La inmunidad adaptativa está controlada por 'sinapsis inmunológicas' dinámicas formadas entre las células T y las células presentadoras de antígenos. Este protocolo describe métodos para investigar las células endoteliales, tanto como APC fisiológicas poco estudiadas como un nuevo tipo de "modelo de APC celular plana".
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Artículo de método
Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunidad adaptativa está regulado por las interacciones dinámicas entre las células T y las células presentadoras de antígeno ("APC") refiere como 'sinapsis inmunológicas. Dentro de estas interfaces de célula-célula íntimos grupos subcelulares discretos de MHC / Ag-TCR, F-actina, adhesión y moléculas de señalización forman y remodelar rápidamente. Estas dinámicas se cree que son determinantes críticos de la eficiencia y la calidad de las respuestas inmunes que se desarrollan y, por tanto, de protección contra la inmunidad patológica. El conocimiento actual de las sinapsis inmunológicas con fisiológica APC está limitada por la insuficiencia de la resolución de las imágenes se puede obtener. Aunque los modelos de sustratos artificiales (por ejemplo, bicapas lipídicas planas) ofrecen una excelente resolución y han sido herramientas muy valiosas, que son inherentemente no fisiológica y simplificada. Las células endoteliales vasculares y linfáticos se han convertido en un importante tejido periférico (o estroma) Compartimiento de "semi-profesionalal APC '. Estas APCs (que expresan la mayor parte de la maquinaria molecular de APCs profesional) tienen la característica única de la formación de la superficie celular prácticamente planar y están fácilmente transfectable (por ejemplo, con los reporteros fluorescentes de proteínas). Aquí un enfoque básico para implementar las células endoteliales como una novela y fisiológica 'planar modelo APC celular' para mejorar la formación de imágenes y el interrogatorio de los procesos de señalización antigénicos fundamentales se describirá.
Introducción
Los linfocitos T son una rama del sistema inmune adaptativo que se caracteriza por la capacidad de reconocer eficientemente péptido antígeno (Ag) unida a complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) moléculas a través de sus receptores de células T (TCR) 1. Linfocitos ingenuos constitutivamente migran y escanear 'Ag células presentadoras profesionales' (APC; por ejemplo, células dendríticas) en los ganglios linfáticos, mientras que las células de memoria / T efectoras necesitan para estudiar con eficacia una muy amplia gama de vehículos blindados y potenciales células diana dentro de los tejidos periféricos.
En ....
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Protocolo
Todos los experimentos descritos en este protocolo se llevan a cabo con las células T humanas primarias y células endoteliales disponibles comercialmente primarios humanos (dérmica o microvascular pulmonar EC) protocolo de investigación Cualquie en seres humanos debe ser aprobada por una junta de revisión institucional y el consentimiento informado por escrito se debe proporcionar de cada donante de sangre. Los experimentos llevados a cabo usando este protocolo fue aprobado por el IRB de Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Preparación de células CD4 + Th1 Humano efector / T de memoria
- Aplicar torniquete en el brazo del donante, limp....
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Resultados
Un enfoque de formación de imágenes novedoso utilizando células endoteliales y la combinación de las ventajas resolución de la planar bicapas lipídicas modelo con la complejidad fisiológica y la deformabilidad de las APC profesional fue desarrollado (Figura 1). La Figura 2 proporciona ejemplos de migración típica, el flujo de calcio y la dinámica topológicos observado con esta enfoque. En ausencia de la SAG en el endotelio, los linfocitos SAG-específicas.......
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Discusión
En general, este protocolo describe métodos para la investigación de las células endoteliales como i) APC fisiológicos poco estudiada y ii) como un nuevo tipo de "modelo APC celular plana '. Con respecto a lo primero, se ha vuelto cada vez más apreciada que la APC periférica no hematopoyéticas (o 'estroma') juegan un papel crítico, no redundantes (es decir, en comparación con hematopoyético APC) en la conformación de la respuesta inmune adaptativa 16-18. Entre tales "semiprofesi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Peter T. Sage por su ayuda en la generación de algunas de las imágenes representativas. Este trabajo fue apoyado por una subvención R01 de los NIH a C.V.C. (HL104006).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BD Vacutainer torniquete elástico sin látex | BD Biosciences | 367203 | |
| BD hisopos con alcohol | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Juego de extracción de sangre con botón pulsador | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Llevar a RT antes |
| de usar FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Azul de tripán | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| enterotoxina estafilocócica Tecnología | toxina | BBT202RED | Solución madre 1 mg/ml en PBS |
| 1 del síndrome de shock tóxico Toxina Tecnología | TT606RED | solución madre 1 mg/ml en PBS | |
| humano IL-15 | R& D Systems | 247-IL-025 | Solución madre 50ug/ml en PBS |
| PBS Life | Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectina | Life Technologies | 33016-015 | Solución madre 1mg/ml en H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Se pueden utilizar otras CE microvasculares humanas, es decir, HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Solución madre 10x, diluida en PBS |
| amaxa-HMVEC-L Kit de nucleofactor | Lonza | vpb1003 | Kit necesario para el paso 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Solución madre 1mg/ml en H20 |
| TNF-alfa 10ug, humano | Life Technologies | PHC3015 | Solución madre 1mg/ml en fenol H20 |
| HBSS sin rojo | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Cloruro de calcio | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Solución madre 1M en H20 |
| Cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | 208337 | solución madre 1M en H20 |
| Albúmina sérica humana | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F Aceite de inmersión sin fluorescencia | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Solución madre 1mM en DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsMonómero rojo (dsRed citoplasmático soluble) | Clontech | 632466 | |
| pDsMembrana de monómero rojo (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Solución de formaldehído 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Tóxico, use campana extractora |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Tubos de centrífuga cónicos Falcon 15mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Tubos de centrífuga cónicos Falcon 50mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Matraces tratados para cultivo de tejidos de halcón T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Matraces tratados para cultivo de tejidos de halcón T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Cultivo celular de Corning tratado T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm de diámetro |
| Placas de cultivo de tejidos Falcon 24 pocillos | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Placas Delta-T | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Pasteur Pipetas desechables | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1,5 ml Tubo Eppendorf | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Ratón ICAM1 anti-humano | BD Biosciences | 555509 | |
| ratón HS1 anti-humano | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-humano CD11a (LFA-1alpha) | Ebiociencia | BMS102 | |
| Anti-humano CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anticuerpo anti-MHC Clase II | Abcam | ab55152 | |
| Anticuerpo anti-Talin 1 | Abcam | ab71333 | |
| Anticuerpo theta anti-PKC | Abcam | ab109481 | |
| fosfotirosina (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Electroporador requerido para el paso 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Serie 60) Cabina de seguridad biológica | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 ° C, 5% CO2 Incubadora de cultivo celular | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrífuga 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocitómetro | Sigma-Aldrich | Z359629 | Hemocitómetro Bright-Line |
| Isotemp Baño de agua modelo 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
Referencias
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L.
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Reimpresiones y permisos
