Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

Eva Porlan; Beatriz Martí-Prado; Antonella Consiglio; Isabel Fariñas

doi:10.3791/53282

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

9.1K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/53282

⸱

17 de febrero de 2016

Eva Porlan¹ , Beatriz Martí-Prado²^,³ , Antonella Consiglio⁴^,⁵ , Isabel Fariñas²^,³

¹Cell Division and Cancer Group, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO), ²Centro de Investigaciones Biomédicas en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), ³Departmento de Biologìa Celular, Universidad de Valencia, ⁴Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona (IBUB), ⁵Department of Molecular and Translational Medicine, Fibroblast Reprogramming Unit, University of Brescia

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un procedimiento basado en el uso de partículas lentivirales para la modificación genética a largo plazo de células madre neurales y/o sus células ependimarias adyacentes en el nicho neurogénico ventricular-subventricular adulto que permite el análisis por separado de los efectos autónomos y no autónomos, dependientes del nicho, sobre las células madre neurales.

Resumen

Relativamente células madre somáticas quiescentes apoyan la renovación celular de toda la vida en la mayoría de los tejidos adultos. Las células madre neurales en el cerebro adulto de mamíferos están restringidos a dos nichos neurogénicos específicos: la zona subgranular del giro dentado del hipocampo y la zona ventricular-subventricular (V-SVZ; también llamada zona subependimario o ZEE) en las paredes de los laterales ventrículos. El desarrollo de estrategias de transferencia génica in vivo para las poblaciones de células madre adultas (es decir, las del cerebro de los mamíferos) que resulta en la expresión a largo plazo de los transgenes deseados en las células madre y su progenie derivada es una herramienta crucial en la investigación biomédica y biotecnológica actual. Aquí, se presenta un método directo in vivo para la modificación genética estable de células de ratón adulto V-SVZ que se aprovecha de la infección de ciclo independiente de células por LVs y la citoarquitectura altamente especializado del nicho V-SVZ. En concreto, el protocolo actual implicaes la inyección de LVs vacíos (control) o LV codifican casetes de expresión de transgén específica en cualquiera de la propia V-SVZ, para la dirección in vivo de todos los tipos de células en el nicho, o en el lumen del ventrículo lateral, para la focalización de ependimarias Sólo las células. Los casetes de expresión se integran en el genoma de las células transducidas y las proteínas fluorescentes, también codificadas por el LVs, permitir la detección de las células transducidas para el análisis de células de efectos autónomos y no autónomos, de nicho dependiente en las células y se marcaron su progenie.

Introducción

La zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), en las paredes del ventrículo lateral hacia el cuerpo estriado, es una región germinal muy activo en el que un proceso continuo de replicación de células progenitoras y de diferenciación como resultado la producción persistente del bulbo olfatorio (OB interneuronas) y oligodendrocitos del cuerpo calloso ^1. La generación de toda la vida de estas células parece estar apoyada por la presencia en esta región de las células madre neurales (NSC, también llamadas células B1), que expresan la proteína ácida glial fibrilar antígeno de los astrocitos (GFAP) y marcadores de células tales como nestina, Id1 madre y Sox....