Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Envejecido en las neuronas del hipocampo

María Calvo-Rodríguez; Carlos Villalobos; Lucía Nuñez

doi:10.3791/53330

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca

7.8K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/53330

⸱

1 de diciembre de 2015

María Calvo-Rodríguez¹ , Carlos Villalobos¹ , Lucía Nuñez²

¹Instituto de Biologìa y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas, ²Departamento de Bioquìmica y Biologìa Molecular y Fisiologìa, Universidad de Valladolid

En este artículo

Resumen

La remodelación intracelular de Ca²⁺ en el envejecimiento puede contribuir a la excitotoxicidad y al daño neuronal, procesos mediados por la sobrecarga de Ca²⁺. Nuestro objetivo fue investigar la remodelación del Ca²⁺ en el cerebro envejecido utilizando imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia de Ca²⁺ citosólico y mitocondrial en cultivos a largo plazo de neuronas del hipocampo de rata, un modelo de envejecimiento neuronal.

Resumen

La susceptibilidad a la muerte celular neuronal asociada a la neurodegeneración y la isquemia se incrementan excesivamente en el cerebro envejecido pero los mecanismos responsables están mal conocido. La excitotoxicidad, un proceso que se cree que contribuir al daño neuronal inducido por ambos insultos, está mediada por la activación de receptores de glutamato que promueve Ca ^{2 + afluencia} y mitocondrial Ca ^{2 + sobrecarga.} Un cambio sustancial en Ca ^{2 + homeostasis} intracelular o remodelación de ^Ca2 + intracelular homeostasis puede favorecer el daño neuronal en las neuronas viejas. Para la investigación de Ca ²⁺ remodelación en el envejecimiento se han utilizado imágenes de células vivas en cultivos a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata que se asemejan en algunos aspectos las neuronas in vivo edades. Para este fin, las células del hipocampo son, en primer lugar, recién dispersa de nuevos hipocampo de rata nacida y chapada en cubreobjetos recubierto, vidrio poli-D-lisina. A continuación, los cultivos se mantienen en medios de comunicación controlados por varios días o varias wEeks para la investigación de las neuronas jóvenes y mayores, respectivamente. En segundo lugar, las neuronas cultivadas se cargan con fura2 y sometidos a mediciones de la concentración citosólica ^de Ca2 + utilizando imágenes de fluorescencia ratio digital. En tercer lugar, las neuronas cultivadas son transfectadas con plásmidos que expresan un tándem de aequorina baja afinidad y GFP apuntado a las mitocondrias. Después de 24 h, aequorina dentro de las células se reconstituye con coelenterazina y las neuronas son sometidos a imágenes de bioluminiscencia para la monitorización de la concentración de Ca ²⁺ mitocondrial. Este procedimiento de tres pasos permite la monitorización de citosólica y mitocondrial ^Ca 2 + respuestas a los estímulos relevantes como, por ejemplo, el agonista del receptor de glutamato NMDA y comparar si estas y otras respuestas están influenciadas por el envejecimiento. Este procedimiento puede producir nuevos conocimientos en cuanto a cómo el envejecimiento influencia citosólica y mitocondrial ^Ca 2 + respuestas a los estímulos seleccionados, así como las pruebas de medicamentos seleccionados destinadas a prevenir célula de la neuronamuerte en enfermedades relacionadas con la edad.

Introducción

La excitotoxicidad es uno de los mecanismos más importantes que contribuyen al daño neuronal y muerte celular en insultos neurológicos tales como isquemia, y en algunas enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer ^1. Este tipo de neurotoxicidad está mediada principalmente por el glutamato actúa sobre Ca ²⁺ receptores ionotrópicos, -permeable NMDA (NMDAR) ^2. La exposición de las neuronas cultivadas a glutamato puede conducir a la excitotoxicidad ^3, lo que provoca la apoptosis neuronal ^4. Nosotros y otros han informado anteriormente de que la vulnerabilidad neuronal a la apoptosis inducida ....