Las estrategias experimentales para llenar los vacíos grandes de tejido de la médula espinal lesionada espinal después de la lesión aguda y crónica

Resumen

Las lesiones graves de la médula espinal suelen provocar defectos en los tejidos. Se describen dos posibilidades para cerrar con éxito dichas brechas para promover la adaptación de los tejidos, las respuestas regenerativas y la mejora funcional en ratas mediante la implantación de un sistema de microconectores mecánicos después de una lesión aguda y cinco semanas después de la transección completa de la médula espinal.

Resumen

Después de una lesión de la médula espinal (SCI) se forma una cicatriz en el núcleo de la lesión que impide la regeneración axonal. La reducción de la zona de la lesión después de un insulto a la médula espinal, las resecciones tumorales, o defectos de los tejidos resultantes de accidentes traumáticos pueden ayudar a facilitar la reparación de tejidos en general, así como el crecimiento de regeneración de las fibras nerviosas dentro y más allá de la zona afectada. Se presentan dos estrategias de tratamiento experimentales: (1) la implantación de un nuevo dispositivo microconnector en una médula espinal de rata torácica seccionado de forma aguda y completamente readaptar cortó muñones de tejido de la médula espinal, y (2) de llenado polietilenglicol del sitio SCI en las ratas lesionadas crónicamente después de resección de la cicatriz. La lesión de la médula espinal crónica en este modelo es una transección de la médula espinal completa que fue infligido 5 semanas antes del tratamiento. Ambos métodos han logrado recientemente resultados prometedores y regeneración axonal promovido la invasión celular, beneficiosa y mejoras funcionalesen modelos de roedores de la lesión de la médula espinal.

El sistema microconnector mecánica (MMS) es un sistema multi-canal compuesto de polimetilmetacrilato (PMMA) con un sistema de tubo de salida para aplicar presión negativa a los mMS lumen tirando por lo tanto los muñones de la médula espinal en los orificios de panal estructurado. Después de su implantación en el hueco de tejido 1 mm el tejido es aspirado en el dispositivo. Además, las paredes interiores de los MM se microestructurada para una mejor adherencia de los tejidos.

En el caso del enfoque de lesión de la médula espinal crónica, el tejido de la médula espinal - incluyendo el área de la lesión de la cicatriz lleno - se reseca en un área de 4 mm de longitud. Después de la resección de la cicatriz microquirúrgico la cavidad resultante se rellena con polietilenglicol (PEG 600), que se encontró que proporcionaba un excelente sustrato para la invasión celular, la revascularización, la regeneración axonal y la remielinización incluso compacto in vivo.

Introducción

Una lesión traumática de la médula espinal no sólo conduce a la pérdida de axones pero más resultados en materia defectos de los tejidos que impiden cualquier respuesta regenerativa (para una revisión véase ^1,2). el tejido de la médula espinal a menudo se pierde a través de la degeneración secundaria que conduce a la formación de quistes o agujeros en y alrededor del área de la lesión. La mayoría de las intervenciones terapéuticas experimentales se centran en incompletas daños en la médula espinal como transección, aplastamiento o contusiones lesiones parciales con un borde de tejido sano restante. Para las lesiones completas como cortes transversales totales resultantes de accidentes traumáticos o intervenciones quirúrgicas, como resecciones tumorales, solamente las opciones de tratamiento disponibles son muy limitadas hoy ^3,4. Después de la transección completa, la tensión mecánica de los resultados de tejido en retracción muñón espinal, dejando un pequeño espacio en la médula espinal. La mayoría de las estrategias se centran en llenar este vacío con tejidos, células o matrices de ^5,6.

Aquí, una estrategia diferentese presenta, es decir, re-adaptación de los muñones separados utilizando un nuevo dispositivo microconnector ^7. Con el fin de readaptar los dos muñones, fuerza mecánica tiene que ser aplicado como una ligera presión negativa de lograr esto (Figura 1). El sistema microconnector mecánica (MMS) es un sistema multi-canal de polimetilmetacrilato (PMMA) con agujeros con forma de panal (Figura 1A) y provisto de un sistema de tubo de salida. Se implanta en el hueco de tejido resultante de la transección completa de la médula espinal en la rata (Figura 1C). Un tubo puede ser conectado a una bomba de vacío para aplicar presión negativa a los MMS (Figura 1D). La presión de tira de los tocones de la médula espinal desconectados en los agujeros con forma de panal del MMS, que tienen paredes microestructurados para mantener el tejido en su lugar cuando se libera la presión (Figura 1B). El tubo se puede dejar intacta después de la cirugía y se une a una minibomba osmótica con el finpara infundir sustancias en el núcleo de la lesión (Figura 1E-F).

Además de una transección aguda de la médula espinal otro tipo de resultados lesión completa de la extirpación quirúrgica de un tumor de la médula o un sólido cicatriz lesión crónica que conduce a grandes huecos de tejido de varios milímetros, que no pueden ser superadas por el MMS hasta el momento. La mayoría de los pacientes con trauma de la médula espinal sufren de lesiones crónicas. En estos pacientes, una cicatriz completamente desarrollado ocupa el núcleo de la lesión. La extirpación quirúrgica de la cicatriz de la lesión es un concepto para el tratamiento que se investiga actualmente después de la lesión experimental ^8,9. Aunque el procedimiento de resección en sí se puede realizar sin causar daño adicional considerable, el hueco de tejido resultante necesita ser puenteado con una matriz adecuada que permite y promueve la regeneración del tejido y, en el caso específico de las lesiones de la médula espinal, la regeneración de las fibras nerviosas para mantener y promover las funciones del aparato locomotor. Eraencontró que el polietilenglicol de bajo peso molecular (PEG 600) es un material muy adecuado para este propósito. Su falta de inmunogenicidad y la muy baja viscosidad permite una integración sin problemas en el tejido circundante. La inserción del biopolímero solo promueve la invasión de células beneficiosos, incluyendo las células endoteliales, células de Schwann periféricos, y astrocitos, y - muy importante - la regeneración y la elongación de los axones de descendente y ascendente tractos de fibras, así como su ensheathment por mielina compacta ^8. Se encontró que estas respuestas regenerativas que ir acompañada de larga duración mejoras funcionales. La combinación de la resección de tejido cicatrizal y la posterior implantación de PEG 600 presenta un medio seguro y simple, pero muy eficaz para salvar defectos sustanciales de tejido de la médula espinal.

Protocolo

directrices institucionales para la seguridad de los animales y la comodidad se respetaron, y se les proporcionó todas las intervenciones quirúrgicas y cuidado de los animales pre y post-quirúrgica de acuerdo con la ley alemana de Protección de Animales (Office Protection Estado, Ambiental y del Consumidor de Renania del Norte-Westfalia, LANUV NRW ).

1. La transección completa de la médula espinal torácica de ratas Wistar hembras (220 - 250 g)

1. Preparación de la médula espinal
   1. Utilice la anestesia de inhalación de isoflurano (2-3% de isoflurano en O ₂ / NO ₂ en una proporción de 1: 2) y la inyección en bolo de carprofeno (por vía subcutánea [sc] 5 mg / kg). se recomienda la combinación de carprofeno y de la buprenorfina opioide (0,02 mg / kg sc). Iniciar la cirugía cuando la tapa del ojo del reflejo al tacto suave con un bastoncillo de algodón y de la pata reflejo de retirada de estímulos pellizcando con pinzas ya no se observa.
   2. Colocar el animal en una manta de calentamiento a 37 ° C para mantener la temperatu de la carroceríare durante la cirugía y ungüento para los ojos puesto en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
   3. Shave la espalda del animal y preparar la piel con un desinfectante de la piel.
   4. Cortar la piel en la línea media a lo largo de las vértebras torácicas para 4 cm con una cuchilla quirúrgica y abrirlo. A partir de este paso, tendrá que utilizar esterilizar instrumentos quirúrgicos para todos los procedimientos (en autoclave o inmersión a esterilizar).
   5. Retraer los músculos por encima de las vértebras torácicas usando una pequeña pinza músculos.
   6. Retire las apófisis espinosas a nivel torácico 8 (Th8) y Th9 con un rongeur hueso por el recorte con cautela pequeñas piezas de hueso hasta que los huesos vertebrales son planas.
   7. El uso de fórceps anatómicas para levantar la columna vertebral en la apófisis espinosa Th7 y utilizar un rongeur para recortar pequeñas piezas de hueso vertebral de caudal a rostral hasta una laminectomía se realiza a Th8 y Th9. Exponer la duramadre sin dañarlo retirando cuidadosamente solamente unos pocos y muy pequeños trozos de hueso vertebral a la vez.
   8. Sujetar la cadena principal por 2 abrazaderas de estabilización en las apófisis espinosas Th7 y Th10, levantar al animal para desacoplar los movimientos respiratorios de las vértebras.
2. Una sección completa de la médula espinal a nivel torácico 8/9
   1. Levante la duramadre con unas pinzas finas, cortar la duramadre con unas tijeras finas ojo en dirección transversal.
   2. Mantenga el extremo del corte lateral de la duramadre con unas pinzas finas e insertar un gancho espinal en el espacio entre la duramadre subarachnoidic y arachnoidea. Evitar el daño de las meninges por no pinchar en el pia o duramadre con fórceps o un gancho de la médula espinal.
   3. gire lentamente el gancho para colocarlo a lo largo del tejido de la médula espinal, teniendo cuidado de no pinchar en la duramadre (PIA sigue intacta).
   4. Levantar la médula espinal durante aproximadamente 1 - 2 mm hacia arriba, hasta que una brecha se ve en la cara ventral entre el tejido de la médula espinal y la duramadre.
   5. Inserte tijeras finas del ojo en el espacio entrn duramadre y la piamadre y cortar la médula espinal, mientras que el gancho espinal se deja en su lugar.
   6. Levante las dos cepas de la médula espinal con dos pinzas y garantizar visualmente transección completa.
   7. Para los animales de control lesionadas y animales con una lesión crónica, cerrar la duramadre por suturas interrumpidas con monofilamento no absorbibles 9,0 hilos.
   8. Para las lesiones crónicas cursar una parte 1.6.
3. Implantación mMS
   1. Coloque mMS por encima del sitio de la lesión con los dos tubos se extiende a cada lado lateral de la vértebra y lo baja en la cavidad de la lesión.
   2. tubos de sutura a los músculos en el lado de la vértebra con no reabsorbible 4-0 hilo para asegurar la estabilización de los MMS. Garantizar una fijación de los MMS utilizando fórceps durante este paso.
   3. Retire la clavija de conexión mMS cortando con unas tijeras finas.
   4. Cierre la duramadre por encima de los MMS y se sutura con hilos de 9,0.
   5. Una un tubo a la bomba de vacío, y sellarla otra por apriete.
   6. Aplicar presión negativa suave para el MMS por una bomba de vacío a través del tubo abierto, chupando los tocones de la médula espinal en el lumen MMS. Aplicar la presión negativa durante varios minutos (como máximo, para 10 min) y controlar por los sensores (250 a 350 mbar).
   7. Cortar los tubos cerca de los MMS y quitar los tubos. Continúa con el paso 1.6.
4. La resección del tejido del cordón espinal Incluyendo la cicatriz de la lesión crónica en la semana 5 después de la lesión inicial
   1. Siga los pasos 1.1.1 - 1.1.5.
   2. Identificar el tejido de la cicatriz por la apariencia marrón amarillo y el tejido rígido en la parte superior de la médula espinal. Retire con cuidado las capas superficiales del tejido de la cicatriz sujetando con pinzas finas y cortar con unas tijeras finas. Con este método, vuelva a abrir el sitio de laminectomía para exponer el tejido que contiene el área de lesión de la médula espinal. Detener la preparación cuando se identifica visualmente la sutura duramadre.
   3. Sujetar la cadena principal por 2 abrazaderas de estabilización en espínsos procesos TH7 y Th10, y luego elevar al animal para desacoplar los movimientos respiratorios de las vértebras.
   4. Con una pequeña regla cartón medir el área de la médula espinal que ha de ser resecado (longitud: 4 mm) y marcar los bordes de esta zona de tejido correspondiente, con incisiones transversales para permitir la posterior eliminación de tejido.
   5. Quitar el tejido de la cicatriz a través de una combinación de corte y aspiración. Sacar el tejido que se ha separado de la médula espinal con las incisiones transversales. Utilice aspiración suave siempre que sea suficiente para permitir la eliminación del tejido. Además, siempre que la textura de rigidez del tejido de la cicatriz hace que la aspiración del tejido demasiado difícil, utilizar unas tijeras finas para cortar y eliminar este tejido.
   6. Introduzca un trozo (aproximadamente 5 mm x 5 mm x 5 mm cubo) de la esponja de gelatina hemostática en el hueco de tejido hasta que se desploma de sangrado. La esponja de gelatina se reducirá en tamaño tan pronto como se empapa con el líquido.
5. IMPLAntation de PEG 600
   1. Preparar 1 ml de PEG puro sin diluir 600 para la inyección por calentamiento a 37 ° C.
   2. Retire esponja de gelatina.
   3. Inserte suficiente cantidad (aproximadamente 5-7 l) de PEG en el hueco con una jeringa de 10 l o una pipeta de 10 l.
   4. Con cuidado, cubrir el área con un trozo (aproximadamente 5 mm x 4 mm) de reemplazo de sellador / dura.
   5. Fijar el sellador rodea el tejido muscular con unas gotas de pegamento de tejidos. Coloque el sellador en la parte superior de la brecha de la resección lleno de PEG. Para evitar el deslizamiento del sellador, utilizar pequeñas gotas de goma de tejido para fijar las esquinas del sellador en el tejido muscular circundante. Nota: evite las fugas de la goma de tejido en el tejido de la médula espinal!
6. Cierre de Tejido y los cuidados postoperatorios
   1. los músculos de sutura y capa de piel de capas con suturas interrumpidas con trenzadas 4-0 hilos absorbibles
   2. Inyectar 2 x 2,5 ml de cloruro de sodio (NaCl[0,9%]) a 36 ° C sc para la rehidratación después de la cirugía. Una sola inyección de 5 ml de NaCl estiraría la piel del animal y puede causar un daño innecesario al animal. No deje desatendida animal hasta que se recupere la plena conciencia.
   3. Inyectar carprofeno diaria (sc 5 mg / kg) durante al menos 2 días después de la cirugía. animales de casa en una sola jaula durante los 2 primeros días, después en grupos de 2 - 3.
   4. Aplicar tratamiento antibiótico (administración oral diaria de enrofloxacina) para la primera semana después de la operación.
   5. Hacer vejiga manual de la micción en dos a tres veces por día por acariciar suavemente sobre el vientre del animal del rostral a caudal. Tenga cuidado de no mover la columna vertebral, del animal y no levante el animal en la cola. anular manualmente la vejiga del animal completamente espinalizada diaria durante todo el tiempo de supervivencia. Se debe tener cuidado al colocar bolitas de comida y botellas de agua en una altura que puede ser alcanzado por los animales sinde pie sobre sus patas traseras. A pesar de ser lesionados en función de cuarto trasero, los animales se mueven y exploran las jaulas activa inmediatamente después de la cirugía. Se recomienda mantener las ratas en grupos sociables.
   6. Para las lesiones crónicas dejar un tiempo de supervivencia de los animales de cinco semanas antes de la resección de la cicatriz. Siga los pasos 1.4.

Resultados

La preservación de tejidos, axonal nuevo crecimiento y beneficio funcional de la implantación después mMS aguda transección completa de la médula espinal
Se demuestra que la implantación aguda del MMS estabiliza los muñones de la médula espinal completamente seccionado y la disminución de la contracción del tejido (Figura 2A frente a B). Como se visualizaron por tinción con tricrómico en secciones sagitales, la tinción de...

Discusión

Aquí se presentan dos enfoques quirúrgicos diferentes para llenar los vacíos de tejido de la médula espinal después de (1) la transección completa aguda y MMS implantación y (2) la lesión de la médula espinal crónica y la eliminación de la cicatriz fibrosa, más PEG implantación matriz. Ambas estrategias conducen a la conservación de tejidos y la regeneración axonal, así como a la mejora funcional significativa locomotor de los animales tratados. Para la implantación mMS una fijación adecuada del MMS dentro de la médula ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PEG 600 Ph Eur	Merck/VWR	8.170.041.000
Esponja de gelatina Gelastypt	sanofi Aventis	PZN-8789582
Sellador Nescofilm	Roth	2569.1
Baytril	Bayer
Rimadyl (Carpofen)	Pfizer
Forene (Isoflurano)	Abbvie
Kodan (desinfectante de la piel)
Histoacryl (pegamento para tejidos)
Friedman-Pearson Rongeur, vaso de 1 mm, recto	Fine Science Tools	16020-14
Microespátula dos en uno - 12 cm	Fine Science Tools	10091-12
Pinzas Dumont #7 - Inox Medical	Fine Science Tools	11273-20
Dumont #5/45 Pinzas - Inox Medical	Fine Science Tools	11253-25
Gancho de médula espinal	Herramientas de Ciencias Finas	10162-12
Tijeras	Herramientas de ciencia fina	14078-10
Abrazadera	Aesculap	EA016R
Ethicon Vicryl 4-0
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Pinzas
	Fine Science Tools	11000-13
Retractor autorretenedor	Fine Science Tools	17008-07
Pinza para la piel	Herramientas de Ciencia Fina	13008-12
Aluspray	Selectavet

anatómicas Bayer