Artículo de método

Una alternativa sencilla para inyección estereotáctica para el Cerebro Derribo específico de miARN

DOI:

10.3791/53307

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26 de diciembre de 2015

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1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Los microRNAs desempeñan un papel crucial en el cerebro y son objetivos potenciales para modelar la neurodegeneración. Sin embargo, perturbar los niveles de miARN es un desafío debido a la corta longitud del miARN y la inaccesibilidad del tejido cerebral. Este video presenta un método para el diseño de antagomir y la administración específica del cerebro utilizando un neuropéptido en ratones.

Resumen

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Los microRNAs (miRNAs) son reguladores clave de la expresión génica. En el cerebro, procesos vitales como el neurodesarrollo y las funciones neuronales dependen de la correcta expresión de los microARN. La perturbación de los microARN en el cerebro se puede utilizar para modelar enfermedades neurodegenerativas mediante la modulación de la muerte de las células neuronales. En la actualidad, la inyección estereotáctica se utiliza para administrar agentes de eliminación de miARN en un lugar específico del cerebro. Aquí, discutimos estrategias para diseñar antagomires contra miRNA con modificaciones de nucleótidos bloqueados (LNA). Posteriormente, describa un método para la administración específica del cerebro de antagomires, de manera uniforme a través de diferentes regiones del cerebro. Este método es simple y ampliamente aplicable, ya que supera la cirugía, la lesión asociada y la limitación de la administración local en las inyecciones estereotácticas. Preparamos un complejo de glicoproteína neurotrópica del virus de la rabia (RVG) péptido que penetra en las células con antagomir contra miRNA-29 e inyectamos a través de la vena de la cola, para administrarlo específicamente en el cerebro. El diseño de antagomir incorporó características que permiten la orientación específica del miRNA y la formación de complejos no covalentes con el péptido. La descomposición del miARN en las células neuronales dio lugar a la muerte de las células apoptóticas y a los defectos de comportamiento asociados. Por lo tanto, el método se puede utilizar para modelos agudos de neurodegeneración a través de la perturbación de miARN.

Introducción

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Los microARNs se han convertido en nuevas dianas terapéuticas debido a su papel universal en la regulación de la expresión génica y pruebas directas de la participación en la enfermedad. MiRNAs se están explorando activamente por su potencial como fármaco dirigido a 1,2. Además, alteraciones en la expresión de los genes miARN están asociados con varias enfermedades 3 y simulación de estos cambios por la perturbación artificial de expresión de los genes miARN se puede utilizar para estudiar las vías celulares implicadas en la manifestación de la enfermedad. Entrega específica de tejido de miARN fármacos dirigidos es actualmente un gran desafío para el desarrollo de fármacos basados ​​miARN. Antagomirs e imita miARN son agentes prometedores para perturbar los niveles de miRNA 4-6. Sin embargo, las características especiales que mejoran su especificidad y eficacia tienen que ser incorporado en el diseño de antagomirs antes de que puedan ser utilizados para la perturbación in vivo de la expresión de los genes miARN.

Los microARN son especialmente relevantes como objetivos en neurodegenerativa actualmente incurable y enfermedades del neurodesarrollo. La barrera sangre-cerebro plantea una restricción a la entrega de antagomirs en el cerebro. Inyecciones estereotácticas son ampliamente utilizados en modelos de roedores para entregar moléculas a lugares específicos en el cerebro 7. Se requiere habilidad, amplia inversión en instrumentación y el tiempo. Inyecciones estereotáxicas son invasivas, implica cirugía, causar al menos leve lesión y se limita a la entrega local. El uso de péptidos penetrantes de células con una preferencia por las neuronas de orientación puede contrarrestar estas limitaciones, ya que pueden ser entregados a través de la ruta trans-vascular, pero romper la barrera hematoencefálica. Tal péptido derivado de la rabia Virus de la glucoproteína (RVG), se utilizó previamente para entregar siRNA contra virus de encefalitis japonesa en ratones 8. Encontramos que el uso del péptido para antagomir entrega, miRNAs puede ser efectivamente derribado en el cerebro del ratón 9.

ontenido "> El segundo gran reto de miARN knock-down surge desde el pequeño tamaño de miRNAs y la presencia de isoformas de secuencias estrechamente relacionadas. Tomamos el ejemplo de la MMU-miR-29 familiar que consta de tres isoformas estrechamente relacionados, miR-29a , b y c. antagomirs son también en general modificada a lo largo de la columna vertebral para aumentar su estabilidad y hacerlas resistentes al ataque de nucleasas. Locked Nucleic Acids (LNA) ofrecen una ventaja adicional que mejoran la estabilidad térmica e incluso conducir a la degradación orientar sobre y más allá impedimento estérico 10. La introducción de modificaciones a lo largo de la columna vertebral puede ser eficaz, pero caro. Hemos visto anteriormente que las modificaciones más allá de un número óptimo pueden no mejorar aún más la eficacia. El diseño de la antagomir por lo tanto, implica la modificación óptima de la antagomir.

Para antagomir complejo no covalente con el péptido neurotrópico, un hepta- cargada a la extensión nona-arginina se utiliza el. D-argininaresiduos se utilizan ya que confieren mayor estabilidad ya que no son susceptibles a la escisión por proteasas. Hepta a estiramientos-nona arginina actúan agentes celulares penetrante como eficientes, a pesar de que no confieren especificidad de tipo celular. Al enlazar covalentemente el péptido RVG al enlazador nona-arginina, un neurotrópico, péptido celular penetrante se generó. Los residuos cargados positivamente del péptido interactúan con la columna vertebral de ácido nucleico cargado negativamente, para formar complejos. Estos complejos se pueden utilizar para transfectar eficazmente ADN o ARN en células cultivadas e in vivo en los tejidos.

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Protocolo

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Nota: Todo el procedimiento incluyendo sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Ética Animales (AICE) en el Instituto de Genómica y Biología Integrativa, Nueva Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Este protocolo se ajusta específicamente para la ejecución selectiva de antagomir-29 en el cerebro y desmontables de miR-29.

1. antagomir Estrategia Diseño

  1. Recuperar la secuencia de los genes miARN maduro de miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
  2. Recuperar las secuencias de miembros de la familia miARN relacionados utilizando el enlace de "familia de genes" en el registro miRBase
    (Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).
  3. Invertir complementar la secuencia: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html proporciona una herramienta conveniente pararevertir secuencias del complemento.
  4. Marque las posiciones que ser modificados por LNA utilizando las siguientes pautas:
    1. Elige residuos de timina colocados 3-4 bases aparte para la modificación LNA, ya pirimidinas LNA son más estables que las purinas 12.
    2. Elija residuos de citosina separadas por 3-4 residuos si paso anterior produce menos de cinco modificaciones.
    3. Dar prioridad a las cinco modificaciones en el extremo 5 'del antagomir, ya que esto evita la secuencia de semillas.

Preparación Complejo 2. antagomir-neuropéptido

Nota: Este es el paso más crítico en el protocolo y que necesita la estandarización. Para estandarizar el protocolo de cualquier oligonucleótido marcado con fluorescencia (FLO) se puede utilizar en lugar de la antagomir 9. Los péptidos deben ser de alta pureza (calidad HPLC, pureza 98%) y .Sequences cargo de péptido y antagomir se dan en la Tabla 1.

  1. Decidir el número de mesesles de antagomir a inyectar en base a la carga molar en antagomir, su toxicidad y el peso del ratón. Calcular el número de moles de péptido a inyectar basa en relación de carga molar de antagomir: péptido.
    NOTA: Estandarizar relación de carga molar de antagomir: péptido de la toxicidad y la entrega efectiva en el cerebro del ratón. Utilice diferentes relaciones de carga molar de oligonucleótido marcado con fluorescencia: péptido de la normalización. Encontramos que antagomir-29 y el control eran ambos tóxicos en 4microgram / gramo de peso corporal del ratón. Antagomir-29 y el control se utilizaron a 2microgram / gramo de peso corporal, pero es probable que varíe para cada microRNA esta concentración efectiva.
  2. Diluir el péptido y antagomir en tubos de microcentrífuga separados de soluciones madre estéril con 10% de D-glucosa a la concentración final deseada como calculada en el paso 1.
  3. Mantenga el tubo de microcentrífuga con la solución de péptido en un vórtice a velocidad moderada vórtex.
  4. Añadir 1/3 de la unantagomir solución al tubo de solución de péptido, lentamente, gota a gota, mientras se mezcla a fondo en un mezclador de vórtice.
  5. Continuar mezclando de soluciones en el vórtice para el próximo 1 min y deje reposar la mezcla durante 1 minuto.
  6. Repita el paso 4 y 5 de dos veces más para mezclar el restante antagomir solución con la solución de péptido en el mismo tubo de microcentrífuga. La adición lenta es crítica para la formación de complejos de mono-dispersa que son eficaces en la transfección. Además rápido puede conducir a la agregación de los complejos y su precipitación.
  7. Incubar el complejo durante 30 min a TA sin agitación con vórtex. Durante este tiempo de incubación, aclimatarse a los ratones el laboratorio donde se llevarán a cabo inyecciones.

3. cola vena Inyección de Complejo antagomir-neuropéptido

  1. Para frenar el animal, coloque el ratón en un retenedor o decapicone del tamaño adecuado.
  2. Limpie la superficie de la cola utilizando pr hisopo de algodóne-empapado en agua caliente (aproximadamente 40 ° C). Esto promoverá la vasodilatación y aumentar la visibilidad de la vena.
  3. Acércate a la cola con un volumen pequeño (0,5-1,0 cc) jeringa de insulina en un ángulo de 15 a 20 °. Tenga cuidado de no introducir el aire en la jeringa. Comience en la parte distal de la cola. Inyectar el complejo. Retire la aguja y aplique una gasa con antiséptico directamente en el sitio de inyección (aproximadamente 5 a 10 segundos) para detener cualquier sangrado.
  4. Vuelva a colocar el ratón en una jaula de ventilación individual en el grupo de 3-5, con la mazorca de maíz y papel de seda como enriquecimiento. No guarde los ratones no inyectados e inyectados en una misma jaula.

4. Los ensayos de comportamiento

Nota: Mantenga el intervalo de tiempo de 3-4 horas entre ensayos de inyección y de comportamiento para permitir la recuperación después de la inyección. Traiga el ratón para una habitación tranquila. No moleste a los animales durante este período de aclimatación.

  1. Aclimatar el ratón a lanuevo ambiente durante 30 minutos y luego comenzar los siguientes ensayos de comportamiento. Mantenga una distancia de 10 minutos entre cada ensayo conductual.
  2. Juntando las extremidades posteriores:
    NOTA: Esta prueba indica disfunción motora y deterioro neurológico.
    1. Levante el ratón con cuidado mediante la celebración de cerca de la base de la cola en el fondo claro.
    2. Compruebe la posición de las extremidades posteriores de 10-15 seg. Ensancha ratón tipo salvaje extremidades posteriores lejos de abdomen, mientras que un ratón atáxica tiende a retraer uno o ambos miembros posteriores hacia el abdomen más de 50% del tiempo de 13 suspendido.
    3. Devuelva el ratón a la jaula
  3. Prueba Ledge:
    1. Levante el ratón con cuidado mediante la celebración de la cola y mantenerlo en la cornisa de una jaula.
    2. Observe el ratón específicamente en la esquina de la jaula. Wild tipo de ratón puede pasar las esquinas fácilmente sin miedo y perder el equilibrio. Ratón atáxica pierde su equilibrio, congelación o sacude mientras camina por la cornisa de la jaula y en las esquinas.
  4. ensayo huella del ratón:
    NOTA: Para este ensayo mantener la lámina absorbente listo, en el suelo de una pista estrecha (~ 70 cm de largo, ~ 5 cm de ancho, con ~ 5 cm de altos muros.)
    1. Mantenga el ratón suavemente con una mano y aplicar la tinta en las extremidades traseras por un cepillo.
    2. Coloque la lámina absorbente en el suelo de una pista estrecha.
    3. Permita ratón para caminar o correr sobre una lámina absorbente en una línea recta en una pista de aterrizaje de un extremo a otro.
    4. Repetir el proceso dos veces más con cada ratón utilizando lámina absorbente fresco.
    5. Medir la distancia entre dos pasos consecutivos en el movimiento hacia adelante. No incluya primeros y últimos huellas donde el animal se acaba de iniciar y terminar su recorrido, respectivamente.

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Resultados

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Usando el procedimiento que aquí se presenta, complejos de oligonucleótido 50microgram marcado con fluorescencia (FLO) y ~ 850microgram RVG péptido 1:15 relación de carga molar: se prepararon (FLO péptido) y se inyecta una sola vez a través de la vena de la cola. Complejo de la no-neurotrópico Matrix Virus de la Rabia (RVM) péptido y FLO fue utilizado como un control de entrega. Al día siguiente, los ratones se aislaron cerebro y el hígado y se prepararon suspensiones de células individuales. Las células se observaron b...

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Discusión

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Aquí demostramos una metodología ampliamente accesible para estudiar los efectos de la modulación de miARN. Actualmente, la mayoría de los intentos de caracterización in vivo de las funciones de miARN implican la creación de ratones knockout o un transgénico que expresa una esponja de miARN. La mayoría de los miARN, incluso los específicos del tipo de célula, se expresan en más de un órgano. Por ejemplo, los miARN que inicialmente se pensaba que eran específicos del sistema hematopoyético también se expresan ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Souvik Maiti por su ayuda en el diseño de los antagomires. También agradecemos a Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey y Bijay Pattnaik por su ayuda con los métodos experimentales. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigaciones Científicas e Industriales (BSC0123). HS, MV y RR reconocen la beca del Consejo de Investigación Científica e Industrial de la India. MAS reconoce la beca de la Comisión de Becas Universitarias, India.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vortex
Restrainer o Decapicone
Pistade ~70 cm de largo, ~5 cm de ancho con paredes de ~5 cm de altura.
Reactivos
Oligonucleótidos marcados con fluorescencia (siGLO)GE Healthcare Dharmacon INCD0016300120
10% de D-glucosa
Antagomir-29ExiqonSíntesis
Antagomir-controlExiqon
Neuropéptido RVGG.L.Biochem ( Shanghái) Ltd.síntesis personalizada>98% de pureza
Neuropéptido RVMG.L.Biochem (Shanghai) Ltd.Síntesis personalizada>98% de pureza
Otro
algodón
Agua
Jeringas de
Hojas
Pincel
tinta
Antiséptico
estrecha estérilpersonalizada de tibiainsulinaabsorbentes de

Referencias

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Silenciamiento de microARNdise o de antagomirescido nucleico bloqueadop ptido penetrante de c lulasglucoprote na del virus de la rabiainyecci n en la vena caudalentrega espec fica al cerebroensayos conductualesPCR cuantitativamodelo de neurodegeneraci n

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