Las proteínas de la envoltura nuclear juegan un papel central en muchos procesos biológicos básicos y han sido implicadas en una variedad de enfermedades humanas. Este protocolo describe un nuevo modelo de ratón basado en Cre/Lox que permite el control espacio-temporal de la interrupción de los complejos LINC.
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Artículo de método
Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica
En este artículo
Resumen
Resumen
La migración nuclear y el anclaje dentro de los tejidos en desarrollo y adultos dependen en gran medida de grandes ensamblajes de proteínas macromoleculares llamados LInkers del Nucleoesqueleto y Citoesqueleto (complejos LINC). Estos andamios de proteínas abarcan la envoltura nuclear y conectan el interior del núcleo con los componentes del citoesqueleto citoplasmático circundante. Los complejos LINC consisten en dos familias de proteínas conservadas evolutivamente, las proteínas Sun y las Nesprins, que albergan motivos de firma molecular C-terminal llamados dominios SUN y KASH, respectivamente. Las proteínas Sun son proteínas transmembrana de la membrana nuclear interna cuyo dominio nucleoplasmático N-terminal interactúa con la lámina nuclear, mientras que sus dominios SUN C-terminal sobresalen en el espacio perinuclear e interactúan con el dominio KASH de Nesprins. Las isoformas canónicas de Nesprin tienen un N-terminal de tamaño variable que se proyecta en el citoplasma e interactúa con los componentes del citoesqueleto. Este protocolo describe la validación de una estrategia de ratón transgénico dominante-negativo que interrumpe las interacciones endógenas SUN/KASH de una manera específica para cada tipo de célula. Nuestro enfoque se basa en el sistema Cre/Lox que evita muchos inconvenientes, como la letalidad perinatal y los fenotipos celulares no autónomos que se asocian con modelos de línea germinal de inactivación del complejo LINC. Por esta razón, este modelo proporciona una herramienta útil para comprender el papel de los complejos LINC durante el desarrollo y la homeostasis en una amplia gama de tejidos.
Introducción
La envoltura nuclear (NE) separa el nucleoplasma del citoplasma. Se compone de una membrana nuclear interna y externa (INM y ONM, respectivamente) que se conectan en los poros nucleares. El lumen delimitado por ambas membranas se llama el espacio perinuclear (PNS). La ONM es una extensión del retículo endoplásmico rugoso (ER), y el INM se adhiere a la lámina nuclear, una malla de tipo nuclear-V filamentos intermedios representado por A y de tipo B laminas 1,2. Enlazadores de los complejos Citoesqueleto (LINC) nucleoesqueleto y son conjuntos macromoleculares que abarcan toda la envoltura nuclear para conectar físicamente el interior del núcleo a los filamen....
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Protocolo
Declaración de Ética: Procedimientos en seres animales fueron aprobadas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Washington en St. Louis.
1. Ratón Cría y Genotipado
- Raza ratones Tg Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) (PCP2-Cre) ratones para producir Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Nota: Mientras que el resto de este protocolo se centra en el uso de la línea de Tg (PCP2-Cre) del ratón para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje en el cerebelo, un procedimiento similar puede ser seguido con cualquier otro Tg (Cre) ratón ( Figura 2A). <....
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Resultados
Este protocolo ilustra la utilidad de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modelo de ratón Tg para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje del cerebelo utilizando TG (PCP2-CRE) ratones. En Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) descendencia, el marco de lectura abierto LacZ / V5 se escinde en P6 por la Cre recombinasa lo que conduce a la expresión de EGFP-KASH2 dirigida específicamente a las células de Purkinje (Figura 2A). Como era de esperar, EGFP-KASH2 está dirigido a la envoltura nuclear c.......
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Discusión
El paso más crítico para estudiar con éxito el papel de los complejos de LINC in vivo utilizando el modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) es identificar una línea de ratones Cre adecuado (s). En efecto, si Cre está activo en otros tipos de células implicados en las vías similares, se puede complicar la interpretación de los resultados. Por lo tanto, es importante examinar las células cercanas, como se muestra aquí en las capas celulares moleculares y granulares del cerebelo (Figura 2B). Del mism.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen al personal del núcleo Morfología e Imagen, del núcleo de Genética Molecular (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales) y del ratón Genética Core en la Universidad de Washington en St. Louis Escuela de Medicina. Los autores son apoyados por el programa de pequeñas donaciones del centro McDonnell Celular y Neurobiología Molecular, el Centro Esperanza de Trastornos Neurológicos, el Instituto Nacional del Ojo (# R01EY022632 a DH), un Instituto Oftalmológico Centro Nacional Core Grant (# P30EY002687) y un subvención sin restricciones de Investigación de Prevención de la Ceguera en el Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sacarosa | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Solución de paraformaldehído | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 15710 | |
| OCT Compuesto | Tissue-Tek | 4583 | |
| Portaobjetos de adhesión | StatLab | M1000W | |
| Suero de burro | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pluma | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anticuerpo Anti-Calbindina | Sigma | Aldrich C9848 | |
| Anticuerpo Anti-EGFP | Abcam | ab13970 | |
| Anticuerpo | Descrito anteriormente en Ref. 21 | ||
| Montaje fluorescente Medios | Dako | S3023 | |
| 2-metilbutano | Sigma Aldrich | O3551 |
Referencias
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of s....
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Reimpresiones y permisos
