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Artículo de método

Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

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DOI:

10.3791/53282

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17 de febrero de 2016

 ,  ,  , 
1Cell Division and Cancer Group, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO), 2Centro de Investigaciones Biomédicas en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), 3Departmento de Biologìa Celular, Universidad de Valencia, 4Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona (IBUB), 5Department of Molecular and Translational Medicine, Fibroblast Reprogramming Unit, University of Brescia

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un procedimiento basado en el uso de partículas lentivirales para la modificación genética a largo plazo de células madre neurales y/o sus células ependimarias adyacentes en el nicho neurogénico ventricular-subventricular adulto que permite el análisis por separado de los efectos autónomos y no autónomos, dependientes del nicho, sobre las células madre neurales.

Resumen

Relativamente células madre somáticas quiescentes apoyan la renovación celular de toda la vida en la mayoría de los tejidos adultos. Las células madre neurales en el cerebro adulto de mamíferos están restringidos a dos nichos neurogénicos específicos: la zona subgranular del giro dentado del hipocampo y la zona ventricular-subventricular (V-SVZ; también llamada zona subependimario o ZEE) en las paredes de los laterales ventrículos. El desarrollo de estrategias de transferencia génica in vivo para las poblaciones de células madre adultas (es decir, las del cerebro de los mamíferos) que resulta en la expresión a largo plazo de los transgenes deseados en las células madre y su progenie derivada es una herramienta crucial en la investigación biomédica y biotecnológica actual. Aquí, se presenta un método directo in vivo para la modificación genética estable de células de ratón adulto V-SVZ que se aprovecha de la infección de ciclo independiente de células por LVs y la citoarquitectura altamente especializado del nicho V-SVZ. En concreto, el protocolo actual implicaes la inyección de LVs vacíos (control) o LV codifican casetes de expresión de transgén específica en cualquiera de la propia V-SVZ, para la dirección in vivo de todos los tipos de células en el nicho, o en el lumen del ventrículo lateral, para la focalización de ependimarias Sólo las células. Los casetes de expresión se integran en el genoma de las células transducidas y las proteínas fluorescentes, también codificadas por el LVs, permitir la detección de las células transducidas para el análisis de células de efectos autónomos y no autónomos, de nicho dependiente en las células y se marcaron su progenie.

Introducción

La zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), en las paredes del ventrículo lateral hacia el cuerpo estriado, es una región germinal muy activo en el que un proceso continuo de replicación de células progenitoras y de diferenciación como resultado la producción persistente del bulbo olfatorio (OB interneuronas) y oligodendrocitos del cuerpo calloso 1. La generación de toda la vida de estas células parece estar apoyada por la presencia en esta región de las células madre neurales (NSC, también llamadas células B1), que expresan la proteína ácida glial fibrilar antígeno de los astrocitos (GFAP) y marcadores de células tales como nestina, Id1 madre y Sox2 2. Que expresan GFAP células B1 generan células (TAP) (células C), que expresan factores de transcripción Dlx2 tránsito amplificar progenitora (distal-less homeobox 2) y Ascl1 (mamíferos achaete-Schute homólogo 1) y dividir rápidamente un par de veces antes de que den origen a neuroblastos migran (células a) o oligodendroblasts 3. Recién generada prolifeneuroblastos rativa migran hacia delante, formando la corriente migratoria rostral (RMS) para el OB, en la que se integran en el granulares y capas glomerulares como interneuronas inhibitorias diferenciadas. Migración de oligodendroblasts jóvenes se mueven a la CC, donde se convierten en células NG2 positivo inmaduras que siguen dividiendo a nivel local o diferenciarse en oligodendrocitos maduros myelinating 1,4.

células B1, que derivan de las células gliales radiales fetales, conservan la morfología alargada y polarizada de sus predecesores y exhiben una relación altamente especializada con su nicho. Ellos abarcan entre el epéndimo, que se alinea el ventrículo y la red de vasos sanguíneos que irrigan el nicho V-SVZ. El pequeño proceso apical de las células se intercala entre B1 ependymocytes multiciliated y termina en un solo cilio primario no móvil, que en los procesos basales se extiende largas distancias para abordar el plexo vascular plana que irriga este nicho de final en el basal lámina de los capilares del plexo 2,5-8.

La forma más fiable para distinguir B1-NSC a partir de astrocitos no neurogénicos, que también son GFAP +, en el nicho intacta V-SVZ se basa en todo el montaje de preparaciones de la pared lateral del ventrículo y su análisis por microscopía confocal 3-D después de inmunotinción para GFAP para etiquetar el proceso apical B1-NSC delgada, β-catenina para delinear las membranas celulares, y, o bien γ-tubulina como un marcador de cuerpos basales ciliar o acetilado α-tubulina para etiquetar la extensión de cada cilio 5,8. Las observaciones de estos enteros monturas de la superficie ventricular han indicado que las células ependimales B1 y están dispuestas en "molinetes" 5, en el que los procesos apicales uniciliated de uno o varios GFAP + células B1 están rodeadas por una roseta de células ependimarias multiciliated.

La morfología característica de células B1 se correlaciona con la evidencia experimental indicating que los vasos sanguíneos células endoteliales y ventriculares / líquido cefalorraquídeo (LCR) constituyen las fuentes reguladas de señales solubles que actúan sobre células madre neurales 2,6,9-11. En la superficie ventricular, y las interacciones homotipica heterotípicos apico-lateral con células ependimarias y B1 incluir uniones estrechas y uniones adherentes 5,12. Por otra parte, las moléculas de adhesión implicadas en los complejos de unión entre las células B1 y ependimarias, tales como N-cadherina y V-CAM, se ha demostrado que regular no sólo el posicionamiento altamente organizada de B1 en el nicho de V-SVZ, sino también su quiescencia 12 , 13. La monocapa de células ependimarias-B1 parece actuar como una barrera de difusión que permite el flujo regulado de agua y las moléculas pequeñas de la CSF, pero restringiendo el paso intercelular de proteínas grandes 10,11. La evidencia experimental indica que la celda B1 cilio apical posición única podría desempeñar un papel como un sensor de polipéptidos presentes en el LCR 2 de señalización,5-7. Las células ependimarias son, per se, también una fuente de señales solubles y unidas a la membrana con un papel en la regulación del comportamiento NSC 14,15.

Nucleósidos trazables, tales como bromo-desoxiuridina (BrdU), o retrovirus han sido ampliamente utilizados para marcar las células progenitoras, incluyendo NSCs, in vivo. Sin embargo, estos métodos no son óptimas para el rastreo destino a largo plazo ya que las señales BrdU diluido a través de repetidas divisiones celulares y retrovirus parecen estar dirigidas preferentemente de forma transitoria células debido a su requerimiento de la proliferación celular para la transducción 16,17 amplificar. Para examinar NSC fisiología in vivo, incluyendo las interacciones con los componentes de nicho, es crucial establecer un método para etiquetar y rastrear células rara vez se dividen, como B1-NSCs son en gran parte de reposo y sus células ependimarias vecinos nunca se dividen en condiciones fisiológicas 3. Aquí, se muestra que los vectores lentiviral (LV) permiten una marca de genes de alta eficienciaING y modificación a largo plazo de NSCs adultas y que no se dividen las células ependimales, debido más razonablemente a su capacidad para transducir y para integrarse en el genoma de las células diana de una manera independiente del ciclo celular. Por otra parte, se muestra cómo la vía de administración y virales ayuda título para transducir específicamente a las células ependimarias, pero no los linfocitos B1 permitiendo así que el análisis de nichos dependiente, efectos ependimarias en células madre neurales.

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Protocolo

DECLARACIÓN DE ÉTICA: Este protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de la Universidad de Valencia conforme a la Directiva Europea 2010/63 / UE.

1. Generación de LV para estudios in vivo de marcado (véase la figura 1a)

PRECAUCIÓN: El procedimiento descrito en este documento es de bioseguridad de nivel 2, por lo tanto, realizar todos los procedimientos siguientes en una campana de bioseguridad. Asegurarse que el personal de investigación son suficiente formación y experiencia en todos los procedimientos. Use equipo de protección personal, incluyendo bata, guantes dobles y protección adecuada para los ojos. Por último, la descontaminación a fondo todas las herramientas y las superficies que podrían haber estado en contacto con los virus de acuerdo con las prácticas de instalación de desinfección autorizados (frotando con etanol al 70%, el 10% de lejía y / o tratamiento en autoclave).

  1. La producción de LV embrionarias humanas en células 293T de riñón
    1. Iniciar este protocolo mediante la preparación de ADN puro para la transfección. Preparar y purificar cada plásmido por doble graduado de CsClient centrifugación u otros métodos de columnas disponibles en el mercado que producen ADN libre de endotoxinas. En este protocolo se ha utilizado el plásmido vector de transferencia PRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre. Recomendadas plásmidos de embalaje son fundamentales pMDLg / pRRE y pRSV.REV y sobre del plásmido pMD2G 13,18,19.
    2. Veinticuatro horas antes de la transfección, la placa de 5 x 10 6 células 293T en Modificado de Iscove Medio (IMDM) de Dulbecco (véase la Tabla de Materiales) en una placa de plástico 10 cm con el fin de obtener un cultivo de aproximadamente 1.4 a 1.3 confluente para transfección. Incubar a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de 5 a 7% de CO 2.
    3. Sustituir el medio con medio fresco 2 horas antes de la transfección.
    4. En una mezcla estéril tubo de microcentrífuga de 1,5 ml 10 g de plásmido vector de transferencia (que contiene el ADNc del transgén o el shRNA para ser entregados) con 2,5 g de la pRSV.REV y 5 g de los plásmidos de embalaje pMDLg / pRRE, y 3,5 y #181; g del plásmido de la cubierta pMD2G. Compensar la solución plásmido a un volumen final de 450 l con tampón TE 0,1x (véase la Tabla de Materiales) / dH 2 0 (2: 1). A continuación, añadir 50 l de 2,5 M de CaCl2.
    5. Formar el precipitado por la adición gota a gota de 500 l de la solución salina tamponada con Hepes 2x (HBS, véase la Tabla de Materiales) solución a la mezcla de 500 l de ADN-TE-CaCl 2 mientras vórtex a toda velocidad.
    6. Añadir el precipitado a las células 293T inmediatamente. Hacer girar suavemente la placa para mezclar. Volver a las células a la incubadora y cambiar el medio 14 a 16 horas después de la transfección.
    7. Recoger los sobrenadantes de las células 30 horas después de cambiar los medios de comunicación. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de nitrocelulosa de 0,22 micras de poro y proceder a la concentración.
  2. Concentración de LVs
    1. Se concentra el medio acondicionado por ultracentrifugación a 50000 xg (19000 rpm con SW-28 rotor de ultracentrífuga) de 2hr a temperatura ambiente (RT) en un tubo de rotor cónico transparente 30 ml de polipropileno.
      Nota: Use adaptadores de ultracentrífuga para tubos de rotores cónicos (ver tabla de Materiales).
    2. Desechar los sobrenadantes por decantación y resuspender los gránulos en un volumen pequeño (200 l o menos, si se lleva a cabo sólo una centrifugación) de tampón fosfato salino (PBS; véase la Tabla de Materiales). A continuación pipetear arriba y abajo unas 20 veces.
    3. Reunir las suspensiones y se concentra de nuevo por ultracentrifugación, también a 50.000 x g (23.000 rpm con SW-55 rotor de ultracentrífuga) durante 2 horas a temperatura ambiente. Utilice tubos de rotores de polipropileno transparente con un volumen nominal de 5 ml (véase la Tabla de Materiales).
    4. Resuspender el sedimento final en un volumen muy pequeño (1/500 o 1 / 1.000 del volumen de partida de medio) de PBS estéril y agitar en una rueda giratoria durante 1 hora a RT. Dividir en alícuotas pequeñas (5-20 l) yfellos Reeze a -80 ° C.
    5. Tratar a todos los tubos vacíos con lejía al 10% antes de desechar.
  3. La valoración lentiviral usando citometría de flujo
    1. El día anterior, la placa de 5 x 10 4 células HeLa por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos en 2 ml de medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) (véase la Tabla de Materiales). Incubar a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de 5 a 7% de CO2 durante 24 hr.
    2. En el día de la valoración, descongelar una alícuota de la solución madre viral y preparar diluciones seriadas, de 10 -3-10 -8, en DMEM.
      1. Para ello, tomar una placa de 24 pocillos y añadir 2 ml de DMEM al primer pocillo y 1,8 ml de los siguientes pozos. A continuación, añadir a la primera y 2 l de la solución madre viral concentrada (a una dilución final de 1: 1.000 o 10 -3).
      2. Después de pipetear varias veces para mezclar la solución, la punta del cambio y la transferencia de 200 l de la dilución 10 -3al segundo también. Repita el procedimiento en serie en los siguientes pozos hasta que se realiza la dilución 10 -8.
    3. Tome células HeLa chapadas el día anterior de la incubadora. Retirar con cuidado medio de los pozos. Añadir 1 ml de cada dilución viral junto con 1 l de 8 mg / ml de bromuro de hexadimetrina a los pocillos que contienen células HeLa. Hacer girar suavemente la placa para mezclar.
      Nota: Se añadió bromuro de hexadimetrina para aumentar la adsorción del virus a las células en cultivo.
    4. Volver a las células a la incubadora y permitir que la infección de proceder durante 72 horas. Después de eso, se elimina el medio, se lavan las células una vez con PBS y añadir 200 l de tripsina-EDTA (véase la Tabla de Materiales) a cada pocillo.
    5. Después de 5 min a 37 ° C, añadir 2 ml de PBS a cada pocillo y las células de la cosecha en tubos de citometría de flujo.
    6. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a RT y aspirar el sobrenadante.
    7. Resuspender el sedimento con 1 ml de soluti fijaciónen (electrón formaldehído grado microscopía de 1% y suero bovino fetal al 2% en PBS), a continuación, vórtice los tubos.
    8. Analizar las células en un citómetro de flujo utilizando un 488 nm de argón-ionlaser a 15 mW de potencia.
    9. Configurar el instrumento con la configuración estándar: la dispersión frontal (FS), dispersión lateral (SS), y la fluorescencia de GFP (525/40 nm). Seleccione compuerta población de células en una trama FS vs SS punto de excluir a los agregados de células y los desechos. Recoger fluorescencia en escala logarítmica. Calcular el número de células GFP + en cada muestra.
    10. Calcular título de vector utilizando la siguiente fórmula:% de GFP + / 100 x número de células infectadas x factor de dilución (DF) = unidades de transducción (UT) / ml.

figure-protocol-1
Figura 1: Representación esquemática de las diferentes partes del procedimiento (a) de la Parte 1 de t.él protocolo: generación de LVs para estudios de marcación in vivo, a partir de la transfección de células HEK293T con plásmidos apropiados para generar los LVs a la determinación del título de virus mediante citometría de flujo utilizando la fórmula indicada. Los nombres de los plásmidos y los rotores de centrifugación se indican. (B y c) de la Parte 2 del Protocolo: inyección estereotáxica de LVs. "B" representa un ejemplo de una escala Vernier, un dispositivo que es parte de los instrumentos de estereotáxico y sirve para mediciones de finos. Como ejemplo, las flechas indican 4.23 cm. Una escala Vernier se utiliza para determinar las coordenadas en el antero-posterior (AP), medio-lateral (ML), y el eje dorso-ventral (DV) como se muestra en una vista superior (izquierda) y de una sección sagital (derecha ) del cerebro. "C" indica la posición del bregma como la intersección entre las suturas sagital y coronal. LVs se inyecta usando una jeringa. (D) los dibujos esquemáticos que muestran cómo el cerebro is procesada para el análisis. Los dos hemisferios se dividen y cada uno se divide en dos bloques. Bloquear "a", que contiene los OBs, se produce mediante un corte coronal a nivel AP inmediatamente posterior a la unión OB con el telencéfalo (bregma 2,46 mm; ver Paxinos' Atlas para una referencia). Bloque "B" es producido por dos cortes coronales, una en el nivel inmediatamente anterior al aspecto más rostral del cuerpo calloso (bregma 1,7 mm) y una segunda a nivel de la unión de los dos ventrículos laterales (bregma -0,22 mm). GL, la capa glomerular; GCL, capa de células granulares; st, el cuerpo estriado; cc, cuerpo calloso; ac, comisura anterior; lv, ventrículo lateral.

2. estereotáxica La inyección de LV en el / borde estriado V-SVZ o en el ventrículo lateral (véase la figura 1b)

  1. Preparación
    1. Esterilizar una jeringa capacidad de 5 l con una aguja de calibre 33 por la pulverización hacia abajo el cuerpo y aguja con 70% de etanol con el émbolosacó todo el camino. Repetidamente aspirar etanol a partir de un tubo de 1.5 ml y expulsar todo el camino a cabo varias veces, y enjuagar la jeringa a fondo con agua estéril después. Coloque la jeringa en forma segura a un lado de la campana de cultivo y deje que se seque.
    2. Preparar un recipiente de residuos biopeligrosos con 10% de lejía a un volumen adecuado para la inmersión de todos los residuos de este procedimiento (generalmente 200 ml en un recipiente de 500 ml).
    3. Preparar y precalentar una cama de agua C 37 ° llenando una bolsa de plástico sellable con agua y calentar a 37 ° C. Esto permitirá que los ratones que se recuperan después de la inyección.
    4. Eliminar stocks virales de -80 ° C almacenamiento en el congelador 1 hr antes de comenzar las inyecciones y colocar el vial en una rueda giratoria a temperatura ambiente. Después de la descongelación, mantener la población viral en hielo durante la época de las inyecciones. Antes de la inyección estereotáxica de LV, diluir los stocks virales concentradas a 10 6 TU / l usando PBS en la campana de cultivo.
    5. Desinfectar el área seleccionada para realizar la cirugía con un 70% de etanol.
  2. La microinyección de LV
    1. Seleccionar y esterilizar instrumentos necesarios para la cirugía (bisturí, taladro, pinzas y pequeñas).
    2. Anestesiar a un ratón de 6-8 semanas de edad por vía intraperitoneal (ip) inyección de una mezcla de veterinaria-supervisado de ketamina y medetomidina. Pesar cada animal y la dosis cada una con 50 a 75 mg de ketamina y 0,5 a 1 mg medetomidina por kg de peso corporal del ratón (alrededor de 100 a 125 l de la ketamina / medetomidina solución por ratón de trabajo).
    3. Evaluar el plano anestésico apretando los dedos del pie, la cola o el oído y la garantía de que el animal no muestra ninguna reacción.
    4. Una vez que se anestesia el ratón, inyecta por vía subcutánea butorfanol a una dosis final de 0,4-0,5 mg por kg de peso del ratón para minimizar el dolor post-quirúrgico.
    5. Afeitar el área entre las orejas y la desinfección de la piel utilizando un yodóforo tal como yodopovidona o 70% de etanol. Limpiar con un algodón estérilaplicadores -tipped. Tenga cuidado de no mojar en exceso el animal ya que esto puede agravar la hipotermia.
    6. Colocar el animal en posición boca abajo en un marco estereotáxico y fijar cuidadosamente el cabezal con las barras de oído y el apoyo para el paladar del aparato. Mantenga el ratón con un juego de almohadillas de calentamiento a 37 ° C y aplicar lubricante oftálmica para los ojos.
    7. Hacer una incisión de 1 cm de largo en la piel de la cabeza longitudinalmente con un bisturí, y retraer con suavidad la piel para exponer el cráneo con unas pinzas finas.
    8. Con cuidado, limpie la superficie del hueso con un aplicador con punta de algodón estéril. Limpiar el hueso del cráneo expuesta de cualquier tejido restante.
    9. El montaje de jeringa esterilizada en el dispositivo estereotáctica utilizando el soporte de jeringa.
    10. Mover eje del soporte de jeringa x, y y z hasta que la punta de la aguja de la jeringa se coloca en el bregma, el punto de conjunción donde la sutura sagital (longitudinal y medial) se perpendicularmente cortada por la sutura coronal (Figure 1b). Asegúrese de que la posición "cero" del eje dorso-ventral (DV) se encuentra en la superficie del cráneo al bregma.
    11. Mover la jeringa para las coordenadas X e Y de destino (véase la Tabla 1 y la Figura 1b).
Región de inyección coordenadas
Antero-posterior (AP) Medio-lateral (ML) Dorso-ventral (DV)
SEZ / borde estriado +0,6 mm +1,2 mm -3,0 mm
Ventrículo lateral -0.3 mm +1,0 mm -2.6 mm

Tabla 1: estereotáxica coordenadas de la inproyecciones. Para el AP y el eje ML, coordenadas X e Y se dan como una distancia (en mm) del bregma. "-" Indica "hacia la parte posterior". Para el DV coordenadas "cero" es la superficie del cráneo en el punto bregma y DV coordenadas indican la distancia (en mm) por debajo de este punto.

  1. Anotar la x, y, z las coordenadas de destino en la escala Vernier con el fin de ser capaz de volver a la zona de inyección más adelante. Marcar el hueso en las coordenadas X e Y usando un rotulador quirúrgico.
  2. Mover la jeringa fuera de la zona de trabajo.
  3. Usando un taladro eléctrico a hacer un agujero en el cráneo con cuidado de no dañar el cerebro. No perfore la superficie pial ya que esto puede dañar la superficie del cerebro.
  4. Cargar la jeringa con 1 l de la solución viral 10 6 TU / l. Use un medidor 33 de aguja afilada y biselada cuya punta tiene un ángulo de 10-12 °. Coloque la aguja de la jeringa en una ang 90 °LE con respecto a la superficie del cerebro.
  5. Mover la jeringa de nuevo al sitio de la inyección y moverlo hacia abajo hasta que la punta toque la superficie pial.
  6. Penetrar en el cerebro con la jeringa a la coordenada z en el eje DV.
  7. liberar lentamente la suspensión viral, a una velocidad de 0,2 l / min, con el fin de minimizar el daño al tejido cerebral debido a la presión excesiva de líquidos.
  8. Espere 5-10 min para minimizar el reflujo de la suspensión viral y luego retraer la jeringa muy lentamente. Seque cualquier exceso de líquido que puede aparecer en la superficie como resultado de la retracción de la jeringa usando un laboratorio de limpiar y colocarlo inmediatamente en el contenedor de residuos de bioseguridad que contiene blanqueador.
  9. Llevar al animal fuera del conjunto estereotáxica, colocarlo sobre una almohadilla caliente, y cerrar la herida utilizando adhesivo para la piel. Revertir la sedación usando 0,1-1,0 mg / kg de peso corporal atipamezol.
  10. Se inyecta por vía subcutánea Bupenorphrine a una dosis final de 0,1 mg por kg de peso del ratón cada 12 horas,comenzando 4 horas después de la administración del analgésico corta butorfanol duradera.
  11. Colocar el animal en una jaula de individualizada con una almohadilla caliente y vigilar de cerca hasta que el ratón se recupera de la anestesia. Coloque una bolsa de hidrogel en la jaula para ayudar al hidrato de animales después de la recuperación.
  12. Disponer de todos los residuos bio-contaminados en la eliminación del blanqueo de riesgo biológico líquido. Limpiar la jeringa mediante aspiración y expulsión de etanol y enjuague con agua. Desinfectar el área, el conjunto estereotáxica y el material quirúrgico que se ha utilizado con lejía y un 70% de etanol.
  13. Mantener los ratones inyectados aislados en la sala de bioseguridad de nivel 2 durante 24-48 horas después de lo cual se pueden transferir a una instalación convencional de vivienda

3. Análisis histológico

  1. Perfusión, la recogida de tejidos, y seccionamiento
    1. Profundamente anestesiar a los ratones con una mezcla de veterinaria-supervisado de medetomidina y ketamina (evaluar el plan anestésico pellizcando la toes, la cola o el oído), como se ha descrito antes.
    2. Transcardially perfundir los ratones con 25 ml de solución salina seguido de 75 ml de 4% PFA en PB a la misma velocidad 17.
    3. Extraer el cerebro y post-solucionarlo sumergiéndolo en al menos 10 veces su volumen de frío 4% PFA en PB para 1-16 hr (aumento de los tiempos posteriores a la fijación pueden disminuir la inmunorreactividad de algunos antígenos). Lavar a fondo las PFA restante con PB.
    4. Cortar el cerebro siguiendo las indicaciones de la figura 1d y pegar el bloque resultante al titular de un vibratome utilizando cianoacrilato.
    5. Recoger 30 secciones coronales seriadas micras de espesor en un vibrátomo. Almacenar los cortes de cerebro en placas de 24 pocillos múltiples con PB a 4 ° C. Para evitar la contaminación, 0,05% de azida de sodio se puede añadir a la solución de PB.
  2. La inmunohistoquímica
    1. Incubar las secciones de flotación libre en tampón de bloqueo (PB con azida de sodio 0,05%, 1% de glicina, suero de cabra normal al 5%, y 0,1% Tritsobre X-100) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave en una plataforma oscilante.
    2. Con cuidado eliminar el tampón de bloqueo con una pipeta, añadir una dilución apropiada de anticuerpo primario de conejo anti-GFP (véase la Tabla de Materiales) en tampón de bloqueo y se incuba el tejido con esta dilución durante 48 horas a 4 ° C con agitación suave.
    3. Lavar la solución de anticuerpo primario un mínimo de 3 veces con PB, un lavado cada 10 minutos.
    4. Incubar las secciones de flotación libre con una dilución adecuada de anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado) en solución de bloqueo (véase la Tabla de Materiales) durante 1 hora a RT y agitación suave. Protección de los cuerpos de la luz directa durante la incubación.
    5. Lavar la solución de anticuerpo secundario con PB, 3 veces, una vez cada 10 min, y contrateñir el tejido mediante la incubación de las secciones con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) a 1 mg / ml en agua durante 5 min. Lavar la solución DAPI enjuagando dos veces el ingenio y rápidamenteh de agua.
    6. Con cuidado, coloque las secciones sobre un portaobjetos de microscopio utilizando un pincel fino. Verter unas gotas de medio de montaje para las preparaciones fluorescentes (véase la Tabla de Materiales) sobre el tejido y se coloca cuidadosamente un cubreobjetos en la parte superior, la comprobación de que la solución de montaje se distribuye correctamente sobre toda la superficie y no hay burbujas. Apriete suavemente hacia abajo el cubreobjetos para drenar el exceso de medio de montaje.
    7. Cuando la solución de montaje se seca (2-16 hr), analizar la muestra por microscopía confocal de barrido láser con el láser de 488 nm.

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Resultados

Sistema de entrega de genes mediada por LV se puede utilizar para el largo plazo en la transducción in vivo de células de la V-SVZ de ratón adulto, lo que permite su seguimiento y la modificación genética durante la proliferación, migración y diferenciación. La infección y la expresión son muy eficaces y producen numerosas células que se pueden distinguir fácilmente entre otras células no infectadas por la expresión del reportero incluido. Hasta ahora hemos visualizado células transducidas con GFP reporteros fl...

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Discusión

VL ofrecen importantes ventajas frente a otros sistemas virales para la modificación genética de las células madre neurales adultas 16,18. la administración estereotáxica de lentivirus con el nicho V-SVZ representa un método eficiente para etiquetar y rastrear con poca frecuencia dividiendo B1-NSCs superar las limitaciones de otros métodos usados ​​comúnmente, tales como BrdU, que se diluye después de múltiples divisiones celulares, o retrovirus, que sólo las células diana que están proliferando en el momento...

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Divulgaciones

Todas las manipulaciones se realizan en una sala de nivel de bioseguridad 2. los animales protocolos fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Valencia y eran todos, de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63 / UE.

Agradecimientos

Reconocemos la ayuda de MJ Palop y el apoyo técnico de la SCSIE de la Universidad de Valencia. Agradecemos también a Antonia Follenzi para comentarios y discusión del manuscrito votos. Si se soporta por la Fundación Botín, por Banco Santander a través de su División Global Santander Universidades, y por subvenciones de la Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP, y la CIIU) y el Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED y RETIC Tercel) . Este trabajo fue apoyado también por BFU2010-21823 y RETIC Tercel subvenciones del MINECO y el Consejo Europeo de Investigación (ERC) 2012-STG (260511- PD-HUMMODEL) a AC BM-P. es el beneficiario de una beca FPI español del MINECO.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Parte 1: Generación de LV para la entrega in vivo.
Equipo:
UltracentrífugaBeckman CoulterOptima XL-100K
Rotor de ultracentrífugaBeckman CoulterSW-28
rotorBeckman CoulterSW-55
Tubos de ultracentrífuga Beckman Coulter35812625 mm x 89 mm
 Beckman Coulter32681913 mm x 51 mm
Adaptadores de ultracentrífugaBeckman Coulter358156
Placa de 6 pocillosSPLPLC-30006
Placa de 24 pocillosSPLPLC-30024
Plato de 10 cmSPLPLC-20101100 x 20
Tubos FACS estiloAfora DE40080012 mm x 75 mm, 5 ml
Filtro FACS estéril de copaBD 34062630 µ m
Filtro de nitrocelulosaMilliporeSCGPU05RE0.22 μ m 
Citómetro de flujoBDLSR FortessaBlue laser 488 nm
Filtro SteritopBiofilFPE-204-500 0,22 y micro; m
Reactivos:
pMDLg/pRRE plásmido Addgene#12251Plásmido de empaquetamiento central
pRSV.PLÁSMIDO REV Addgene#12253Plásmido de empaquetado
central pMD2G plásmido Addgene#12259Plásmido de envoltura
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plásmido Addgene#12252Plásmido de vector de transferencia
Dulbecco's Modified Eagle Medium BiowestL0101-500para el cultivo celular HeLa
, Iscove's Modified Dulbecco's Medium Life technologies12440-053Para cultivo celular 293T
Tris-EDTA (TE)Tris-HCl (sigma, T5941), 0,1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7,6,  Libre de ADNasa/ARNasa, 0,2 y micro; m filtrado estérilmente
2x HBS0,28 M NaCl (Sigma, S7653), 0,05 M HEPES (Sigma, H7523), 1,5 mM Na2HPO4 (Sigma, S7907) en dH2O (preferiblemente no MilliQ). Ajuste el pH a 7.0 con una solución de NaOH (Calbiochem, 567530).
Suero fetal bovino (FBS)BiowestS181B-500Solución madre a 100x, utilizada para preparar HeLa y medio de cultivo 293T a una concentración final de 10x.
GlutaminaSigma-AldrichG7513-100Solución madre a 200 mM, utilizada para preparar HeLa y 293T medio de cultivo a una concentración final de 6 mM.
Piruvato de sodioLife technologies11360-039Solución madre a 100 mM, utilizada para preparar HeLa y 293T medio de cultivo a una concentración final de 1 mM.
GlutaMAX SupplementLife technologies35050-061Se utiliza para preparar el medio de cultivo 293T a una concentración final del 1%.
Penicilina/estreptomicinaSigma-AldrichP4458La solución madre contiene 5.000 unidades/ml de penicilina y 5 mg/ml de estreptomicina. Se utiliza para preparar el medio de cultivo HeLa y 293T a una concentración final del 1%.
Tripsina-EDTALife Technologies25200-056Con rojo fenol, contiene 2,5 g de tripsina porcina y 0,2 g de EDTA 4Na/L HBSS.
Solución salina tamponada con fosfato  (PBS)Sigma-AldrichD1408Sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, 10x, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular. Solución madre utilizada para preparar 1x PBS en agua apta para cultivo celular.
Polibreno (bromuro de hexadimetrina) Sigma-AldrichH9268Polvo. Prepare una solución madre 1.000x a 8 mg/ml en dHO
Paraformaldehído grado EM 16%EM Sciences15710
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Parte 2: Inyección estetodotáxica de VI en la ZEE propiamente dicha o en el ventrículo lateral.
Equipo:
Vernier instrumento estereotáxicoNeuroLab, Leica39463001http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham ratón y adaptador de rata neonatalNeuroLab, Leica39462950
Soporte para jeringasKD ScientificKDS-311-CE
Jeringa de calibre 33HamiltonP/N      84851/00#85RN
Taladro eléctricoFine Science Tool98096
Manta térmicaUfesaAL5512/01230-240 V, 100-110 W, tipo C_AL01
Afeitadora JataMP373NModelo: belleza, 3 V, 300 mA, tipo HT-03.
Reactivos:
MedetomidinaEsteveDOMTOR Solución comercial a 1 mg/ml.
KetaminaMerialImalgene 500 Solución comercial a 50 mg/ml
y ketaminaPrepare una mezcla de trabajo de medetomidina a una concentración final de 0,2 mg/ml de dilución y ketamina a una concentración final de 15 mg/ml en solución salina. Utilizar como anestesia inyectando un volumen para obtener una concentración final de 0,5-1 mg de medetomidina por kg de peso corporal y 50-75 mg de ketamina por kg de peso corporal
ButorfanolPfizerTorbugesicSolución madre a 10 mg/ml. Utilizado como analgesia a 1 mg/ml en solución salina.
AtipamezoleEsteveAntisedanSolución madre a 5 mg/ml, utilizada en una concentración final de 0,5 mg/ml en suero fisiológico para salir de la anestesia.
Solución salina al 0,9%Braun13465412
HistoacrylBraun1050052Adhesivo cutáneo tópico
HydroGelClear H2O70-01-5022
ToallitasKimberly-Clark3412011 cm x 21 cm
Bleach/VirkonDupont Rotulador
quirúrgicoStaedler313-9lumocolor permanente
 SICCAFLUID0,5 g/dosis, carbómero 974P
Povidona yodadaBetadine694109.610% povidona yodada
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Parte 3: Análisis histológico.
Equipo:
Bomba peristáltica automáticaCole-Parmer Inst. Co.HV-07524-55Masterflex L/S Accionamiento económico de velocidad variable, 1.6-100 rpm, 230 V
Cabezalde bomba Cole-Parmer Inst. Co.HV-07518-00 Cabezal debomba Masterflex L/S Easy-Load para tubos de precisión; Carcasa PSF, rotor CRS
Tubo de siliconaCole-Parmer Inst. Co.HV-96410-16Platinum L/S 16
Juego de venas del cuero cabelludoVygon V-green70246.05T25 G, longitud del tubo de 30 cm
VibratomeLeicaVT1000
Microscopio confocalOlympusFluoView FV10i
Placa calefactoraTehtnicaSHP-10
Reactivos:
Tampón de fosfato (PB)0,2 M PB: 0,2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) y 0,2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) en dH2O, ajuste el pH a 7.2-7.4
Paraformaldehído (PFA)Panreac141451.1211Prepare fresco cada vez. Calor dH2O hasta 55– 60 ° C usando una placa calefactora colocada en una campana extractora y vierta el polvo de PFA mientras revuelve para obtener una solución al 8%. La solución es de color blanco turbio ya que el PFA no se disuelve fácilmente. Agregue 1N NaOH gota a gota hasta que la solución se aclare. Enfriar, filtrar el papel Whatman y añadir un volumen equivalente de 0,2 M PB.
Soluciónal 0,9% NaCl en dH2O
SuperglueLOCTITE767547
Azida sódicaPanreac122712.1608
GlycineSigma-AldrichG7126-100
Suero normal de cabraMilliporeS30-100
Triton X-100Sigma-AldrichT9284Detergente
Anticuerpo anti-GFP para conejosROCKLAND600-401-215Úselo en una dilución de 1:500
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit Anti-IgG (H+L)Sondas molecularesA-21206Uso en una dilución de 1:750
diclorhidrato (DAPI)Sigma-AldrichD9542Tinción nuclear fluorescente. Úselo a 2 mg/ml en ddH2O. Manténgalo en la oscuridad a 4 °C.
Fluoromount-GEM Sciences17984-25 Medio demontaje para preparaciones fluorescentes
tubos de ultracentrífuga de Mezcla de medetomidina Lubricante oftálmico salina 6-Diamindino-2-fenilindol

Referencias

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