Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Resumen

Este protocolo describe cómo utilizar cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorales que representan la metástasis en el tejido pulmonar de ratón.

Resumen

La enfermedad metastásica es la propagación de las células tumorales malignas desde el sitio del cáncer primario a un órgano distante y es la causa principal de muerte de cáncer asociado ^1. Los sitios comunes de diseminación metastásica incluyen pulmón, ganglios linfáticos, el cerebro y la médula ^2. Mecanismos que impulsan la metástasis son áreas intensas de la investigación del cáncer. En consecuencia, los ensayos eficaces para medir la carga metastásica en sitios distantes de las metástasis son instrumentales para la investigación del cáncer. Evaluación de metástasis de pulmón en modelos tumorales mamarias se realiza generalmente mediante la observación cualitativa bruto de tejido pulmonar después de la disección. Los métodos cuantitativos de evaluación de metástasis se limitan actualmente a ex vivo y en técnicas de imagen basadas vivo que requieren parámetros definidos por el usuario. Muchas de estas técnicas se encuentran en todo el nivel de organismo en lugar del nivel celular ^3-6. Aunque los métodos de imagen más recientes que utilizan microscopía de múltiples fotones son capaces de evaluar MetasTasis a nivel celular ^7, estos procedimientos altamente elegantes son más adecuadas para la evaluación de los mecanismos de difusión en lugar de la evaluación cuantitativa de la carga metastásica. Aquí, se presenta un método simple in vitro para evaluar cuantitativamente la metástasis. Usando cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR), el ARNm de células específicas de tumor se puede detectar en el tejido de pulmón de ratón.

Introducción

Análisis de QRT-PCR se propone como un método para evaluar la metástasis del tumor. Este método se propone como una alternativa para los usuarios que están interesados ​​en la evaluación de la metástasis, pero no pueden tener acceso a equipos específicos, como in vivo equipos de imagen o un estereoscopio capaz de fluorescencia. Una discusión de los métodos comúnmente utilizados se muestra seguido por una demostración de cómo el análisis de QRT-PCR se puede utilizar ya sea como un separado o como un método compañero para evaluar la metástasis. Este procedimiento tiene el potencial de proporcionar un análisis cuantitativo de la carga metastásica.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices y normas de cuidado de los animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC) y su Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC).

1. Disección de pulmón

1. La disección del tumor mamario (opcional, dependiendo de los objetivos del estudio y si se realizó un análisis del tumor primario o vena de la cola de la inyección).
   1. La eutanasia del ratón utilizando una dosis letal de anestesia con isoflurano según IACUC y la regulación de la universidad. Confirme la eutanasia por dislocación quirúrgica.
   2. El tablero de la espuma, el pin con alfileres de disección mediante la colocación....

Resultados

Más allá del tiempo necesario para realizar la inoculación inicial de las células tumorales en el animal experimental y, si la realización, el análisis primario del tumor in vivo, la cosecha de tejidos, aislamiento de ARN, y el análisis de QRT-PCR es un procedimiento en 1-2 día (Figura 1) .

Un ejemplo de análisis bruto es bioluminiscente de imágenes para evaluar las células tumorales en el te.......

Discusión

Este protocolo describe el uso de QRT-PCR para evaluar mamaria metástasis de células tumorales al pulmón utilizando un modelo de xenoinjerto de ratón. Se reconoce que otras técnicas, incluyendo bioluminiscente de imágenes, están disponibles y también son eficaces para la detección de metástasis a pesar de tener sus propios valores y limitaciones. Los datos presentados sugieren que QRT-PCR proporciona una medida eficaz de detectar mRNA derivadas de tumores en el tejido pulmonar para la cuantificación de la metástasis tot.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-mercaptoetanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
Kit de aislamiento de ARN GeneJet	Thermo Scientific	K0732
iScript Supermix de transcripción inversa para QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-RAD	172-5121
Ensayo PrimePCR SYBR Green: ERBB2, Humano	Bio-Rad	100-25636
Plantilla PrimePCR para ensayo verde SYBR: ERBB2, humano	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG