Introduction
Punktet af influenza A-virus (IAV) er en multi-trins proces, der begynder med bindingen af virusset til receptorer på plasmamembranen af målceller 1. Receptoren for IAV er sialinsyre, der er til stede på en lang række glycoproteiner og glycolipider. Hæmagglutinin (HA) protein af IAV som er til stede i viruskappen binder til sialinsyre og derved medierer binding af viruspartiklerne til plasmamembranen af målceller 2. Virus ind i cellerne via clathrin endocytose men også alternative tilgangsvinkler veje, såsom macropinocytosis, er blevet beskrevet 3-6. Samspillet mellem HA og sialinsyre synes at være tilstrækkeligt til at mediere både, tilknytning og udløser internalisering af viruspartikler 7. Ikke desto mindre har alternative indrejse receptorer blevet foreslået og deres roller i IAV post er i øjeblikket ved at blive undersøgt 1,8,9.
Curblikket, der gøres en indsats for at identificere vært faktorer, der er involveret i den virale livscyklus med henblik på at udvikle et presserende behov for nye antivirale behandlinger 10-12. Virus post ville være en gunstig skridt til at målrette IAV vækst for at blokere virusinfektion på sit tidligste punkt. Måling forskellige stadier af IAV post eksperimentelt er udfordrende som regel store mængder virus er forpligtet til at opdage indkommende virus. Desuden detektionsområdet for ændringer i virus post er kun lineær på grund af manglen på viral replikation. Dette understreger behovet for analyser med høj følsomhed.
Assayet vi præsenterer her muliggør påvisning fæstnede virus på celleoverfladen samt påvisning af internaliseret virus i forhold til den samlede mængde af celleassocieret virus. Anvendelsen af biotinylerede vildtype virus muliggør praktisk måling ved farvning med STV-Cy3 og udlæsning ved flowcytometri. Biotinyleret virus er koldt bundet til cellens at tillade fastgørelse men forhindrer internalisering af viruspartikler. Celler kan fikseres, permeabiliseret og farvet med STV-Cy3 at måle bundet virus. Signalet fra ekstracellulære, der er knyttet virioner kan ophæves, hvis et blokerende trin anvendes før fiksering, hvor cellerne inkuberes med ikke-mærket streptavidin (STV). I et næste trin, efter binding af biotinyleret IAV, er temperaturen ændret til 37 ° C og internalisering af viruspartikler tillades at finde sted. Internaliserede partikler er beskyttet mod binding af STV derved at tillade diskriminering mellem ekstra- og intracellulære virus.
Per eksperimentel tilstand, er fire prøver kræves: 0 min «: Den første prøve, mærket '0 min", er at måle kold-bundet virus på celleoverfladen. '0 min + STV «: Den anden prøve, mærket' 0 min + STV«, giver baseline signal intensiteten af forsøget. Vedhæftet virus bliver blokeret with STV og signalet efter farvning med STV-Cy3 bør være meget lavere sammenlignet med den "0 min" prøve. '30 Min ': Den tredje prøve, '30 min' indeholder vedhæftede og internaliseres virus på grund af temperaturskift til 37 ° C i 30 minutter. '30 Min + STV «: Den fjerde prøve, '30 min + STV« foranstaltninger den intracellulære fraktion af virus. STV blokeringstrin påføres efter 30 min inkubationsperiode. Som et resultat, er virale partikler ved celleoverfladen bundet af STV efterlader kun internaliserede vira tilgængelig for farvning med STV-Cy3. Den relative mængde af internaliseret virus kan beregnes som forholdet mellem internaliseret virus (målt i '30 min + STV 'prøve) divideret med den totale mængde af virus (beskrevet af '30 min' prøve).
Som kontroller foreslår vi at inkludere mock-inficerede celler. Signalet efter STV-Cy3 farvning af mock-inficerede celler giver baggrundensom følge af farvningsprotokollen. En kontrol for IAV vedhæftede fil er forbehandlingen af celler med bakteriel neuraminidase (NA). NA fraspalter sialinsyre fra cellulære glycoproteiner, og derved fjerne vedhæftede receptorer fra celleoverfladen. Natriumazid (SA) er en potent inhibitor metabolisk og derved blokerer endocytose 13. Celler behandlet med natriumazid skal være positiv for virus, bindende, men negative for internalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk før start: Brug laminar flow hætte og passende biologisk indeslutning, når man arbejder med levende virus. Her beskriver vi vækstbetingelser egnede til kultur influenzavirusstamme A / WSN / 33. Infektionsmultiplicitet (MOI) og inkubationstider kan variere efter virusstamme, der anvendes.
1. Fremstilling af biotinyleret A / WSN / 33 virus
- Seed Madin Darby hunde-kindey (MDCK) celler i en T175 cm2 kolbe under anvendelse af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (Pen / Strep). Dyrke celler ved 37 ° C indtil ca. 70% konfluens er nået.
- Før infektion, fjern medium og vask cellerne med phosphatbufret saltvand (PBS, pH7.0-7.3) ved tilsætning af en tilstrækkelig stor mængde til at dække cellemonolaget.
- Fjern PBS og inficere celler med A / WSN / 33 med en MOI på 10 -4. Fortynd virus i PBS suppleret med 0,02 mg Mg 2+, 0,01 mg Ca2 + </ sup>, 0,3% bovint serumalbumin (BSA) og 1% Pen / Strep (infektion-PBS). Brug et inokulum på 4 ml til T175 cm kolbe 2.
- Cellerne inkuberes 1 time ved 37 ° C. Fjern inoculum ved aspiration og pipette 10 ml DMEM suppleret med 0,3% BSA, 20 mM HEPES og 1% Pen / Strep ind i kolben.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C i ca. 3 dage, indtil cytopatisk effekt (CPE) er synlig, og derefter høst supernatant. CPE kan anerkendes som afrunding af celler efterfulgt af frigørelse og død af celler 14.
- Spin supernatanten ved 450 xg i 5 minutter for at fjerne cellerester. Overfør supernatanten til et nyt falk rør og gentage dette trin en gang mere. Kassér pillerne.
- Overfør supernatanterne til ultracentrifugerør og underlag supernatanter med 5 ml 30% sucrose fortyndet i NTE-buffer (10 mM Tris [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Balance rør før ultracentrifugering og fylde op med PBS for at nå en ende volumen på 30 ml. Spin supernalenter på 112.398 xg (svarende til 25.000 rpm i en SW28 rotor) i 90 minutter i en ultracentrifuge.
- Fjern forsigtigt supernatanten ved pipettering og suge virus pellet natten over ved 4 ° C i 250 pi PBS. Resuspender pellet ved pipettering op og ned. Mål proteinindholdet i oprenset virus ved Bradford assay 15.
- Brug en biotinyleringskit at generere biotinylerede A / WSN / 33. Følg anvisningerne fra producenten.
- Kort sagt, tilsættes en passende mængde af biotin til det oprensede virus og inkuberes i 2 timer på is. Overfør virus til en ultracentrifugerør og fylde røret med PBS for at nå frem til en slutvolumen på 30 ml. Spin virus ved 112.389 xg i 90 minutter i en ultracentrifuge. Fjern supernatanten ved pipettering og der tilsættes 250 pi PBS. Soak pellet natten over ved 4 ° C. Portion og gemme det biotinylerede virus opbevares ved -80 ° C, hvor den vil være stabil i mindst 24 måneder.
BEMÆRK: Det kan være nyttigt at bestemme titeren af det biotinylerede preparation af IAV ved standard plaque assay. Imidlertid bør det bemærkes, at den efterfølgende protokol kun vil måle biotinylerede viruspartikler. Resterende ikke-biotinylerede partikler på grund af ufuldstændig biotinylering vil bidrage til den infektiøse titer ved plaque assay, men ikke til signalet målt i den vedhæftede fil / internalisering assay.
2. Bestem den nødvendige mængde af biotinyleret Virus
BEMÆRK: Før fastgørelse / internalisering assayet udføres, er det vigtigt at bestemme mængden af biotinyleret virus kræves for at inficere alle celler i en prøve.
- Kultur og Trypsinisér A549-celler i overensstemmelse med producentens anvisninger. Tæl celler ved hjælp af en celle kammer. Pipette 200.000 A549-celler i FACS Deepwell rør. Spin 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet med 200 pi PBS. Cool celler ned på is i 10 min.
- Forbered 5-fold serielle fortyndinger af biotinylated virus lager i infektion-PBS.
- Spin rør indeholdende cellerne ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet med 100 pi virus-holdige infektion-PBS. Som mock kontrol brug infektion-PBS uden biotinyleret virus. Inkuber rørene på is i 1 time.
- Spin rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 pi PBS. Gentag dette trin en gang mere.
- Til fiksering, spin-rør ved 4 ° C i 3 min ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 100 pi 3,7% paraformaldehyd (PFA). Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Gentag derefter vaske trin beskrevet i 2.4).
- For permeabilisering, spin-rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 100 pi PBS indeholdende 0,5% Triton X-100. Der inkuberes i 6 minutter ved stuetemperatur. Gentag derefter vaske trin beskrevet i 2.4).
- Spin rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender hulteret i 50 pi 2% BSA fortyndet i PBS indeholdende STV-Cy3. (Bemærk, bør passende koncentration af STV-Cy3 bestemmes før start eksperimentet Start med en koncentration på 1:. 200 og prøve 2 gange fortyndinger op til 1:. 2.400 i vores hænder, en fortynding på 1: 1.000 bevist at være optimal.)
- Der inkuberes 1 time i mørke ved stuetemperatur. Derefter skal du gentage vaskningstrin beskrevet i 2.4, men pellet resuspenderes i 200 pi 2% BSA fortyndet i PBS.
- Analysere prøver ved flowcytometri 16. Gate på Cy3-positive population. Vælg den laveste koncentration af biotinyleret virus resulterer i det maksimale antal Cy3-positive celler i A549 population.
3. Bestem den nødvendige mængde af Streptavidin
BEMÆRK: Effektiviteten af blokerende signalet afledt af ekstracellulære virus bestemmer detektionsområdet af assayet. Derfor er det vigtigt at ophæve STV-Cy3 signal så meget som muligt. The nødvendige mængde STV behov afhænger af mængden af biotinyleret virus materiel, der anvendes (bestemt i punkt 2).
- Følg trin 2.1-2.4, men brug virus koncentration bestemt i punkt 2.
- Fremstilles fem-fold seriefortyndinger af STV fortyndet i PBS indeholdende 2% BSA og 0,1% natriumazid.
- Spin rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 50 pi STV fortynding. Som mock anvendelse kontrol PBS indeholdende 2% BSA og 0,1% natriumazid uden STV. Inkuber rørene i 30 minutter på is. Derefter skal du gentage vasketrin beskrevet i 2.4.
- Følg trin 2,5-2,9. For internalisering assay vælge den laveste koncentration af STV resulterer i en stærk blok af Cy3-signal (i forhold til prøven, hvor der ikke var til stede STV). Til dette kan anvendes procentdelen af Cy3-positive celler eller den gennemsnitlige fluorescensintensitet af Cy3 signal. Ideelt set bør Cy3 signal STV-behandlede prøver være så tæt på signalet fra mock-inficeredeceller som muligt.
4. Attachment / Internalisering assay
BEMÆRK: Sørg for at forberede alle reagenser, før du starter analysen. For de tre kontrolgrupper præsenteret i resultatafsnittet (mock inficerede celler, neuraminidase præ-behandlede celler og natriumazid behandlede celler) små ændringer i protokollen.
- Forbered 16 dybbrøndsplader indeholdt hvert 200.000 A549-celler. Desuden forsøgsopstillingen bestående af 4 rør, der er 3 kontrolbetingelser, hver kræver 4 rør: mock-inficerede celler, neuraminidase (NA) -pretreated celler og natriumazid-behandlede celler. Hver gruppe består af 4 rør materiale, 0 min ',' 0 min + STV «, '30 minutter ', '30 min + STV«.
- Spin rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 pi PBS.
- Spin rør ved 4 ° C ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender hulteret i 200 pi DMEM indeholdende 0,3% BSA, 20 mM HEPES og 1% penicillin-streptomycin (inkubationsmedium). Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
BEMÆRK: For neuraminidase kontrol: Brug bakteriel neuraminidase (f.eks sialidase fra Vibrio cholerae) i en koncentration på 200 mU / ml fortyndet i inkubationsmedium at resuspendere cellerne. - Spin rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 pi PBS. Gentag dette trin en gang mere, så fede rør ned på is i 10 min.
- Spin rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 100 ul biotinylerede virus (brug koncentrationen virus bestemt i punkt 2 fortyndet i infektion-PBS). Der inkuberes 1 time på is. Derefter skal du gentage vasketrin beskrevet i 2.4.
BEMÆRK: mock-inficerede kontrol: Brug infektion-PBS uden virus. For natriumazid kontrol: Brug virus fortyndet i PBS-infektion suppleret med 0,1% natriumazid. - Proforarbejdning af prøverne efter infektionen på is:
- For de "0 min" prøver at følge trin 2.5 og gemme prøver ved 4 ° C, indtil de andre prøver er faste.
- For den "0 min + STV 'prøver, spin-rør ved 4 ° C i 3 min ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 50 pi STV (brug koncentrationen bestemt i punkt 3) fortyndet i PBS indeholdende 2% BSA og 0,1% natriumazid (for at forhindre internalisering mens håndtering af prøven). Der inkuberes 30 minutter på is. Følg trin 2,4-2,5 og gemme prøver ved 4 ° C.
- For de '30 min 'prøver, spin rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 pi PBS indeholdende 2% BSA. Inkuber 30 minutter ved 37 ° C. Følg trin 2,4-2,5 og gemme prøver ved 4 ° C.
BEMÆRK: For natriumazid kontrol: Brug PBS suppleret med 2% BSA og 0,1% natriumazid til 30 minutters inkubation ved 37 ° C. - For »30 min + STV 'prøver spinde rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 pi PBS indeholdende 2% BSA. Inkuber 30 minutter ved 37 ° C. Derefter spin-rør ved 4 ° C i 3 minutter ved 450 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 50 pi STV (brug koncentrationen bestemt i punkt 3) fortyndet i PBS indeholdende 2% BSA og 0,1% natriumazid (for at forhindre internalisering mens håndtering af prøven). Der inkuberes 30 minutter på is. Følg trin 2,4-2,5 og gemme prøver ved 4 ° C.
BEMÆRK: For natriumazid kontrol: Brug PBS suppleret med 2% BSA og 0,1% natriumazid til 30 minutters inkubation ved 37 ° C.
- Følg trin 2.6-2.8 og analysere prøver ved flowcytometri. Bestemme procentdelen af Cy3-positive celler i hver prøve.
- Beregn procentdelen vedlagte virus og den relative mængde af internaliseret virus.
- For at beregne mængden af vedhæftede virus, skal du bruge den procentdel af Cy3-positive gated celler eller den gennemsnitlige fluorescensintensitet af Cy3 signal. Til sammenligning indstille ubehandlede celler til 100% (figur 4B).
BEMÆRK: Procentdelen af bundet virus er beskrevet ved "0 min" prøve. - For at beregne mængden af internaliseret virus, tage forholdet mellem "30 min + STV" prøve til "30 min" prøve (figur 5B).
BEMÆRK: Som nævnt ovenfor, kan anvendes procentdelen af Cy3 positive gated celler eller den gennemsnitlige fluorescensintensitet af Cy3 signal.
- For at beregne mængden af vedhæftede virus, skal du bruge den procentdel af Cy3-positive gated celler eller den gennemsnitlige fluorescensintensitet af Cy3 signal. Til sammenligning indstille ubehandlede celler til 100% (figur 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tegneserie beskriver de fire forskellige eksperimentelle betingelser er vist i figur 1 Resultater af et repræsentativt forsøg er vist i figur 2 -. 5. I "0 min" prøve, biotinyleret virus er koldt bundet til at målrette celler, der kan visualiseres ved STV-Cy3-farvning (figur 1 og 2). Når et blokerende trin (i "0 min + STV" prøve) anvendes, kan virus ved celleoverfladen ikke længere detekteres ved STV-Cy3 farvning. Som et resultat, er signalintensiteten i "0 min + STV" prøve stærkt reduceret i forhold til "0 min" prøve (figur 1 og 2). Ved at hæve temperaturen til 37 ° C, er knyttet virus optages i cellerne ("30 min" prøve). Internaliserede virus er ikke følsom over for blokering med umærket STV hvilket resulterer i en mindre dramatisk fald i signal intensitet i & #8220; 30 min + STV "prøver i forhold til" 30 min "prøve, hvor der ikke STV blokering blev anvendt (Figur 1 og 2).
Som kontroller vi ansat mock-infektion, NA behandling og SA behandling. Figur 3 viser den procentvise andel af Cy3-positive celler for alle forsøgsbetingelser, der er beskrevet i afsnit 4. Mock-inficerede celler giver baggrunden signalintensitet til eksperimentet og handle som negativ kontrol for virus vedhæftet fil (figur 4). En ekstra kontrol for virus vedhæftede fil er behandling med bakterielt udtrykte NA. NA fjerner sialinsyre, receptoren for IAV fastgørelse, fra glycoproteiner på celleoverfladen og derved reducerer binding af virus til målceller 17. Som vist i figur 4, behandling med NA kraftigt ophæver IAV fastgørelse med ca. 90% i forhold til ubehandlede celler. Med hensyn til internalisering, brugte vi SA som kontrol. SA tr eatment straks udtømmer cellulære ATP niveauer og derved hæmmer energiforbrugende processer såsom endocytose 13. Inkubation af celler med SA under og efter infektion inhiberes internalisering af viruspartikler. Den relative mængde af internaliseret virus (afbildet i figur 5) blev forhøjet fra ca. 10% til 45% ved inkubering ved 37 ° C i 30 minutter i ubehandlede celler. Efter SA behandlingen imidlertid procentdelen af relative internaliseret virus var omkring 15% for både, cellerne blev inkuberet i 0 og 30 minutter ved 37 ° C. Dette indikerer, at ja, SA reducerer den effektive optagelse af viruspartikler i celler.
Figur 1. Princip for analysen. Cartoon forklarer princippet om den vedhæftede fil / internalisering assay.= "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. repræsentativt resultat for IAV binding og internalisering. (A) Histogram, der viser signalintensiteten af Cy3 signal for ubehandlede celler. Vist er "0 min", "0 min + STV", "30 min" og "30 min + STV" prøve. (B) Procentdel af Cy3-positive celler fra A. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentant resultat til fastgørelse og internalisering herunder kontrol. rong> Procentdel af Cy3-positive A549 celler efter angivne behandling. Vist er mock-smittede, ubehandlet, NA-behandlede og SA-behandlede celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Hæmning af virus fastgørelse af neuraminidase. (A) Histogram, der viser Cy3 signalintensiteten af "0 min" prøver. Vist er ubehandlede celler (i blåt) og to kontrolprøver: mock-inficerede og NA-behandlede celler (i rød og orange, henholdsvis). (B) Procentdel af Cy3-positive celler fra A. Vist er mock, ubehandlet og NA-behandlede celler fra "0 min" prøve. Værdien for ubehandlede celler blev sat til 100%.dk / filer / ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Inhibering af virus internalisering af natriumazid (SA). (A) Histogram, der viser Cy3 signalintensiteten af "30 minutter" og "30 min + STV" prøver fra ubehandlede (i rødt og orange, henholdsvis) og SA- behandlet (i blå og grønne henholdsvis) celler. (B) Procentdel af relativ internaliseret virus fra ubehandlede og SA-behandlede celler efter 0 og 30 minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores protokol beskriver en nem måde at måle virus binding og internalisering ved hjælp af flowcytometri. Det tillader brugen af mærket vildtype virus, som efterligner i højere grad virusinfektioner i forhold til anvendelsen af viruslignende partikler (VLP). Mens vores protokol er blevet optimeret til at måle binding og internalisering af IAV det kan nemt tilpasses til andre vira. Hertil kommer, som flowcytometri anvendes til udlæsning, co-farvninger kan nemt tilføjes til protokollen f.eks at teste ekspressionsniveauer efter knockdown eller overekspression af et protein af interesse. Således assayet tillader, at ændringer i protokollen afhængigt af de individuelle behov. Af note, kan assayet også udføres for en række tidspunkter til måling af virus internalisering over tid og få kinetiske oplysninger. Dette kan være særlig vigtigt, hvis analysen skulle tilpasses til en anden virus med ukendte internalisering kinetik.
However, skal det bemærkes, at vinduet for opdagelse er relativt små som forskelle i tilknytning eller internalisering forekommer på en lineær skala på grund af fraværet af viral replikation. For at øge tilliden og for at reducere støj, anbefaler vi herunder kontrol (f.eks kontrollerne beskrevet ovenfor) og flere gentagelser. Mens resultaterne vist skildrer en repræsentativt eksperiment, observerede vi god konsistens på tværs af forskellige eksperimenter: For eksempel til fastgørelse, procentdelen af Cy3-positive celler varierede fra 60-80%; for internaliserede virus vi opnåede værdier på mellem 40-60%.
Før analysen startes, er det vigtigt at titrere arbejder koncentrationer af de anvendte reagenser, såsom STV, STV-Cy3 og mængden af biotinyleret virus. Bemærk venligst, at mængden af reagenser og inkubationstider kan variere afhængigt af cellelinjen og virusstamme, der anvendes. For at maksimere vinduet for afsløring, procentdelen af celler positive for virus attachment bør være så højt som muligt i "0 min og" 30 min "prøve (afhængigt af mængden af biotinyleret virus anvendes) og så lavt som muligt i" 0 min + STV "prøve (afhængigt af mængden af STV anvendte ). Desuden kan støjen reduceres ved at holde cellerne ved 4 ° C under centrifugering og ved vask med iskold PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra den schweiziske National Science Foundation (31003A_135278) til SST. MOP er modtageren af et ph.d.-bevilling fra AXA Research Fund. Vi takker Patricia Nigg om hjælp med design af figur 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
References
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
