Fácil y Precisa mecanoterapia perfiles en micropost Arrays

Summary

Se describen protocolos para cuantificar las interacciones mecánicas entre las células adherentes y los sustratos microestructurados. Estas interacciones están estrechamente relacionadas con comportamientos celulares esenciales, como la migración, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis. Los protocolos presentan un software de análisis de imágenes de código abierto llamado MechProfiler, que permite la determinación de las fuerzas involucradas para cada microposte.

Abstract

Los sustratos de cultivo celular con micropostes flexibles integrados permiten al usuario estudiar las interacciones mecánicas entre las células y su entorno inmediato. En particular, las interacciones célula-sustrato son el principal interés. Hoy en día, las matrices de micropostes son un método bien caracterizado y establecido con una amplia gama de aplicaciones que se han publicado en la última década. Sin embargo, parece haber una reserva entre los biólogos para adaptar la técnica debido al largo y desafiante proceso de fabricación de micropostes, junto con la falta de software fácilmente accesible para analizar imágenes de células que interactúan con micropostes.

La lectura forzada de las micropublicaciones es sorprendentemente fácil. Un microposte actúa como un resorte con la celda idealmente unida en su punta. Dependiendo del tamaño, una célula aplica fuerza desde su citoesqueleto a través de uno o varios puntos focales de adhesión al microposte, desviando así el microposte. La cantidad de deflexión se correlaciona directamente con la fuerza aplicada en dirección y en magnitud. El número de micropostes cubiertos por una celda y los patrones de deflexión posterior son característicos y permiten determinar valores como la fuerza por poste y muchos parámetros biológicamente relevantes que permiten el "mecanoperfilado" de los fenotipos celulares.

Aquí se describe un método conveniente para la creación de perfiles mecanométricos, que combina la primera generación de micropostes disponibles comercialmente listos para usar con un paquete de software desarrollado internamente que ahora es accesible para todos los investigadores. Como demostración de la aplicación típica, se tomaron imágenes individuales de células de cáncer óseo en microscopía de campo claro para el mecanoperfilado de modelos de líneas celulares de metástasis. Esta combinación de sensores comerciales de fuerza de tracción y software de código abierto para el análisis permite, por primera vez, una rápida implementación de la técnica de matriz de micropostes en el trabajo de laboratorio rutinario realizado por usuarios no expertos. Además, un proceso de análisis robusto y optimizado permite al usuario analizar un gran número de imágenes de micropublicaciones de una manera muy eficiente en el tiempo.

Introduction

Ensayos basados ​​en células de mecanoterapia sensibles permiten investigar las células adherentes, con una amplia gama de aplicaciones que reflejan el papel central que la mecánica pueden desempeñar en la biología celular. Estas aplicaciones suelen centrarse en los mecanismos subyacentes que impulsan procesos subcelulares o el comportamiento de células enteras. Por un lado, los factores ambientales externos, tales como composición de la matriz extracelular o la rigidez de la matriz puede afectar dramáticamente la respuesta mecánica y biológica de una célula. ¹ El mismo se puede observar después de su uso de muchas clases de compuestos farmacéuticamente ac....

Protocol

1. Las células de cultivo en micropost Arrays

Nota: Todos los pasos deben realizarse en una cabina de bioseguridad para garantizar la esterilidad. Los volúmenes que se dan aquí son para frascos de cultivo de células T25. La densidad media de la receta y la siembra de células de cultivo de células están optimizados para líneas celulares de cáncer de hueso HuO9 y M132.

1. Preparar un cultivo de células para la siembra en una matriz micropost.
   1. Inspeccione la calidad del cultivo celular colocando el frasco de cultivo en un microscopio óptico estándar. Asegúrese de que las células muestran un crecimiento y morfología típicos m....

Results

La principal ventaja de la técnica descrita radica en su simplicidad y su potencial para la integración rápida y efectiva sobre el trabajo de laboratorio de rutina. La combinación de redes de sensores comerciales de alta calidad combinados con software de código abierto proporciona información acerca de mecano-sensibilidad que de otro modo requiere el acceso a las instalaciones de sala limpia y un profundo conocimiento de análisis de imagen y desarrollo de software. La figura 1 ilustra el flujo de traba.......

Discussion

Este trabajo busca avanzar en el campo de la microscopía de fuerza de tracción al reducir sustancialmente los obstáculos técnicos y prácticos a la entrada. Estas barreras provienen de dos lados. En primer lugar están los numerosos desafíos técnicos no triviales que se deben superar para fabricar de forma reproducible y poner en marcha una serie micropost experimentalmente. En segundo lugar, es la necesidad de manera similar no trivial para un análisis semiautomatizado fiable de las fuerzas de células individuales - teni.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matraces de cultivo celular T25	Nunc 156367
1x tampón PBS	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medio DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicilina-Estreptomicina 100x	Sigma	P4333
Viales de centrífuga de 15 ml	Sarstedt	62.554.502
Matriz Micropost pre-recubierta con Colágeno I/Fibronectina	MicroDuits	MPA-col1/FN	Dimensiones del micropost: Ø=6.4  y micro; m, l=18,2 y micro; m; cuadrícula=13 µ m, kcorr=2.87  nN/µ m
Etanol abs p.A.	Merck	100.983
Placa de 12 pocillos	Nunc	150628
Solución de formol, tamponada neutra 10%	Sigma	HT5011
Azul brillante G-250	Sigma	27815	Azul Coomassie
Metanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Ácido acético	Sigma	695092
Plato con fondo de vidrio	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm de diámetro, apertura 22  mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Microscopio invertido
D3-L3	Nikon	n/a	Controlador de cámara
DS Fi2	Cámara Nikon