Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

Summary

Las proteínas de la envoltura nuclear juegan un papel central en muchos procesos biológicos básicos y han sido implicadas en una variedad de enfermedades humanas. Este protocolo describe un nuevo modelo de ratón basado en Cre/Lox que permite el control espacio-temporal de la interrupción de los complejos LINC.

Abstract

La migración nuclear y el anclaje dentro de los tejidos en desarrollo y adultos dependen en gran medida de grandes ensamblajes de proteínas macromoleculares llamados LInkers del Nucleoesqueleto y Citoesqueleto (complejos LINC). Estos andamios de proteínas abarcan la envoltura nuclear y conectan el interior del núcleo con los componentes del citoesqueleto citoplasmático circundante. Los complejos LINC consisten en dos familias de proteínas conservadas evolutivamente, las proteínas Sun y las Nesprins, que albergan motivos de firma molecular C-terminal llamados dominios SUN y KASH, respectivamente. Las proteínas Sun son proteínas transmembrana de la membrana nuclear interna cuyo dominio nucleoplasmático N-terminal interactúa con la lámina nuclear, mientras que sus dominios SUN C-terminal sobresalen en el espacio perinuclear e interactúan con el dominio KASH de Nesprins. Las isoformas canónicas de Nesprin tienen un N-terminal de tamaño variable que se proyecta en el citoplasma e interactúa con los componentes del citoesqueleto. Este protocolo describe la validación de una estrategia de ratón transgénico dominante-negativo que interrumpe las interacciones endógenas SUN/KASH de una manera específica para cada tipo de célula. Nuestro enfoque se basa en el sistema Cre/Lox que evita muchos inconvenientes, como la letalidad perinatal y los fenotipos celulares no autónomos que se asocian con modelos de línea germinal de inactivación del complejo LINC. Por esta razón, este modelo proporciona una herramienta útil para comprender el papel de los complejos LINC durante el desarrollo y la homeostasis en una amplia gama de tejidos.

Introduction

La envoltura nuclear (NE) separa el nucleoplasma del citoplasma. Se compone de una membrana nuclear interna y externa (INM y ONM, respectivamente) que se conectan en los poros nucleares. El lumen delimitado por ambas membranas se llama el espacio perinuclear (PNS). La ONM es una extensión del retículo endoplásmico rugoso (ER), y el INM se adhiere a la lámina nuclear, una malla de tipo nuclear-V filamentos intermedios representado por A y de tipo B laminas ^1,2. Enlazadores de los complejos Citoesqueleto (LINC) nucleoesqueleto y son conjuntos macromoleculares que abarcan toda la envoltura nuclear para conectar físicamente el interior del núcleo a los filamentos del citoesqueleto y motores moleculares (Figura 1a). Se componen de interacciones entre evolutivamente conservados motivos que caracterizan a dos familias de proteínas transmembrana integrales de la NE: Sol (sad1 / Unc84) proteínas y Nesprins (Nuclear Sobre SPectRINS). En los mamíferos, Sun1 y Sun2 arproteínas transmembrana e del INM cuyo N-terminal nucleoplasmic región interactúa directamente con A y laminas de tipo B ^3-5. En el otro lado del INM, dentro del PNS, las proteínas Sun Harbor un estiramiento-evolutiva conservada de ~ 150 aminoácidos C-terminal llamado el dominio dom Dominios SUN interactúan directamente con la KASH-evolutiva conservada (Klarsicht / ANC-1, Syne homología) de dominio, la firma molecular de Nesprins. KASH dominios consisten en un tramo de ~ 30 aminoácidos C-terminal que sobresale en el PNS seguido por un dominio transmembrana ^6. Al menos cuatro genes nesprin distintas (Nesprin1-4) codifican KASH contienen proteínas que se localizan en el NE ^7. Las regiones citoplasmáticas de Nesprins, cuyos tamaños varían de ~ 50 kDa (Nesprin4) a un sorprendente 1.000 kDa (gigante Nesprin1), contienen múltiples espectrina repite, así como los motivos específicos que permite su interacción con los componentes del citoesqueleto, tales como actina, plectina y motores moleculares ^{8- 13.}

Estudios en vertebrados e invertebrados han mostrado que Lamin / Sun / nesprin / motores moleculares constituyen un "eje" conservadas evolutivamente controlar la migración nuclear y anclaje. Varios knock-out (KO) modelos de ratón de componentes complejos LINC se han descrito y fueron fundamentales en la prestación de un marco para comprender las funciones de las proteínas Sol y nesprin en el NE durante el desarrollo de los mamíferos ^9,14,15. Sin embargo, estos modelos presentan varios inconvenientes significativos, sobre todo: 1) de dificultad en la interpretación de los fenotipos debido a la celda efectos no autónomos, 2) la dificultad para distinguir las contribuciones fenotípicas de KASH contienen vs. KASH menos nesprin isoformas ^16, 3) la redundancia funcional de las proteínas Sun y nesprin en el NE en numerosos tipos de células requiere esquemas de mejoramiento complejos para inactivar todas las interacciones dom-KASH en ratones ^{17 y} 4) la letalidad perinatal de ratones deficientes para el KASH-dominio de ambosNesprins1 y 2 impide el análisis de adultos fenotipos ^18.

Este protocolo describe un modelo de ratón novedoso diseñado para interrumpir todas las interacciones dom-KASH in vivo, en una célula de manera autónoma y regulado por el desarrollo, evitando así muchos de los inconvenientes descritos anteriormente. Este / modelo de ratón basada en lox Cre se basa en dos conceptos importantes: 1) el dominio KASH de cualquier proteína nesprin conocido es suficiente para dirigir EGFP a la NE en sistemas de cultivo celular y 2) dominios SUN interactuar promiscuamente con dominios Kash, por tanto, la sobreexpresión de cualquier dominio KASH saturará todos los dominios SUN endógenos e inactivar complejos LINC de una manera dominante negativo ¹⁷ (Figura 1B). Este protocolo describe la cosecha de tejidos y etapas de procesamiento utilizadas para confirmar la interrupción de todas las interacciones dom-KASH en las células de Purkinje del cerebelo.

Protocol

Declaración de Ética: Procedimientos en seres animales fueron aprobadas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Washington en St. Louis.

1. Ratón Cría y Genotipado

1. Raza ratones Tg Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) (PCP2-Cre) ratones para producir Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20. Nota: Mientras que el resto de este protocolo se centra en el uso de la línea de Tg (PCP2-Cre) del ratón para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje en el cerebelo, un procedimiento similar puede ser seguido con cualquier otro Tg (Cre) ratón ( Figura 2A).
2. Realizar genotipado para identificar los cachorros que albergan ambos transgenes EGFP y Cre como se describió anteriormente ^19.

2. Preparación de los materiales para la disección y Tissue Collection

1. Preparar 100 ml de 30% de sacarosa en PBS (30 g de sacarosa / 100 ml de PBS 1x) y se almacena a -20 ° C. El día de tejido harvesting, deshielo y la carga ~ 30-35 ml de solución de sacarosa en una jeringa de 35 ml para perfusiones transcardial.
2. Preparar 40 ml de PFA al 4% en PBS (10 ml 16% de paraformaldehído y 30 ml de PBS). Cargar ~ de 30-35 ml de PFA al 4% en una jeringa de 35 ml para perfusiones transcardial.
3. Llenar una placa de cultivo tisular de 10 cm con 10 ml de PBS para la disección de tejidos.
4. Preparar un cóctel de ketamina / xilazina que consiste en 16 mg / ml de ketamina y 3 mg / ml de xilazina.
5. Preparar una solución de etanol al 70% para la disección.

3. La disección y Tissue Collection

1. Usando una jeringa de 1 ml, inyectar 500 l de cóctel de ketamina el / xilazina por cada 25 gramos de peso corporal y esperar a ~ 15 min. Alternativamente, utilizar otro método aprobado institucionalmente sedación que es apropiado para el sistema biológico de interés.
2. Tras la sedación, pellizque suavemente la pata trasera para confirmar la falta de respuesta al dolor, fijar todas las patas en una bandeja de espuma de poliestireno con la cara dorsal de ladel ratón hacia abajo.
3. Pulverizar el abdomen con 70% de etanol y hacer una incisión desde el abdomen inferior a la parte superior de la caja torácica para obtener acceso al corazón.
4. Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón y de insertar la jeringa que contiene la solución de sacarosa al 30% en el ventrículo izquierdo del corazón.
5. Perfundir la solución a una velocidad de ~ 2 a 5 ml por min. Cuando está vacío, retire la jeringa y repita con la solución de PFA 4%.
6. Liberar el ratón de la bandeja de espuma de poliestireno y decapitar para acceder al cerebro.
7. Retire la piel alrededor de la cabeza del animal con unas pinzas y tijeras. Haga un agujero en la parte posterior del cráneo con una aguja y retire con cuidado el cráneo con tijeras y pinzas de disección.
8. Una vez que el cerebro es claramente accesible, utilizar pinzas para quitar el cerebelo y colocarlo en PBS. Dividir en dos el cerebelo en el plano sagital con un escalpelo y transferir a la solución de sacarosa al 30% durante la noche a 4 ° C. Nota: Para prepararson secciones de parafina, fijar el cerebelo durante la noche a 4 ° C en el 4% PFA antes de la incrustación de tejidos y seccionamiento.

4. Procesamiento de tejidos y Seccionamiento

1. Preparar una suspensión de hielo seco y butano 2-metilo. Dejar que la temperatura del baño se equilibre durante 5 min.
2. Llene una criomolde con compuesto de octubre y coloque una media del cerebelo biseccionado en el molde.
3. Usando un microscopio de disección y un par de fórceps posición el cerebelo manera que la superficie dividida en dos partes (cerca de la línea media del cerebelo) quede hacia arriba.
4. Transferir el criomolde a la suspensión de hielo seco durante 5 min hasta que el compuesto OCT ha formado un sólido blanco alrededor de matriz de la muestra de tejido. Nota: la muestra congelada ahora se pueden almacenar a -20 ° C si es necesario.
5. Label diapositivas poli-lisina pre-tratada para la recogida de las secciones de tejido y preparar el criostato de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el fin de recoger 15 micras secciones de la cerebellum. Para recoger las secciones, póngase en contacto con atención la sección de octubre con el lado revestido de poli-lisina de la diapositiva. Para preservar la orientación de la sección, no gire la diapositiva durante este paso.
6. Secciones de tejido tienda a -20 ° C hasta proceder a la tinción y de imagen.

5. La tinción e Imagen de Cerebelo Secciones

1. Preparar las siguientes soluciones antes de la tinción de tejidos:
   ~ 50 ml de PBS
   ~ 5-10 ml de PFA al 4% en PBS
   ~ 10-20 ml de 0,5% Triton X-100, 10% de suero de burro en PBS
2. Secciones de cerebelo deshielo. Es importante destacar que minimizar su exposición a cualquier fuente de luz continua e intensa para prevenir la decoloración de EGFP.
3. El uso de una barrera hidrofóbica lápiz, dibujar un rectángulo alrededor de las secciones de tejido.
4. Post-fijar las secciones con 4% PFA durante 5 min. Use suficiente líquido para cubrir toda el área delimitada por la barrera hidrofóbica (normalmente ~ 500 l). El uso de un vacío o pipeta, remover el fijador particularmente cuidado de no molestar a los cortes de tejido.
5. Con una pipeta, aplicar suavemente PBS sobre el portaobjetos sin molestar a las secciones de tejido. Después de 5 min utilizar el vacío o pipeta para retirar con cuidado el líquido. Repita el enjuague de PBS un total de tres veces.
6. Con una pipeta, aplicar cuidadosamente la dilución adecuada de anticuerpos primarios (3 l Calbindin y / o anticuerpo Nesprin2 por 900 l de solución) en 0,5% de Triton X-100, 10% de suero de burro en PBS. Incubar durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
   Nota: EGFP-KASH2 será visible por microscopía de fluorescencia directa sobre secciones congeladas, y no es necesario utilizar un anticuerpo anti-EGFP. Sin embargo, si se han preparado las secciones de parafina, formación de imágenes de EGFP-KASH2 requiere inmunodetección con un anticuerpo anti-EGFP.
7. Retire la solución de anticuerpo y enjuague con PBS tres veces.
8. Preparar 1: 1.000 diluciones de Alexa-Fluor anticuerpos secundarios en 0,5% Triton X-100,10% de suero de burro en PBS y almacenar en la oscuridad.
9. Retire con cuidado el enjuague final PBS y aplicar la dilución de anticuerpo secundario durante una hora en la oscuridad.
10. Retire la solución de anticuerpo secundario, aclarar y lavar la sección tres veces. Si es necesario, aplicar una mancha nuclear, tales como DAPI (~ 300 nM), durante la primera aplicación PBS.
11. Completamente eliminar la solución PBS de todo el tejido y el lugar ~ 5.7 l de medios de montaje en la sección de tejido. Coloque un cubreobjetos de vidrio en la parte superior de la sección de tejido y dejar de lado por unos 15-30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
12. Utilice un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros apropiados para visualizar EGFP y cualesquiera otras longitudes de onda adecuadas para los anticuerpos secundarios utilizados en los pasos 5.8 / 5.9. En rebanadas del cerebelo, utilice un objetivo 20X para ver llantas nucleares EGFP-KASH2.

Results

Este protocolo ilustra la utilidad de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modelo de ratón Tg para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje del cerebelo utilizando TG (PCP2-CRE) ratones. En Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) descendencia, el marco de lectura abierto LacZ / V5 se escinde en P6 por la Cre recombinasa lo que conduce a la expresión de EGFP-KASH2 dirigida específicamente a las células de Purkinje (Figura 2A). Como era de esperar, EGFP-KASH2 está dirigido a la envoltura nuclear c...

Discussion

El paso más crítico para estudiar con éxito el papel de los complejos de LINC in vivo utilizando el modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) es identificar una línea de ratones Cre adecuado (s). En efecto, si Cre está activo en otros tipos de células implicados en las vías similares, se puede complicar la interpretación de los resultados. Por lo tanto, es importante examinar las células cercanas, como se muestra aquí en las capas celulares moleculares y granulares del cerebelo (Figura 2B). Del mism...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sacarosa	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% Solución de paraformaldehído	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15710
OCT Compuesto	Tissue-Tek	4583
Portaobjetos de adhesión	StatLab	M1000W
Suero de burro	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pluma	Vector Laboratories	H-4000
Anticuerpo Anti-Calbindina	Sigma	Aldrich C9848
Anticuerpo Anti-EGFP	Abcam	ab13970
Anticuerpo			Descrito anteriormente en Ref. 21
Montaje fluorescente Medios	Dako	S3023
2-metilbutano	Sigma Aldrich	O3551