Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Resumen

El pH fagosomal influye en la maduración del fagosoma, la producción de oxidantes, la eliminación del fagosoma y la presentación de antígenos. Aquí describimos un método radiométrico para medir los cambios de pH en el curso del tiempo y el punto final en fagosomas individuales en fagocitos vivos utilizando microscopía de fluorescencia.

Resumen

La fagocitosis es un proceso fundamental a través del cual las células inmunitarias innatas engullen las bacterias, células apoptóticas u otras partículas extrañas con el fin de matar o neutralizar el material ingerido, o presentarlo como antígenos e iniciar la respuesta inmune adaptativa. El pH de los fagosomas es un parámetro crítico regulación de fisión o fusión con endomembranes y la activación de las enzimas proteolíticas, eventos que permiten la vacuola fagocítica a madurar en un orgánulo degradativa. Además, se requiere la translocación de H ⁺ para la producción de altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), que son esenciales para la matanza eficiente y señalización a otros tejidos del huésped. Muchos patógenos intracelulares subvierten asesinato fagocitosis mediante la limitación de la acidificación phagosomal, destacando la importancia del pH en la biología fagosoma. Aquí se describe un método radiométrico para la medición de pH phagosomal en los neutrófilos utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con zymosan como targ fagocíticaets y imágenes de células vivas. El ensayo se basa en las propiedades de fluorescencia de FITC, que se inactivó mediante pH ácido cuando se excita a 490 nm pero no cuando se excita a 440 nm, lo que permite la cuantificación de una relación dependiente del pH, en vez de la fluorescencia absoluta, de un solo colorante. También se proporciona un protocolo detallado para llevar a cabo en la calibración de tinte situ y la conversión de la relación de a valores de pH real. Métodos radiométricos de un solo tinte se consideran en general superior a la longitud de onda única o protocolos pseudo-radiométrica de doble tinte, ya que son menos sensibles a las perturbaciones tales como blanqueo, se centran cambios, variaciones láser y etiquetado irregular, que distorsionan la señal medida. Este método se puede modificar fácilmente para medir el pH en otros tipos de células fagocíticas, y zymosan puede ser reemplazado por cualquier otra partícula que contiene amina, a partir de perlas inertes a los microorganismos vivos. Por último, este método puede ser adaptado para hacer uso de otras sondas fluorescentes sensibles a diferentes intervalos de pH o de otros phagosomactividades al, por lo que es un protocolo generalizado para la proyección de imagen funcional de fagosomas.

Introducción

La fagocitosis, el proceso a través del cual las células inmunitarias innatas engullen partículas grandes, evolucionó a partir del mecanismo de alimentación de los organismos unicelulares, e implica unirse a un objetivo, envolverlo con una membrana y pellizcar la membrana para formar una vacuola dentro del citosol llamada fagosoma. Mientras que la membrana fagosomal se deriva de la membrana plasmática, la clasificación activa de proteínas y lípidos, así como la fusión con endomembranas durante la formación de fagosomas, transforman el fagosoma en un orgánulo distinto dentro de la célula con propiedades degradativas que permiten la eliminación, neutralización y descomposición del material ingerido^1-3. Este proceso, llamado maduración fagosomal, se basa en la entrega de una gran cantidad de enzimas proteolíticas y microbicidas, incluida la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa, que transfiere electrones a los fagosomas que producen el oxidante fuerte_O2^- y sus especies reactivas derivadas de oxígeno (ROS) ^2,4.

El pH luminal de los fagosomas tiene una profunda influencia en varios eventos necesarios para la función del fagosoma. En primer lugar, el pH influye en el tráfico de endomembranas en general, ya que los cambios conformacionales dependientes del pH de los reguladores del tráfico transmembrana alteran el reclutamiento de determinantes del tráfico como Arfs, Rabs y proteínas de la cubierta vesicular, que a su vez definen qué vesículas pueden fusionarse con los fagosomas ^5-8. En segundo lugar, la composición iónica del lumen fagosomal también se transforma a medida que los fagosomas maduran, y algunos transportadores de iones, como el intercambiador de Na⁺/H⁺ o los antiportadores ^Cl-/H⁺ de la familia ClC, que promueven la función fagocítica, dependen de la translocación de H^{+ 9,10}. Del mismo modo, la producción de ROS está íntimamente relacionada con el pH fagosomal. Las ROS y sus subproductos oxidantes tóxicos han sido reconocidos durante mucho tiempo como cruciales para la muerte fagosomal en los neutrófilos ^4,11,12, y se ha demostrado que desempeñan un papel fundamental en otros fagocitos, incluidos los macrófagos, las células dendríticas (CD) y las ^{amebas 13-16}. La NADPH oxidasa es una enzima electrogénica que libera H⁺ en el citosol a medida que se consume NADPH, y que requiere la transferencia simultánea de H⁺ a través de canales HVCN1 asociados junto con los electrones transportados al lumen fagosomal, con el fin de aliviar la despolarización masiva que de otro modo conduciría a la autoinhibición de la enzima ^17-21. Finalmente, varias enzimas proteolíticas tienen una actividad óptima a diferentes pH, por lo que los cambios en el pH fagosomal dependientes del tiempo pueden influir en qué enzimas están activas y cuándo. La importancia del pH fagosomal es resaltada por organismos como Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis y Salmonella typherium que subvierten la muerte fagocítica al menos en parte al alterar el pH fagosomal ^22-24.

En los mamíferos, los fagocitos principales son los neutrófilos, los macrófagos y las células dendríticas, y dependiendo del tipo de célula, los cambios en el pH fagosomal dependientes del tiempo pueden variar ampliamente y parecen desempeñar diferentes funciones. En los macrófagos, una acidificación fuerte y rápida mediada por la ATPasa vacuolar (V-ATPasa) de la bomba de protones dependiente de ATP es uno de los factores clave que median la muerte ^25-27, asemejándose a los mecanismos presentes en las amebas que utilizan la fagocitosis como mecanismo de alimentación ²⁸. En estas células, se cree que la activación de las proteasas ácidas desempeña un papel clave. Por el contrario, la eliminación de neutrófilos depende más de las ROS que del HOCl producido por la mieloperoxidasa (MPO)¹¹, y el pH permanece neutro o alcalino durante los primeros 30 min, acidificándose solo más tarde ^29,30. Se ha sugerido que el pH neutro favorece la actividad de las proteasas oxidativas, como ciertas catepsinas. En las CD, el pH fagosomal es controvertido, ya que algunas reportan acidificación y otras pH neutro o alcalino ^31,32, pero las ROS y el pH pueden influir profundamente en la capacidad de estas células para presentar antígenos a las células T, una de sus principales funciones ³³.

Es importante destacar que las hormonas, quimiocinas y citocinas pueden producir eventos de señalización que inducen la maduración y cambios en el comportamiento de los fagocitos, y a su vez influyen en el pH fagosomal ^34,35. Del mismo modo, los fármacos, por ejemplo la cloroquina antipalúdica, que también se considera para las terapias contra el cáncer ³⁶, pueden afectar al pH fagosomal y, por lo tanto, a los resultados inmunitarios. Por lo tanto, una variedad de biólogos celulares, inmunólogos, microbiólogos y desarrolladores de fármacos pueden estar interesados en medir el pH fagosomal cuando buscan comprender los mecanismos subyacentes a los efectos de una disrupción genética particular, un compuesto bioactivo o un microorganismo en las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas.

Aquí describimos un método para medir el pH fagosomal en neutrófilos que nos permitió mostrar la importancia del canal HVCN1 en la regulación del pH fagosomal de neutrófilos ¹⁹. El método se basa en la propiedad radiométrica del isotiocianato de fluoresceína (FITC), cuya emisión de fluorescencia a 535 nm es sensible al pH cuando se excita a 490 nm, pero no a 440 nm ³⁷. Cuando este colorante se acopla químicamente a un objetivo, en este caso zymosan, se puede seguir mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio, donde se obtienen imágenes de las células a medida que fagocitan, y los cambios de pH fagosomal se miden en tiempo real a medida que el fagosoma madura. A continuación, se obtiene el pH real mediante la realización de un experimento de calibración en el que las células que se han fagocitado se exponen a soluciones de diferente pH que contienen los ionóforos nigericina y monensina, que permiten el rápido equilibrio del pH dentro de los fagosomas con la solución externa. A continuación, los valores de la relación se comparan con el pH conocido de las soluciones, se construye una curva de calibración mediante regresión no lineal y la ecuación resultante se utiliza para calcular el pH a partir del valor de la relación.

Protocolo

Declaración de Ética: Todas las manipulaciones animales se realizaron en estricta conformidad con las directrices del Comité de Investigación Animal de la Universidad de Ginebra.

1. Preparación de Metas fagocíticas

1. Añadir 20 mg de zymosan se secó a 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Vortex y el calor en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Enfriar y centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
2. Eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de PBS y se somete a ultrasonidos durante 10 minutos en un sonicador de baño de agua. Transferir 500 l a dos tubos de 1,5 ml. Centrifugar a 11.000 xg durante 5 min.
3. Repita el lavado con 500 l de PBS. El zymosan hervida puede ser en alícuotas, congelados y almacenados a -20 ° C.
4. Lave zimosán dos veces en 500 l recién preparados 0,1 M Na ₂ CO _3, pH 9,3 que el anterior (paso 1.2).
5. Resuspender en 490 l después del lavado final. Añadir 10 l de 10 mg / ml de FITC disuelto en dimetil sulfoxide (DMSO), vórtice, cubrir con papel de aluminio, y se incuba con agitación durante 4 horas a temperatura ambiente.
6. Para quitar colorante no fijado, lávese que el anterior (paso 1.2), primero con 0,5 ml de DMSO + 150 l de PBS, y luego 0,5 ml de DMSO + 300 l de PBS, y luego 0,5 ml de DMSO + 450 l de PBS, a continuación PBS solo.
7. Cuente zimosán utilizando un hemocitómetro. Añadir 1 l de zymosan a 500 l de PBS, vórtice, a continuación, añadir 10 l hasta el borde de la cámara de hemocitómetro, donde se encuentra con el cubreobjetos se coloca sobre la rejilla central. Montar el hemocitómetro en un microscopio de campo brillante equipado con un objetivo 20X.
8. Centrarse en la esquina superior izquierda contiene 16 cuadrados y contar todas las partículas zymosan en esta área utilizando un contador de recuento mano. Repita con la esquina inferior derecha. Calcular la concentración zymosan usando la siguiente ecuación: concentración Zymosan = Cantidad / 2 x 500 x 10 ⁴ zymosan / ml. Zimosán marcado puede ser en alícuotas, congelados y almacenados a -20 ° C.
9. Opsonizar el wi zimosán etiquetadoth un conejo anticuerpo anti-zymosan en 1: 100 dilución. Vortex e incubar durante 1 hora en un 37 ° C baño de agua. Lavar con 500 l de PBS que el anterior (paso 1.2).
   Nota: La sonicación es muy recomendable, sobre todo después de la opsonización, como zimosán tiende a formar montones que pueden hacer análisis más difíciles más adelante. Opsonización con 65% v / v de rata o de suero humano se puede utilizar como una alternativa.
10. Contar zymosan usando un hemocitómetro como se describe en los pasos 1,7-1,8, y se diluye hasta 100 x 10 ⁶ partículas / ml. Opsonización con otros estimuladores fagocíticas, como complemento o no la opsonización, se puede realizar alternativamente.

2. Live Video Microscopía

1. Aislar neutrófilos primarios de ratón como se describe en detalle en otra parte ^38.
   1. También puede utilizar cualquier tipo de célula fagocítica. Mantener los neutrófilos en hielo en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 5% de suero bovino fetal (v / v), 200 U de penicilina / streptomycin, a una concentración de 10 x 10 ⁶ células / ml hasta que esté listo para su uso. Otros tipos de células se pueden sembrar 1-4 días antes.
2. Añadir 2 x 10 ⁵ (20 l) de los neutrófilos hacia el centro de un plato de fondo de vidrio 35 mm, se extendió la caída mediante la adición de 50 l de medio y se incuba a 37 ° C durante 5 min para permitir que las células se adhieran.
3. Añadir 1 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) se calentaron a 37 ° C que contiene la específica MPO hidrazida inhibidor 4-aminobenzoico (4-ABH, 10 M). Los inhibidores no específicos de la MPO, como azida de sodio (5 mM), también se pueden utilizar, pero se han sugerido recientemente para ejercer efectos no específicos adicionales en pH ^39.
4. Montar el plato en un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con un sistema de calefacción C 37 ° y un objetivo de aceite de 40X. Se incuban las células sin formación de imágenes durante 10 min para permitir que las células y los equipos se equilibren.
5. Ajuste la configuración de microscopio para adquirir una imagen de transmisión de campo brillante [phase o contraste de interferencia diferencial (DIC), si está disponible] con 440 nm o 490 nm de excitación y 535 nm de emisión cada 30 segundos.
6. Ajuste el tiempo de exposición y la frecuencia de adquisición de acuerdo con el sistema de microscopio para evitar el exceso de fotoblanqueo y fototoxicidad y en función de las preguntas experimentales se preguntó. Comience la adquisición de imágenes.
7. Después de 2 min, añadir 10 x 10 ⁶ (50 l) opsonizado-FITC zymosan al centro del plato. Ajuste de destino: proporciones de células dependiendo del tipo de fagocito y de destino utilizado.
8. Continuar de imágenes para 30 min. Después de 30 minutos detener la adquisición de lapso de tiempo y comenzar un temporizador. Mueva el escenario y capturar 10 o más instantáneas en diferentes campos de visión de imagen otros fagosomas, todo dentro de 5 min.

3. Los experimentos de calibración y control

1. Preparar las soluciones de calibración pH (recetas se describen en la Tabla 1) antes del día del experimento y congelar en alícuotas de 10 ml.Descongele las soluciones de calibración y caliente a 37 ° C en un baño de agua. Comprobar el pH con un medidor de pH y registrar el pH real de las soluciones.
2. Montar una bomba peristáltica en la parte inferior plato de cristal antes de la adquisición de la imagen y realizar microscopía de vídeo en directo como se describe anteriormente (sección 2).
3. Al final del período de adquisición de 30 min encienda la bomba para eliminar la solución dentro del plato, añadir 1 ml de la primera solución de calibración y detener la bomba.
4. Espere hasta que la señal se estabiliza, por lo general 5 min. Repita el procedimiento con cada solución de calibración.
   1. Realizar al menos una calibración por día experimental, y calibrar comenzando con el más alto pH y secuencial de trabajo a la más baja, así como a partir de la pH más bajo y trabajando de forma secuencial hacia el más alto.
5. Como control, añadir 100 l de 100 mM de yoduro de propionium difenil inhibidor de la NADPH oxidasa (DPI) diluido en HBSS a las células en 900 l de HBSS en el plato de fondo de vidrio, yincubar durante 10 min.
6. Comience adquisición y añadir zimosán que el anterior (paso 2.7). Después de 15 min de la fagocitosis, añadir 10 l de 10 mM inhibidor de la V-ATPasa concanamycin A (ConcA) diluido en HBSS y continuar de imágenes para un adicional de 15 min.

4. Análisis

1. Análisis de películas a intervalos y las instantáneas fagosoma.
   Nota: Las siguientes instrucciones son específicas para ImageJ. Paso a paso las instrucciones pueden variar ampliamente dependiendo del software utilizado, pero las funciones descritas en esta sección están disponibles en la mayoría de software de análisis de imagen profesional.
   1. Abra las imágenes con software de análisis de imagen profesional. Reste el fondo en el canal 490 dibujando una pequeña ROI cuadrado con la herramienta de selección poligonal cuadrados en una zona donde no hay células, y haciendo clic en Plugins> BG Sustracción de retorno de la inversión. Luego cargue el mismo ROI en el canal 440 haciendo clic en Editar> Cambios> Restaurar selección y repetir.
   2. Hacer una imagen de relación de 32 bits del canal de 490 dividido por el canal 440 haciendo clic en Proceso> Calculadora Imagen ..., la selección de las imágenes apropiadas en los menús desplegables Image1 y Image2, luego seleccionando "brecha" en el menú desplegable de la Operación y comprobar el resultado casilla 32-bit (float).
   3. Cambie la tabla de consulta de códigos de colores para un código de colores compatibles con relación haciendo clic en Imagen> tablas de búsqueda> Rainbow RGB. Umbral de la imagen relación de eliminar 0 e infinito píxeles haciendo clic en Imagen> Ajustar> Umbral .... Ajuste las barras de desplazamiento para que zimosán aparece en rojo y haga clic en Aplicar, asegurándose de que los valores de ajuste píxeles de fondo casilla NaN a se selecciona.
   4. Combine esta relación pila con el canal de campo brillante en un compuesto de varios canales haciendo clic en Imagen> Color> Combinar Canales, y la selección de la imagen de campo brillante en el menú desplegable canal gris y la imagen de relación en el menú desplegable canal verde, y la selección de laMantenga imágenes fuente casilla de verificación. Analiza las películas a intervalos o instantáneas para determinar qué fagosomas se van a analizar. El canal de campo brillante es útil para esto.
   5. Dibuje las regiones de interés (ROI) mediante la herramienta de selección poligonal óvalo alrededor fagosomas, y añadirlos a la gerente ROI haciendo clic en Análisis> Herramientas> Administrador ROI> Agregar. Mida su relación de intensidad zimosán haciendo clic en Más> Multi-Medida y de-seleccionar la una fila por cada rebanada de casilla.
   6. Para las películas de lapso de tiempo, los fagosomas pista uno a la vez mediante la elaboración de un retorno de la inversión, tecleando Ctrl + M para medir cada punto de tiempo, y moviendo el retorno de la inversión cuando sea necesario para realizar un seguimiento de los valores de intensidad con el tiempo. Copie las mediciones de la ventana Resultados en una hoja de cálculo.
      Nota: El análisis de los 15 (5 cursos de tiempo por experimento x 3) experimentos independientes es ideal, pero más o menos puede ser necesaria en función de la variabilidad observada. Salvando las regiones de interés es siempre recomendable. Algunos paquetes de software permiten regi imagentración y actualización dinámica de rendimiento de la inversión, facilitando de esta parte del análisis.
2. La conversión de fluorescencia para valores de pH
   1. Medir la relación 490/440 para fagosomas en las películas a intervalos de calibración como se describe en la sección 4.1.
   2. En una hoja de cálculo, trazar los valores de la relación con el tiempo, y calcular los valores medios de relación de todos los fagosomas dentro del campo de visión (por lo general, entre 5-20) a partir de 5 puntos de tiempo dentro de la mitad del período de tiempo correspondiente a cada calibración pH solución. (Véanse también las cajas de color rojo en la figura 5A.)
   3. Trazar estos medios 490/440 valores de la relación contra el pH medido real. Combine por lo menos 3 calibraciones independientes en un solo gráfico. Use un paquete de software estadístico o numérica para realizar una regresión no lineal (curva de mejor ajuste), por lo general a una ecuación sigmoidal.
      Nota: Por ejemplo, en la Figura 5B la ecuación utilizada fue una sigmoidal Boltzmann [Y = Bottom + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], donde los valores de Y son los 490/440 ratios, X son los valores de pH y la parte superior, inferior parámetros V50 y pendiente son calculados por el software.
   4. Utilice la ecuación obtenida para transformar valores de la relación de pH.
      Nota: Por ejemplo, en la Figura 5B la ecuación obtenida para la curva de calibración en presencia de azida de sodio es 490/440 = 1,103 + Ratio [(2,89 a 1,103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Resolviendo para pH da la siguiente ecuación: pH = 6.993 - 0,9291 * [ln ((1,178 / (Ratio-1.103)) - 1))].

Resultados

Los siguientes son resultados representativos de un experimento en el que el pH phagosomal de los neutrófilos primarios de ratón aislado de la médula ósea de tipo salvaje o Hvcn1 ^{- / -} los ratones fueron comparados. Para un experimento exitoso, es importante obtener suficientes fagosomas dentro del campo de visión durante toda la duración de la película de lapso de tiempo, evitando al mismo tiempo demasiados fagosomas, que más tarde serán más difíciles de segmento durante el análisis de im...

Discusión

Aunque más lento que los métodos alternativos, como la espectroscopia y FACS, que emplean una estrategia similar de uso de un colorante sensible al pH, junto a los objetivos, pero miden el pH promedio de una población de fagosomas, microscopía ofrece varias ventajas. En primer lugar es que interna y externa obligado, pero no interiorizada, las partículas pueden ser fácilmente distinguido sin tener que añadir otros productos químicos, tales como tripán azul o anticuerpos, para calmar o etiquetar partículas externas, resp...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Zymosan A polvo	Sigma-Aldrich	Z4250	Existen varios proveedores
Isotiocianato de fluoresceína	Sigma-Aldrich	F7250	Existen varios proveedores
Anticuerpo anti-zymosan (reactivo oponizante de biopartículas Zymosan A)	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 es un producto equivalente. Alternativamente, se puede utilizar un suero al 25% como reactivo oponizante.
4-Hidrazida aminobenzoica (4-ABH)	Santa Cruz	sc-204107	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
Cloruro de difenileniodonio (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
Concanamicina A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Life Technologies	14200-075	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
La solución salina de equilibrio de Hank	Life Technologies	14025092	La solución salina equilibrada de Ringer u otros tampones fisiológicos claros pueden ser sustituido.
Carbonato de sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	Existen varios proveedores
Ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	Existen varios proveedores
Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Existen varios proveedores
N-metil-D-glucamina (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	Existen varios proveedores
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	Existen varios proveedores
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Existen varios proveedores
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Existen varios proveedores
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Existen varios proveedores
Cloruro de magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Existen varios proveedores
Etanol absoluto (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	Existen
varios proveedoresPlacas de Petri de 35 mm con fondo de vidrio (Fluorodish)	World Precision Instruments	FD35-100	Ibidi µ-clear se pueden sustituir por placas o cubreobjetos con cámaras de imagen adecuadas
Baño de agua Sonicating	O. Kleiner AG		En su lugar, se puede utilizar un sonicador, existen varios proveedores de instrumentos
Heamocitómetro	Marienfeld GmbH		Existen
varios proveedores de instrumentosMicroscopio de imagen en vivo de campo amplio	Carl Zeiss AG		Existen varios proveedores de instrumentos, pero el microscopio debe ser capaz de obtener imágenes de excitación/emisión 440/535 respectivamente. Las configuraciones confocales de disco giratorio con capacidades de campo claro pueden sustituirse, pero el zymosan tiende a desenfocarse con más frecuencia.
Bomba peristáltica (Dynamax RP-1)	Rainin		Existen varios proveedores de instrumentos
Medidor de pH	Schott Gerate GmbH		Existen varios proveedores de instrumentos
Manual	Counter Milian SA		Existen varios proveedores de instrumentos