Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Summary

El pH fagosomal influye en la maduración del fagosoma, la producción de oxidantes, la eliminación del fagosoma y la presentación de antígenos. Aquí describimos un método radiométrico para medir los cambios de pH en el curso del tiempo y el punto final en fagosomas individuales en fagocitos vivos utilizando microscopía de fluorescencia.

Abstract

La fagocitosis es un proceso fundamental a través del cual las células inmunitarias innatas engullen las bacterias, células apoptóticas u otras partículas extrañas con el fin de matar o neutralizar el material ingerido, o presentarlo como antígenos e iniciar la respuesta inmune adaptativa. El pH de los fagosomas es un parámetro crítico regulación de fisión o fusión con endomembranes y la activación de las enzimas proteolíticas, eventos que permiten la vacuola fagocítica a madurar en un orgánulo degradativa. Además, se requiere la translocación de H ⁺ para la producción de altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), que son esenciales para la matanza eficiente y señalización a otros tejidos del huésped. Muchos patógenos intracelulares subvierten asesinato fagocitosis mediante la limitación de la acidificación phagosomal, destacando la importancia del pH en la biología fagosoma. Aquí se describe un método radiométrico para la medición de pH phagosomal en los neutrófilos utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con zymosan como targ fagocíticaets y imágenes de células vivas. El ensayo se basa en las propiedades de fluorescencia de FITC, que se inactivó mediante pH ácido cuando se excita a 490 nm pero no cuando se excita a 440 nm, lo que permite la cuantificación de una relación dependiente del pH, en vez de la fluorescencia absoluta, de un solo colorante. También se proporciona un protocolo detallado para llevar a cabo en la calibración de tinte situ y la conversión de la relación de a valores de pH real. Métodos radiométricos de un solo tinte se consideran en general superior a la longitud de onda única o protocolos pseudo-radiométrica de doble tinte, ya que son menos sensibles a las perturbaciones tales como blanqueo, se centran cambios, variaciones láser y etiquetado irregular, que distorsionan la señal medida. Este método se puede modificar fácilmente para medir el pH en otros tipos de células fagocíticas, y zymosan puede ser reemplazado por cualquier otra partícula que contiene amina, a partir de perlas inertes a los microorganismos vivos. Por último, este método puede ser adaptado para hacer uso de otras sondas fluorescentes sensibles a diferentes intervalos de pH o de otros phagosomactividades al, por lo que es un protocolo generalizado para la proyección de imagen funcional de fagosomas.

Introduction

La fagocitosis, el proceso a través del cual las células inmunitarias innatas engullen partículas grandes, evolucionó a partir del mecanismo de alimentación de los organismos unicelulares, e implica unirse a un objetivo, envolverlo con una membrana y pellizcar la membrana para formar una vacuola dentro del citosol llamada fagosoma. Mientras que la membrana fagosomal se deriva de la membrana plasmática, la clasificación activa de proteínas y lípidos, así como la fusión con endomembranas durante la formación de fagosomas, transforman el fagosoma en un orgánulo distinto dentro de la célula con propiedades degradativas que permiten la eliminación, neutralización y descomp....

Protocol

Declaración de Ética: Todas las manipulaciones animales se realizaron en estricta conformidad con las directrices del Comité de Investigación Animal de la Universidad de Ginebra.

1. Preparación de Metas fagocíticas

1. Añadir 20 mg de zymosan se secó a 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Vortex y el calor en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Enfriar y centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
2. Eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de PBS y se somete a ultrasonidos durante 10 minutos en un sonicador de baño de agua. Transferir 500 l a dos tubos de 1,5 ml. Centrifugar a 11.0....

Results

Los siguientes son resultados representativos de un experimento en el que el pH phagosomal de los neutrófilos primarios de ratón aislado de la médula ósea de tipo salvaje o Hvcn1 ^{- / -} los ratones fueron comparados. Para un experimento exitoso, es importante obtener suficientes fagosomas dentro del campo de visión durante toda la duración de la película de lapso de tiempo, evitando al mismo tiempo demasiados fagosomas, que más tarde serán más difíciles de segmento durante el análisis de im.......

Discussion

Aunque más lento que los métodos alternativos, como la espectroscopia y FACS, que emplean una estrategia similar de uso de un colorante sensible al pH, junto a los objetivos, pero miden el pH promedio de una población de fagosomas, microscopía ofrece varias ventajas. En primer lugar es que interna y externa obligado, pero no interiorizada, las partículas pueden ser fácilmente distinguido sin tener que añadir otros productos químicos, tales como tripán azul o anticuerpos, para calmar o etiquetar partículas externas, resp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymosan A polvo	Sigma-Aldrich	Z4250	Existen varios proveedores
Isotiocianato de fluoresceína	Sigma-Aldrich	F7250	Existen varios proveedores
Anticuerpo anti-zymosan (reactivo oponizante de biopartículas Zymosan A)	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 es un producto equivalente. Alternativamente, se puede utilizar un suero al 25% como reactivo oponizante.
4-Hidrazida aminobenzoica (4-ABH)	Santa Cruz	sc-204107	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
Cloruro de difenileniodonio (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
Concanamicina A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Life Technologies	14200-075	Tóxico, use guantes, existen varios proveedores
La solución salina de equilibrio de Hank	Life Technologies	14025092	La solución salina equilibrada de Ringer u otros tampones fisiológicos claros pueden ser sustituido.
Carbonato de sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	Existen varios proveedores
Ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	Existen varios proveedores
Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Existen varios proveedores
N-metil-D-glucamina (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	Existen varios proveedores
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	Existen varios proveedores
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Existen varios proveedores
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Existen varios proveedores
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Existen varios proveedores
Cloruro de magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Existen varios proveedores
Etanol absoluto (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	Existen
varios proveedoresPlacas de Petri de 35 mm con fondo de vidrio (Fluorodish)	World Precision Instruments	FD35-100	Ibidi µ-clear se pueden sustituir por placas o cubreobjetos con cámaras de imagen adecuadas
Baño de agua Sonicating	O. Kleiner AG		En su lugar, se puede utilizar un sonicador, existen varios proveedores de instrumentos
Heamocitómetro	Marienfeld GmbH		Existen
varios proveedores de instrumentosMicroscopio de imagen en vivo de campo amplio	Carl Zeiss AG		Existen varios proveedores de instrumentos, pero el microscopio debe ser capaz de obtener imágenes de excitación/emisión 440/535 respectivamente. Las configuraciones confocales de disco giratorio con capacidades de campo claro pueden sustituirse, pero el zymosan tiende a desenfocarse con más frecuencia.
Bomba peristáltica (Dynamax RP-1)	Rainin		Existen varios proveedores de instrumentos
Medidor de pH	Schott Gerate GmbH		Existen varios proveedores de instrumentos
Manual	Counter Milian SA		Existen varios proveedores de instrumentos