High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Ensayo gasto energético

Resumen

El pez cebra es un importante organismo modelo para el estudio de la homeostasis energética. Mediante la utilización de un indicador redox sensible a NADH₂, alamar Blue, hemos desarrollado un ensayo que mide la tasa metabólica de las larvas de pez cebra en un formato de placa de 96 pocillos y se puede aplicar al descubrimiento de fármacos o genes.

Resumen

El pez cebra son un importante organismo modelo con ventajas inherentes que tienen el potencial de hacer que el pez cebra un modelo ampliamente aplicado para el estudio de la homeostasis energética y la obesidad. El pequeño tamaño del pez cebra permite ensayos con embriones que se llevan a cabo en un formato de placa de 96 o 384 pocillos, tecnologías basadas Morfolino y CRISPR promueven facilidad de manipulación genética, y el tratamiento de drogas mediante la aplicación del baño es viable. Por otra parte, el pez cebra son ideales para pantallas adelante genéticos que permitan la novela de descubrimiento de genes. Dada la relativa novedad del pez cebra como modelo para la obesidad, es necesario desarrollar herramientas que explotan plenamente estos beneficios. En este documento, se describe un método para medir el gasto de energía en miles de pez cebra embrionarias simultáneamente. Hemos desarrollado una plataforma de microplacas animal completamente en que utilizamos placas de 96 pocillos para aislar peces individuales y evaluar la producción acumulada NADH ₂ mediante el cultivo de células viabilidad re disponible en el mercadoagente alamarBlue. En poiquilotermos la relación entre NADH ₂ la producción y el gasto de energía está estrechamente vinculado. Este ensayo gasto de energía crea el potencial para cribar rápidamente manipulaciones farmacológicas o genéticas que alteran directamente el gasto de energía o alteran la respuesta a un fármaco aplicado (por ejemplo, sensibilizadores a la insulina).

Introducción

El ratón es actualmente el modelo predominante para la investigación de la obesidad. El intervalo generacional corto y herramientas genéticas disponibles en el ratón han sido sin igual hasta la fecha. Sin embargo, el pez cebra también tiene un intervalo de generación corto (3 - 4 meses) y supera incluso el ratón en la facilidad de manipulación genética ^1,2. El pez cebra mantiene cerca del 90% de los genes de mamíferos, mientras que muy por encima del ratón en el número de para su uso en pantallas genéticas y drogas ³ potencial y descendencia.

Para aprovechar el potencial del modelo de pez cebra para el estudio de la ....

Protocolo

Nota: Este protocolo sigue las directrices de la Universidad de Arizona Oficina para la Realización responsable de la investigación y ha sido aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional

1. cría de pez cebra y mantenimiento de embriones

1. Preparar E3 medio embrión ^8. Hacer 60x solución madre, disolver 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, CaCl ₂ 5,8 g ^● 2H ₂ O, y 9,78 g de MgCl ₂ ^● 6H _{2 O en} 1,95 L ddiH ₂ O. Ajustar el pH a 7,2 con NaOH y HCl Ajustar el volumen a 2 L utilizando ddiH ₂ O.
2. Para preparar el medio....

Resultados

Solución de ensayo no aumenta la fluorescencia en ausencia de peces embrionario (Figura 1). Sin embargo, el ensayo es altamente sensible a pequeños cambios en la tasa metabólica dentro del pozo. Un solo pez dentro de un pozo crea una señal significativamente diferente de los pozos en blanco dentro de 1 h (P <0,0001). La Figura 2 proporciona una representación visual de las señales generadas por los peces embrionario después de 24 h de incubación. Para el propósito de esta imagen se u.......

Discusión

La contaminación con bacterias u hongos limitará en gran medida la aplicación de este ensayo. El azul de metileno en el medio embrión E3 limita la posibilidad de contaminación por hongos. A lo largo del embrión criando es fundamental que se tenga cuidado para eliminar embriones muertos dos veces al día. Además, es esencial para enjuagar bien los embriones con medio de embrión E3 estéril en el día de la iniciación del ensayo. Estos 2 pasos limitan el potencial para la contaminación bacteriana de los embriones. La inclusi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	Fabricado por Thermo
Scientific Pipeta de transferencia desechable de punta fina	Fisher Scientific	13-711-26	Fabricado por Thermo
Scientific Fisherbrand Pipeta de transferencia desechable graduada	Fisher Scientific	13-771-9AM	Fabricada por Thermo Scientific
Placas de 96 pocillos con fondo transparente de lados negros	Fisher Scientific	50-320-785	Fabricado por E& K Productos Científicos Inc.