Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Organoides como Modelo para Enfermedades Infecciosas: Cultura de Derechos Humanos y organoides estomacales murinos y microinyección de Helicobacter Pylori

34.4K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/53359

⸱

12 de noviembre de 2015

 , 
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

En este artículo

Resumen

Los cultivos derivados de células madre albergan un tremendo potencial para modelar enfermedades infecciosas. Aquí se describe el cultivo de organoides gástricos de ratón y humanos derivados de células madre adultas. Los organoides se microinyectan con el patógeno gástrico Helicobacter pylori.

Resumen

Recientemente, los biólogos de infecciones han empleado cultivos derivados de células madre para responder a la necesidad de nuevos y mejores modelos para estudiar las interacciones huésped-patógeno. Se han utilizado tres fuentes celulares: células madre embrionarias (ESC), células madre pluripotentes inducidas (iPSC) o células madre adultas. Aquí, se describe el cultivo de organoides gástricos de ratón y humanos derivados de células madre adultas y se utilizan para la infección con el patógeno gástrico Helicobacter pylori. Las glándulas gástricas humanas se aíslan del material de resección, se siembran en una matriz basal y se incrustan en un medio que contiene factores de crecimiento factor de crecimiento epidérmico (EGF), R-espondina, Noggin, Wnt, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 10, gastrina e inhibidor beta del factor de crecimiento transformante (TGF). En estas condiciones, las glándulas gástricas se convierten en organoides tridimensionales que contienen 4 linajes del estómago. Los organoides se expanden indefinidamente y pueden congelarse y descongelarse de manera similar a las líneas celulares. Para los estudios de infección, las bacterias se microinyectan en la luz de los organoides. Los organoides infectados se procesan para la obtención de imágenes. Los métodos descritos se pueden adaptar a otros organoides e infecciones con otras bacterias, virus o parásitos. Esto permite el estudio de los cambios inducidos por la infección en las células primarias.

Introducción

El estudio de los patógenos se basa en sistemas de modelos adecuados para imitar la infección in vivo. Para algunos agentes infecciosos, sistemas de modelos adecuados faltan mientras que algunos de los sistemas que se utilizan están lejos de ser óptima. Un ejemplo es la bacteria gástrica por Helicobacter pylori (H. pylori), que está causalmente relacionada con el desarrollo de cáncer gástrico. Sin embargo, en ausencia de un sistema de cultivo celular más adecuado, muchos estudios que tienen como objetivo analizar los mecanismos moleculares subyacentes de desarrollo del cáncer de líneas celulares de cáncer de utilización, lo que representa el punto final de la cascada canceroso. Las células primarias, no transformadas sería un mejor modelo para estos estudios. Sin embargo, las células primarias sólo están disponibles a partir de un pequeño número de donantes y no pueden ser cultivadas durante largos períodos de tiempo más largos. En los últimos años, la investigación de células madre ha hecho progresos significativos para proporcionar nuevas fuentes para cultivos de células primarias para el estudio de la biología de la infección.

Culturas detres fuentes de células madre se han utilizado: las células madre embrionarias (ESC), células madre pluripotentes inducidas (IPSC) o células madre adultas. Se han utilizado para modelar las infecciones con virus, tales como el citomegalovirus 1,2 o Virus de Hepatitis C 3 - 7, parásitos, tales como Plasmodium falciparum 8 o 9 Toxoplasma gondii, y las bacterias, tales como Bacterioides thetaiotaomicron 10 o 11 Salmonella enterica. Más recientemente, varios enfoques han sido publicados para modelar la infección con H. pylori con organoides derivadas de CES o iPS células 12, las células madre adultas de ratón 21,22 humanos o células madre adultas 13 - 15.

El desarrollo de las culturas organoides a partir de células madre adultas originó a partir de un estudio, en el que las células madre individuales aislados a partir de epitelio intestinal murino fueron sembradas en una matriz de 3-dimensional yincrustado en un medio que imitaba el entorno de las células madre intestinales que contienen EGF como mitógeno, R-espondina para mejorar Wnt de señalización y Noggin para inhibir la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización 16. Cabe destacar que estos cultivos no requieren co-cultivo con células mesenquimales. En estas condiciones, las células madre proliferan y forman estructuras pequeñas con dominios que alberga las células de las criptas intestinales, y dominios que contienen las células de la vellosidad intestinal. Los organoides tanto auto-organizan para imitar la situación in vivo. Hoy en día, las células madre adultas de muchos tejidos murinos y humanos se puede cultivar in vitro y la auto-organizarse en organoides que se asemejan a su contraparte en vivo, como el intestino delgado y colon 17, estómago 13,18, 19,20 hígado, páncreas y 21 de próstata 22.

Aquí le ofrecemos un protocolo de vídeo a la cultura del ratón o organoides gástricos humanos de cel madre adultasls y los microinyectar con H. pylori. Este protocolo se basa en informes anteriores 13,18. Este método puede ser adaptado para el cultivo y la infección de otras culturas organoides como organoides intestinales.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Establecimiento de Gástrico organoides Cultura

Nota: Este protocolo se puede utilizar para el aislamiento de las glándulas gástricas de ratón o el tejido humano. Se aconseja el uso de tejido de aproximadamente 1 cm ². El tejido humano se puede obtener de resecciones o biopsias gástricas.

  1. Preparación del material
    Nota: La matriz sótano utilizado es Matrigel. Mantener la matriz de sótano en hielo en todo momento. Almacene la matriz sótano a -20 ° C y descongelar en hielo antes de su uso. El medio basal se refiere a Advanced DMEM / F12 suplementado con HEPES; una fuente de glutamina apropiado tal como Glutamax y antibióticos apropiados tales como 1x Primocin. La incubadora utilizado es una incubadora de cultivo celular estándar (37 ° C, atmósfera humidificada, 5% de CO 2)
    1. Esterilizar los utensilios de preparación en autoclave o utilizando el 100% de alcohol isopropílico: pinzas cortantes, tijeras, un bisturí y un portaobjetos de microscopía de vidrio.
    2. El día antes del aislamiento, coloque un 24 welplaca de cultivo de células L en la incubadora.
    3. Preparar la matriz sótano de acuerdo a la recomendación de los fabricantes. Preparar alícuotas de 1 ml para evitar los ciclos de congelación y descongelación repetidas.
    4. Preparar 500 ml quelantes búfer y enfriar en hielo. Preparar tampón 1x a partir de agua destilada estéril con 5,6 mM Na 2 HPO 4, 8,0 mM KH 2 PO 4, NaCl 96,2 mM, 1,6 mM KCl, sacarosa mM 43,4, 54,9 mM D-sorbitol, 0,5 mM DL-ditiotreitol (ATENCIÓN), pH 7. Si la planificación de varios aislamientos, preparar una solución concentrada 5x sin el DL-ditiotreitol. Filtro estéril la memoria intermedia. Antes de aislamiento, diluir el tampón 5x con agua estéril a 1x y añadir DL-ditiotreitol justo antes de aislamiento.
    5. Preparar y diluir todos los factores de crecimiento de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Utilice de pequeño tamaño alícuotas y evitar los ciclos de congelación-descongelación. Factores de crecimiento funcionales son cruciales para los resultados.
    6. Medio basal Dejar enfriar en hielo y enfriar la centrífuga a 46; C.
    7. Calentar otra alícuota de medio basal a 37 ° C.
  2. Aislamiento de las glándulas
    1. Recoger aproximadamente 1 cm² de tejido en el hielo medio basal frío. Mantenga en hielo hasta su preparación. Si bien es preferible procesar el tejido lo más pronto posible, el tejido tienda en medio en el hielo si es necesario.
    2. Coloque el tejido en una placa de Petri de 10 cm y se cubre con tampón de quelación 1x frío. Lave moviendo suavemente hacia atrás y hacia adelante.
    3. Coloque el tejido en un lugar seco 10 cm placa de Petri. Con unas pinzas, retire con cuidado el moco, así como la capa muscular debajo de un microscopio estereoscópico. Lave el tejido en tampón quelante 1x fría moviendo suavemente hacia atrás y hacia adelante.
    4. Coloca 1 cm 2 de tejido en un nuevo seco placa de 10 cm, Petri. Con una tijera cortan en 20-50 pedazos pequeños de aproximadamente 2/5 del tamaño mm².
    5. Con unas pinzas, colocar todas las piezas en un tubo de 50 ml.
    6. Tome un 10 ml pipeta de plástico estéril. Humedezca la pipeta en tampón 1x quelante. Guardarel uso de esta misma pipeta durante todo el procedimiento.
    7. Añadir 10 ml de tampón quelante 1x frío al tubo de 50 ml. Lave las piezas pipeteando enérgicamente arriba y hacia abajo 10 veces. Deje que las piezas se asientan. Eliminar el sobrenadante.
    8. Repita el lavado (paso 1.2.7) hasta que el sobrenadante es claro. Esto tarda aproximadamente 50-100 ml de tampón 1x para el quelante 1 cm² de tejido humano.
    9. Incubar las piezas de tejido en 20 ml de tampón 1x quelante suplementadas con EDTA 10 mM a temperatura ambiente durante 10 min con suave invirtiendo cada 2 min.
      NOTA: El tiempo y la temperatura de esta incubación pueden optimizarse para cualquier velocidad y / o preservación de la arquitectura glandular. Ellos pueden ir de varias horas de incubación a 4 ° C en una plataforma de balanceo para 5 min a 37 ° C en un agitador con 200 rpm. Los buenos puntos de partida para el estómago de ratón son 30 min a 4 ° C en una plataforma de rodadura y para el estómago humano, 10 min a TA.
    10. Pipeta una vez suavemente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta 10 ml. Permitir la pieces se asienten. Eliminar el sobrenadante.
    11. El uso de la pipeta, transferir las piezas para una limpieza 10 cm placa de Petri. Retire el líquido.
    12. Coloque un portaobjetos de microscopía de vidrio en la parte superior de las piezas de tejido. Observe el tejido intacto bajo un microscopio invertido para el cultivo celular con aumento 10X.
    13. Aplique presión sobre la lámina de vidrio y placa de Petri. Mantenga tanto en la mano (con guantes estériles) y presionando el cristal con el dedo pulgar. El borde del tejido aparecerá nublado que indica que las glándulas son liberados fuera del tejido.
    14. Tenga en cuenta las glándulas liberados bajo un microscopio invertido para el cultivo celular con aumento 10X.
    15. Recoger las glándulas y tejidos en 30 ml de medio basal frío. Deje que los fragmentos de tejido grandes asientan.
    16. Recoger el sobrenadante que contiene glándulas en dos tubos de 15 ml.
    17. Centrifugar 5 min a 200 xg y 4 ° C. Sobrenadante Descartar. El sedimento contiene glándulas aisladas. Manténgalos en hielo.
  3. Siembra de las glándulas
    1. Para la siembra, mantener matriz sótano en todo momento en frío de hielo, por lo que permanecerá líquida.
    2. Alternativa 1: Semilla de 6 pocillos de una fila de dilución.
      1. Suspender el precipitado en 60 l de matriz sótano.
      2. Preparar 5 estériles tubos de 1,5 ml en hielo con conteniendo cada uno 50 l de matriz de sótano. Transferencia de 10 l de suspensión de matriz glándulas / sótano en el primer tubo de 1,5 ml. Suspender las glándulas y la transferencia de 10 l de esta solución a la siguiente tubo de 1,5 ml. Repita el procedimiento para los próximos tubos.
    3. Alternativa 2: Semilla una cantidad calculada de glándulas por pocillo. Comience con 100 glándulas por matriz, sótano 50 l en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
      1. Suspender cuidadosamente las glándulas sedimentadas en 10 ml de medio basal. Ponga 50 l en una limpia 10 ml placa de Petri. Contar el número de glándulas bajo un microscopio invertido para el cultivo celular con aumento 10X.
      2. Calcular la concentración de glándulas en la solución. Transferir el volumen que contains 400 glándulas a un nuevo tubo de 15 ml.
      3. Centrifugar 5 min a 200 xg y 4 ° C. Desechar el sobrenadante y mantener el tubo en hielo. Añadir 200 l matriz sótano y volver a suspender cuidadosamente. Mantenga en hielo.
    4. Tome la C 24 y placa caliente 37 ° (consulte el paso 1.1.2) de la incubadora. Coloque una gota de 50 glándulas mu l en la matriz sótano en el centro del pozo. La gota se forma una cúpula.
    5. Transferir con cuidado la placa posterior a la incubadora de cultivo de células. Deje que la matriz sótano solidificar 10 min.
    6. Preparar medio caliente con todos los factores de crecimiento.
      1. Para glándulas humanos: Suplemento el medio basal con los siguientes factores de crecimiento para organoides gástricas humanas: 50 ng / ml de EGF, 10% de medio noggin acondicionado, 10% de medio acondicionado-R-spondin1, 50% de medio Wnt acondicionado, 200 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 10, 1 nM gastrina, y 2 mM inhibidor de TGFbeta y 10 mM rho asociada bobina en espiral formando proteína serina / treonina quinasa inhibidor (RHOKi).
      2. Para glándulas murinos: Suplemento el medio basal con los siguientes factores de crecimiento para organoides gástricos ratón: 50 ng / ml de EGF, 10% de medio noggin acondicionado, 10% de medio R-spondin1 acondicionado, 50% de medio Wnt acondicionado, 100 ng / FGF10 ml, 10 nM gastrina, 0,5 mM inhibidor de TGFbeta y 10 mM RHOKi.
    7. Tome la placa de la incubadora. Añadir cuidadosamente 500 l medio con todos los factores de crecimiento (1.3.6) a cada pocillo sin alterar la matriz sótano. Coloque de nuevo a la incubadora.
    8. Actualizar el medio 3 veces por semana (cada 2-3 días). Por medio refrescante, eliminar el medio de edad con salir de la caída de la matriz basal intacta. Añadir con cuidado medio fresco, cálido, con todos los factores de crecimiento. No agregue RHOKi. Sólo añadir RHOKi directamente después de la siembra de las glándulas o después de la separación de los organoides (paso 2).

2. La aprobación de Gástrico organoides Cultura Antes de microinyección.

ove_content "> Nota: Cada tipo de cultura organoid tiene su propio tiempo de duplicación del ratón intestinal, así como cultivos gástricos se suelen dividir 1:. 5 cada 5-7 días culturas intestinales humanos se dividieron 1:.. 5 cada 10-12 días Humano culturas gástricos se dividen 1: 5 cada 14 días Si inició a partir de células individuales, organoides gástricos humanos también pueden tomar 20 días para formar adecuadamente Es una buena señal si las estructuras en ciernes rodean la luz central En este protocolo, organoides se dividen en... pocillos 4 para microinyección. Mantenimiento de organoides sigue el mismo protocolo, pero puede utilizar cualquier otra placa de cultivo celular, tales como placas estándar de cultivo celular de 24 pocillos.

  1. Preparación del material
    1. Pipetas Pasteur autoclave.
    2. El día antes de la aprobación, coloque una placa de cultivo celular 4 bien en la incubadora a 37 ° C. Los 4 pocillos tienen bordes bajos y permiten micromanipulación.
    3. Preparar la matriz sótano de acuerdo a la recomendación de los fabricantes. En el día de passaging, descongelar matriz sótano en el hielo.
    4. Preparar y diluir todos los factores de crecimiento de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
    5. Medio basal Dejar enfriar en hielo y enfriar la centrífuga a 4 ° C.
  2. Pasaje de las Culturas organoides
    1. Tome la placa con los organoides de la incubadora. Retire medio de un pozo.
    2. Añadir 1 ml de medio basal frío a la matriz sótano en el pozo. Usando una micropipeta 1 ml, pipetear enérgicamente arriba y hacia abajo hasta que la matriz sótano se divide. Transferir a un tubo de 15 ml. Coloque sobre hielo.
    3. Tome una pipeta Pasteur de vidrio y una fuente de fuego como un mechero Bunsen.
      1. Mantenga la punta de la pipeta en el fuego hasta que la abertura de la punta se ha reducido de 1,5 mm a 0,5 mm (Figura 1). Deje que la pipeta se enfría hasta TA.
      2. Humedezca la pipeta en medio basal. Una pipeta de manera óptima estrechado ocupará el medio visiblemente más lento que una pipeta un-reducido, pero aún así lo hará todoujo pipetear también.
    4. Recoger organoides en la pipeta y pipetear enérgicamente 10 veces arriba y abajo. La ruptura de los organoides se puede observar a simple vista.
    5. Añadir 9 ml de medio basal frío y centrifugar durante 5 min a 200 xg y 4 ° C.
    6. Deseche cuidadosamente todo el sobrenadante. Suspender el sedimento en 250 matriz sótano l. Mantenga en hielo.
    7. Tome la cálida placa de cultivo de 4 y 37 ° C y colocar una gota de matriz de 50 l organoides / sótano en cada pocillo.
    8. Transfiera la placa cuidadosamente de nuevo a la incubadora. Deje que la matriz sótano solidificar a 37 ° C durante 10 minutos.
    9. Preparar medio apropiado, ya sea para el ratón o humanos organoides como se indica en el paso 1.3.6.
    10. Tome la placa de la incubadora y superponer cada gota matriz sótano con 500 l de medio.
    11. La transferencia de la placa a la incubadora.
    12. Actualizar el medio 3 veces por semana cada 2-3 días (véase 1.3.8.).
    13. Para la congelación de los organoides, mechancamente perturbar organoides como se describe para la división en este protocolo (Pasos 2.2.1-2.2.5.). Suspender los fragmentos organoides en 500 ml de medio de congelación y congelar a -80 ° C utilizando criotubos y un recipiente de congelación. Para el almacenamiento a largo plazo, la transferencia de los tubos para nitrógeno líquido.
    14. Para descongelar organoides, preparar la placa de la cultura, la matriz de sótano, factores de crecimiento, medio frío y caliente como se indica en los pasos 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Calentar el vial congelado usando un baño de agua, y las células de transferencia inmediatamente después de la descongelación a un tubo de 15 ml con 10 ml de medio basal frío. Centrífuga y la placa de las células como se indica en 2.2.5 a 2.2.12.
      Nota: La microinyección de organoides es laborioso, pero permite la posibilidad única de estudiar la interacción en 3D.
    15. Si no se necesitan estudios 3D, sembrar organoides en dos dimensiones. Para ello, interrumpir los organoides como se establece en los pasos 2.2.1 al 2.2.6. Añadir medio 2.250 l fría con todos los factores de crecimiento de 250 l de ma sótanotrix con fragmentos organoides.
      1. De semillas en 5 pocillos de una placa de 24 pocillos con 500 l por pocillo. Cambie medio 3 veces por semana, con el reemplazo cuidadosamente los 400 l superiores solamente, para mantener la matriz de sótano en la parte inferior de la placa sin ser molestados.
        Nota: organoides adjuntará a la placa de cultivo celular y expandirse en 2D. La microscopía electrónica ha demostrado que el lado apical de las células se enfrenta el medio en el pocillo (datos no mostrados).
      2. Antes de la infección, intercambiar todo medio que incluye la matriz sótano, para permitir que las bacterias se adhieran a las células. Un protocolo similar se ha descrito también para la infección con H. 14 pylori. Capas de células 2D pueden no contener todos los tipos de células que están presentes en organoides 3D.

3. La microinyección de organoides Cultura.

Nota: Este protocolo se puede utilizar para microinyectar bacterias en organoides. Puede ser útil para iniciar la inyección con organoidesque son más permisivas para la microinyección. Por ejemplo, organoides gástricos ratón pueden convertirse en grandes organoides quísticas que son fáciles de atacar.

  1. Preparación del material
    1. Tire de un capilar de vidrio en dos agujas de inyección utilizando un extractor de micropipeta, de acuerdo a la recomendación de los fabricantes. El extractor de micropipeta calentará el capilar de vidrio en el medio y se tire del capilar en dos partes, generando de este modo dos agujas de vidrio. Es práctico para tirar varias agujas y almacenarlos en una placa de Petri limpia.
    2. Para permitir que la infección bacteriana, quitar los antibióticos de todos los medios de comunicación por lo menos 3 cambios de medio (= una semana). Esto diluirá antibióticos de matriz sótano. Si se utiliza una cepa bacteriana que es resistente a un antibiótico específico, añadir este antibiótico específico para reducir al mínimo las posibilidades de contaminación.
    3. Preparar la mesa de trabajo para microinyecciones. Para el trabajo a diferentes niveles de bioseguridad puede ser necesario colocar un estéreomicroscopio dentro de un banco estéril. En este protocolo, inyecte H. pylori bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones bajo un microscopio estereoscópico dentro de un banco estéril.
    4. Cultura las bacterias de acuerdo con protocolos estándar 13,23.
    5. Para estimar la multiplicidad de infección (MOI), estimar dos parámetros: el número de bacterias y el número de células por organoide como se indica a continuación. El MOI puede correlacionar con resultados, por ejemplo, con anfitriones IL-8 mRNA expresión 13.
      1. Para calcular la densidad bacteriana en la solución de la infección, primero establecer la curva estándar de unidades de densidad y formación de colonias ópticos (CFU) de acuerdo con protocolos estándar 24. Una densidad óptica de 0,1 a 550 nm debe producir aproximadamente 10 7 UFC / ml.
      2. Para estimar el número de células por organoid, cuente el número de organoides en 1 también. Interrumpir organoides como se indica en los pasos 2.2.1-2.2.4. Después de la centrifugación 5 min a 200 xg y 4 ° C,Añadir 1 ml de solución de disociación enzimática y resuspender.
        1. Incubar a 37 ° C con agitación durante repetida 5-10 min. Determinar si las células han disociado en células individuales bajo el microscopio (microscopio invertido Leica DMIL tales como un aumento de 10x). Si es necesario prolongar la incubación.
        2. Recuento de células por organoide utilizando un hemocitómetro y calcular el número de células por organoide. Organoides gástricas humanas con un diámetro de alrededor de 200 micras tienen aproximadamente 4.000 células. La inyección de 0,2 l de una solución bacteriana con 1 x 10 9 bacterias por ml resultados en una MOI aproximada de 50.
  2. La inyección de organoides.
    Nota: Para la microinyección, la aguja de vidrio se estabiliza en un soporte, que puede ser maniobrado en 3 dimensiones por un micromanipulador. Organoides permanecen dentro de la matriz sótano dentro del pozo. Debido al tamaño y la colocación en el pozo, no todos los organoides son igualmente unamenable de la inyección. Por lo general, los 30 organoides más grandes de un pozo pueden ser dirigidos en 5 min.
    1. Bacterias de la cosecha y se lavan en medio basal de acuerdo con los protocolos estándar 24.
    2. Calcular el número de bacterias por ml de acuerdo con la densidad óptica (véase el paso 3.1.5.1). Diluir las bacterias a 1 x 10 9 bacterias por ml en medio basal.
    3. Tome una aguja de vidrio. Uso de fórceps romper la punta de manera que la apertura será de aproximadamente 10 m de ancho.
    4. Inserte la aguja en el soporte de inyección y fijarlo a la micromanipulador.
    5. Toma aproximadamente 10 l solución bacteriana en la aguja.
    6. Coloque una placa de 4 bien con bordes bajos que contienen cultivos organoides bajo el microscopio estereoscópico.
    7. Navegación con el micromanipulador, apuntar una sola organoides con la aguja. Coloque la aguja cerca de la organoid y luego insertar la aguja en el organoid con un movimiento rápido. Inyectar approximately 0,2 l solución bacteriana en cada uno de organoides usando el microinyector.
  3. Organoides cosecha para cualquier análisis.
    1. Como ejemplo, fijar organoides después de 4 horas. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de formaldehído al 2% e incubar 20 minutos a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Organoides pueden ser procesadas para inmunohistoquímica acuerdo con procedimientos estándar 25.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Este protocolo permite el aislamiento de las glándulas gástricas (Figura 2). Las glándulas se siembran en la matriz sótano, que se solidifica como gota dentro de un pozo, proporcionando un marco dimensional 3 rica en laminina y colágeno para permitir que las glándulas crecen en organoides (Figura 3). Organoides típicamente comienzan como pequeños quistes y dentro de 12-16 días, se expanden en esferas con un diámetro de 50-300 micras de (Figura 4). Algunos organoides per...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Este protocolo describe el uso de organoides primarios no transformados en constante expansión de células madre adultas para la biología de la infección. Los pasos críticos son i) el aislamiento de glándulas viables, ii) la expansión de organoides y iii) la microinyección. A continuación se presentan algunas sugerencias de modificaciones, solución de problemas y consideraciones técnicas.

En comparación con otros métodos de aislamiento, que utilizan agitación o pipeteo vigorosos para liberar g...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Hans Clevers es inventor de varias patentes para el cultivo de organoides. De lo contrario, los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la beca Marie Curie de la UE (EU/300686-InfO) para S.B. y un Premio de Investigación de la Fundación Europea de Gastroenterología de las Naciones Unidas para H.C. Nos gustaría agradecer a Harry Begthel, Jeroen Korving y al Hubrecht Imaging Center por su asistencia técnica, a Meritxell Huch por su ayuda con el cultivo inicial de organoides y a Yana Zavros por la discusión.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio
HEPESInvitrogen15630-056
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
Matrigel, GFR, libre de fenolBD356231
GlutaMAXInvitrogen35050-079Concentración de stock 200 mM, concentración final 2 mM
B27Invitrogen17504-044 Concentración deexistencias 50 x, concentración final 1x
N-acetilcisteínaSigma-AldrichA9165-5GConcentración de existencias 500 mM, concentración final 1
mM EGF murino recombinanteInvitrogen PMG8043Concentración de existencias 500 µ g/ml, concentración final 50 ng/ml
Recombinante humano FGF10Peprotech100-26 Concentración deexistencias 100 y micro; g/ml, concentración final 200 ng/ml
TGFβ i A-83-01Tocris2939Concentración de existencias 500 µ M, concentración final 2 µ M 
NicotinamidaSigma-AldrichN0636Concentración de existencias 1 M, concentración final 10 mM 
[Leu15]-GastrinSigma-AldrichG9145Concentración de stock 100 µ M, concentración final 1 nM
RHOKi Y-27632Sigma-AldrichY0503Concentración de existencias 10 mM, concentración final 10 µ M
Wnt3A medioLínea celular estable generada en el Laboratorio Clevers. Concentración final 50%. Las células se pueden obtener de Hans Clevers.
Medio acondicionado R-spondin1 Líneacelular estable generada en el Laboratorio Kuo. Concentración final 10%. La línea celular se puede obtener de Calvin Kuo, Stanford.
Medio acondicionado Nogginen el Clevers Lab. Concentración final 10%. Las células se pueden obtener de Hans Clevers.
R-spondin3R& D3500-RS/CFFuente alternativa para R-espondina. Esto ha sido probado en organoides del intestino humano (1 y micro; g/ml), pero aún no en organoides gástricos.
NogginPeprotech120-10Fuente alternativa para noggin. Esto se ha probado en organoides del intestino humano (100 ng/ml), pero aún no en organoides gástricos.
TrypLE expressLife Technologies12605036solución de disociación enzimática 
CoolCell® Contenedores de congelación celular sin alcoholbiocisionBCS-405
Recovery Cell Culture Freezing MediumInvitrogen12648-010
Antibióticos
PrimocinInvivogenant-pm-1Una composición de antibióticos contra bacterias y hongos. Es útil después de la iniciación de una cultura. Para el cultivo a largo plazo, puede cambiar a otros antibióticos o a ninguno.
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogen15140-122Concentración de existencias 10.000/10.000 U/ml, concentración final 100/100 U/ml. Se puede utilizar como alternativa a Primocin en cultivo a largo plazo.
Otras
PinzasNeolabs2-1033Las pinzas con puntas finas son útiles para la eliminación de la capa muscular del tejido.
4 Platos Multiplato ThermoScientific 144444Puedes utilizar otros Multiplatos. Estos fueron particularmente útiles para las microinyecciones porque tienen un borde exterior bajo y permiten más movilidad para el manipulador.
MicromanipuladorNarishigeM-152
MicroinyectorNarishigeIM-5B
Microscopio estereoscópicoLeicaMZ75
WorkbenchCleanAir Hecho a medida para adaptarse al microscopio estereoscópico en condición ML2
Capilares HarvardApparatusGC100T-101 mm de diámetro exterior, 0,78 mm de diámetro interior.
Extractor de micropipetasSutter Instruments FlamingBrown Extractor
anti Cag Aanticuerpo Santa Cruzsc-25766
condicionado Línea celular estable generada de micropipetas

Referencias

  1. Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700(2012).
  2. Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13(2013).
  3. Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
  4. Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
  5. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  6. Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617(2012).
  7. Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
  8. Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
  9. Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
  10. Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
  11. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  12. McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  13. Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
  14. Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
  15. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663(2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  19. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  20. Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  21. Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  22. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  23. Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21(2010).
  24. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
  25. Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
  26. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
  27. Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
  28. Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
  29. Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  30. Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871(2013).
  31. Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
  32. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  33. Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
  34. Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Organoides gástricoscultivo de organoidestécnica de microinyecciónglándulas gástricasmatriz basalfactores de crecimientocultivo celulartinción inmunohistoquímicamodificaciones genéticas
Organoides como Modelo para Enfermedades Infecciosas: Cultura de Derechos Humanos y organoides estomacales murinos y microinyección de Helicobacter Pylori
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.