Presentamos un protocolo que describe un método semicuantitativo para medir tanto la unión del virus de la influenza A a las células A549, como la internalización de partículas virales en las células objetivo mediante citometría de flujo.
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Artículo de método
Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo
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Resumen
Resumen
La unión a las células diana seguida de la internalización son los primeros pasos del ciclo de vida del virus de la gripe A (IAV). Proporcionamos aquí un protocolo detallado para medir los cambios relativos en la cantidad de partículas virales que se adhieren a las células A549, una línea celular epitelial del pulmón humano, así como en la cantidad de partículas que se internalizan en la célula. Utilizamos virus biotinilados, que se pueden detectar fácilmente después de la tinción con estreptavidina marcada con Cy3 (STV-Cy3). Describimos el crecimiento, purificación y biotinilación de A/WSN/33, una cepa de laboratorio de IAV ampliamente utilizada. Las partículas IAV biotiniladas unidas en frío en células A549 se tiñen con STV-Cy3 y se miden mediante citometría de flujo. Para investigar la absorción de partículas virales, se permite que el virus unido al frío se internalice a 37 °C. Para diferenciar entre partículas virales externas e internalizadas, se aplica un paso de bloqueo: los puntos de unión libres en la biotina del virus adherido a la superficie celular se unen a la estreptavidina (STV) no marcada. La posterior permeabilización celular y la tinción con STV-Cy3 permiten la detección de partículas virales internalizadas. Presentamos un cálculo para determinar la cantidad relativa de virus internalizado. Este ensayo es adecuado para medir los efectos de los tratamientos farmacológicos u otras manipulaciones sobre la fijación o internalización de la IAV.
Introducción
La entrada de los virus de influenza A (IAV) es un proceso de múltiples pasos que comienza con la unión del virus a los receptores en la membrana plasmática de las células diana 1. El receptor para IAV es el ácido siálico que está presente en una gran variedad de glicoproteínas y glicolípidos. La hemaglutinina (HA) de proteína de IAV que está presente en la envoltura viral se une al ácido siálico y por lo tanto media en la unión de las partículas virales a la membrana plasmática de las células diana 2. El virus entra en las células a través de endocitosis mediada por clatrina, sino también a las vías de entrada alternativos, como macropinocitosi....
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Protocolo
Nota antes del comienzo: la campana de flujo laminar y Uso biocontención adecuada cuando se trabaja con virus vivo. A continuación, describimos las condiciones de crecimiento adecuadas a la tensión virus de la influenza cultura A / WSN / 33. Multiplicidad de infección (MOI) de incubación y tiempos pueden variar dependiendo de la cepa de virus utilizada.
1. Preparación de biotinilado A / WSN / 33 Virus
- Las células en un matraz T175 cm 2 utilizando Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) Madin-Darby Seed kindey canino (MDCK). Células de culti....
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Resultados
Un dibujo animado que describe las cuatro condiciones experimentales diferentes se muestra en la Figura 1 Los resultados de un experimento representativo se presentan en las Figuras 2 -. 5. En la muestra "0 min", virus biotinilado es frío unida a células que pueden ser visualizadas por tinción STV-Cy3 objetivo (Figuras 1 y 2). Cuando se aplica una etapa de bloqueo (en el "0 min + STV" muestra), el vi.......
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Discusión
Nuestro protocolo describe una manera fácil de medir la fijación del virus y la internalización por citometría de flujo. Se permite el uso de virus de tipo salvaje marcado que imita más estrechamente las infecciones de virus en comparación con el uso de partículas similares a virus (VLP). Mientras que nuestro protocolo se ha optimizado para medir unión e internalización de IAV puede ser fácilmente adaptado para otros virus. Además, como la citometría de flujo se utiliza para la lectura, los compañeros de tinciones puede.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (31003A_135278) para SSt. MOP es el beneficiario de una beca de doctorado del Fondo de Investigación AXA. Agradecemos a Patricia Nigg en busca de ayuda con el diseño de la figura 1.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-sacarosa | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTINA kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| tubos de pocillos profundos (microtubos de 1,2 ml) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Ciencias de la microscopía electrónica | 15710 | |
| tubos de ultracentrífuga | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| azida de sodio | Fluka | 71290 | |
| neuraminidasa bacteriana/ sialidasa | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
Referencias
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K.
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Reimpresiones y permisos
