a 121 ° C como ajuste de 30 min para la esterilización y 30 min para seco.
2. Anestesiar al animal (~ 400 g, 11 - 13 semanas) con una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (7 mg / kg) a través de una inyección intramuscular. Comprobar la profundidad de la anestesia por pellizco de la pata. Se mantiene la temperatura corporal a 37,5 ± 0,5 ° C a través de una almohadilla de calentamiento en el cuerpo del animal.
3. Colocar el animal en un marco estereotáxico usando una barra de soporte de la oreja y la boca.
4. Limpiar y desinfectar la zona quirúrgica con un 70% de alcohol y solución de povidona yodada. Infiltrarse en el clorhidrato de lidocaína al 2% debajo del cuero cabelludo en la zona del cráneo incisión intención de reducir el dolor intraoperatorio. Aplicar ungüento oftálmico veterinario para prevenir la sequedad de los ojos.
5. Aplicar un campo estéril sobre la unatremo y exponer los sitios operativos. Mantener todos los procedimientos en condiciones estériles.
6. Realizar una incisión en la línea media del cráneo de 2 cm y retraer la piel bilateral con retractores de alambre. Se seca el cráneo con permutas de algodón y peróxido de hidrógeno.
7. Ajustar la altura de la abrazadera de la nariz hasta el bregma y lambda están alineados en el mismo nivel. Paso crítico: Esta alineación es crítica para acercarse correctamente una estructura más profunda, como en la realización de una lesión del infarto en la cápsula interna en el experimento principal.
8. Hacer un agujero (diámetro: 2 mm; PA: -2,04 desde bregma; ML: ± 3,0 de la línea media) usando un taladro para inducir photothrombosis.
9. Pulir y limpiar la punta de la fibra óptica de la interfaz óptica. Fijar la ONI al marco estereotáxico sin doblar. Compruebe la punta de la ONI y limpiarla con claridad antes y después de la inserción de la interfaz óptica.
10. Medir la intensidad del láser desde la punta de la fibra óptica antes de la inserción de la optical interfaz al sitio diana del cerebro de rata. Ajustar la intensidad del láser de 3,5 mW, según lo confirmado por los pasos previos a la cirugía, en la punta de la fibra óptica.
11. Inserte la ONI en el área de orientación de la cápsula interna (-7,8 mm confirmados de la etapa previa a la cirugía) a través del agujero de perforación.
12. Mantener la temperatura corporal a 37,5 ± 0,5 ° C durante photothrombosis. Una temperatura corporal más baja no puede producir el grado esperado de miocardio. Inyectar Rose Bengal (2 ml / kg) a través de la vena de la cola.
13. Encienda el láser verde de 532 nm durante 90 s 1 min después de la inyección de Rosa de Bengala. Después de la irradiación, retire con cuidado la ONI desde el cerebro. Después de limpiar el lugar de la operación, asegurar la herida asegurar la herida con sutura de nylon 3-0; liberar la rata desde el marco estereotáctico y la transfiere a una cámara de recuperación.
14. Para el grupo de operación simulada (SOG), lleve a cabo un procedimiento de lesión de decisiones idénticas, excepto por la inyección de solución salina (0,2 ml / 100 g) en lugar de Rose-Bengala.
15. Se mantiene la temperatura corporal (37 ° C) con el cojín de calefacción después de la cirugía y administrar antibióticos de cefalosporina (segunda generación, 0,1%, 1 ml) a través de una inyección intramuscular. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devolver los animales post-quirúrgicos para la jaula ocupada por otros animales hasta que esté completamente recuperado.
    NOTA: experimento preliminar se realizó en los mismos procedimientos para encontrar la intensidad de la luz óptima desde 1 mW a 5 mW y el procedimiento puede ser necesario para adquirir el grado satisfactorio de lesión en diferentes condiciones.

3. Evaluación de las lesiones por infarto capsular

1. Las pruebas de comportamiento y los animales agrupación
   1. Realizar sola pastilla llegar a tareas como se describe por Whishaw et al. ¹⁴ para evaluar el déficit motor de la extremidad anterior todos los días durante 1 semana después del modelado de un derrame cerebral. Realizar una sola tarea de pellets llegar(SPRT) en animales con restricción alimenticia (90% del peso corporal control) utilizando Plexiglas transparente (30 x 15 x 35 cm de altura) con un 1 cm de anchura de hendidura y un útil de los alimentos en la parte delantera de la mitad de la pared frontal.
   2. Coloque una pastilla en el banco de alimentos de forma oblicua contralateral a la extremidad anterior preferida. Administrar 20 gránulos por sesión durante 3 semanas.
      NOTA: Un número exitosa de SPRT se define como un alcance en el que el animal agarra una bola de comida y la pone en la boca sin que se caiga.
   3. Calcular la puntuación como porcentaje de tramos de éxito, que se define por la siguiente fórmula:
      
      NOTA: Dividimos los animales en 3 grupos: el grupo de operación simulada (SOG), grupo de recuperación moderada (MRG), y la mala grupo de recuperación (PRG). Si la puntuación SPRT posterior al accidente cerebrovascular> 50%, clasificamos a las ratas como el MRG, que indica la presencia de una lesión importante, pero no la destrucción completa de la target. Si la puntuación SPRT posterior al accidente cerebrovascular es <50% en comparación con el marcador SPRT carrera previa, clasificamos el grupo como PRG, lo que indica lesioning completa en el objetivo.
2. La confirmación de un infarto lesiones por neurohistológica
   1. Realizar la perfusión cardiaca con 4% de paraformaldehído como se describe anteriormente. Después de que el cerebro se hunde completamente en la solución de sacarosa al 30%, realice seccionamiento coronal a un espesor de 10 micras y un intervalo de 200 micras usando un microtomo o cryotome ^4.
   2. Mancha con H & E, Nissl, Luxol Fast Blue-PAS, Neurofilamentos proteína-L o glial tinción de la proteína ácida fibrilar y observar los hallazgos histológicos para determinar la intensidad óptima de la luz que puede cubrir todo el ancho de la cápsula interna en el área objetivo de observar la tinción ^4,17.
   3. El uso de software ImageJ, medir el volumen de la zona infartada photothrombotic de la cápsula interna en los toboganes del cerebro.
      1. Para medir el volumen del área infartada, iniciar el software 'ImageJ'. Para abrir los archivos para ser apilados, seleccione 'Imagen a pilas' ( 'Imagen' → 'pilas' → 'Imagen a pilas'). Editar nombre de archivo y seleccione 'establecer la escala "(" Analizar "→" Establecer la Escala') para modificar la escala.
      2. En 'plugins', seleccione 'Medir las pilas' para calcular el volumen o área de imágenes. Introduzca el intervalo de distancia de 2 imágenes en 'Slice Spacing ". Hacer un dibujo de la ROI (región de interés) de todas las imágenes y haga clic en "Medir".
         NOTA: El software 'ImageJ' calcula automáticamente el área y volumen de cada imagen y el volumen total de ellos.

Resultados

El método que aquí se presenta tiene por objeto crear un infarto capsular circunscrita con un déficit motor persistente. Por lo tanto, es fundamental para determinar correctamente el objetivo dentro de la cápsula interna en la etapa de pre-cirugía. El mapeo somatotopic de fibras piramidales en la cápsula interna no ha sido resuelto hasta la fecha. Para identificar correctamente el objetivo dentro de la cápsula interna, el área de la extremidad anterior deberán estar delimitadas. Una inye...

Discusión

El modelo de infarto capsular presentado aquí demuestra una lesión diana con deficiencia motora marcada y persistente en la función de la extremidad anterior. Los modelos anteriores de un derrame cerebral subcortical capsular han demostrado un grado insuficiente de deterioro motor y una rápida ^6,8,9 proceso de recuperación. En este sentido, este modelo se asemeja a los casos de infarto capsular clínicos que presentan deterioro funcional a largo plazo.

Los pasos más críticos en el ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
controlador de temperatura DC	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.
Instrumentos estereotáxicos digitales	STOELTING CO.	51900
Estimulador eléctrico	CyberMedic Corp.	EMGFES 2000
Epoxi	Productos de fibra de precisión, INC.	PFP-353ND1	Relación de mezcla: 10 (A): 1 (endurecedor B) por peso  Programa de curado: 1 min @150 ° C 2 ~ 5 min @120 ° C 5 ~ 10 min @100 ° C 15 ~ 30 min @80 °
C Escriba de fibra óptica	THORLABS, INC	S90R Cable de
conexión de fibra	KOREA OPTRON Corp.		Diámetro exterior: 3 mm Ø 200 y micro; m 0.39 NA FC/PC-FC/PC Fuente
alimentación láser	CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD.	MGL-FN-532nm-200mW-14010196
Anillo de engarzado	DAWOOTECH CO., LTD.		Longitud: 19 mm Diámetro interior: 3 mm Diámetro exterior: 3,8 mm Material:
Controlador de bomba de jeringa SUS Micro4-micro	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	95100
Medidor de potencia óptica	THOLABS, INC	PM100D
Hoja de lapeado (pulido) de diamante	THORLABS, INC	LF3D	Grano : 3 y micro; m
Chapa de diamante lapeada (pulido)	THORLABS, INC	LF6D	Grano : 6 y micro; m
Rosa de Bengala	SIGMA-ALDRICH CO. LLC.	330000
Aguja para anestesia raquídea con punta de lápiz (Aguja espinal)	B.BRAUN MELSUNGEN AG	4502027	Tamaño: 27 G Longitud: 88 mm Aguja: 0,40 mm
Papel de lija impermeable	DEERFOS CO., LTD	CC261	Grano : 1,000 y micro; m
Nanofil 10  y micro; l jeringa	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	NANOFIL
Nanofil 33  Aguja G BVLD	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	Virus NF33BV-GFP
	UNC Vector Core	AAV2-CamKIIa-eYFP	2 x 1012 moléculas de virus/ml
Proteína fluorescente anti-verde, fracción IgG de conejo	Life Technologies, INC	A11122	anticuerpo primario (1:200)
Cabra Anti-Conejo IgG (H + L)	Life Technologies, INC	A11034	secundario anticuerpo (1:500)
Ceftezol	GUJU Pharma CO.,LTD.	A27802741	0,1%, 1 ml
de inyección de clorhidrato de lidocaína	JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD.	A04900271	2%, 1 ml
Taladro de mano	Seshin
Medidor digital de potencia y energía	óptica THORLABS, INC	PM100D
Ketoprofen	UNIBIOTech