Un movimiento versátil modelo murino de la sustancia blanca subcortical para el Estudio de la degeneración axonal y la sustancia blanca Neurobiología

Resumen

Aquí presentamos una metodología para la producción de un accidente cerebrovascular focal en la sustancia blanca murina mediante la inyección local de un inhibidor irreversible del óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) (L-Nio). Se presentan dos variaciones estereotácticas, el trazado neuronal retrógrado y el marcaje y disección de tejido fresco que amplían las aplicaciones potenciales de esta técnica.

Resumen

Accidente cerebrovascular que afecta a las cuentas de la materia blanca de hasta el 25% de los accidentes cerebrovasculares presentaciones clínicas, se produce en silencio a velocidades que pueden ser 5-10 veces mayor, y contribuye de manera significativa al desarrollo de la demencia vascular. Pocos modelos de derrame cerebral focal materia blanca existen y esta falta de modelos apropiados ha dificultado la comprensión de los mecanismos neurobiológicos implicados en la respuesta lesión y reparación después de este tipo de accidente cerebrovascular. La principal limitación de otros modelos de accidente cerebrovascular subcortical es que no restrinjan de manera focal del infarto de la sustancia blanca o principalmente han sido validados en las especies no murinos. Esto limita la capacidad de aplicar la amplia variedad de herramientas de investigación murinos para estudiar la neurobiología de la carrera de la materia blanca. Aquí presentamos una metodología para la producción fiable de un derrame cerebral focal en la sustancia blanca murino mediante una inyección local de un inhibidor de eNOS irreversible. También presentamos algunas variaciones en el protocolo general entre ellos dos estereotáctica únicovariaciones, la localización neuronal retrógrada, así como el etiquetado de disección de tejido fresco y que en gran medida ampliar las posibles aplicaciones de esta técnica. Estas variaciones permiten múltiples enfoques para analizar los efectos neurobiológicos de esta forma común y poco estudiada de accidente cerebrovascular.

Introducción

accidente cerebrovascular que afecta a la sustancia blanca subcortical es una entidad clínica común, que representa hasta el 25% de los accidentes cerebrovasculares clínicos anualmente en los EE. UU. ¹. El daño isquémico de la sustancia blanca también ocurre de forma silenciosa a un ritmo significativamente mayor y contribuye al desarrollo de la demencia vascular ^2,3. En la actualidad, los pacientes con esta forma de isquemia cerebral tienen pocas o ninguna opción de tratamiento. A pesar de la importancia clínica de esta enfermedad, existen pocos modelos animales clínicamente relevantes ^4,5.

El objetivo de este protocolo es producir una lesión isquémica focal dentro de la sustancia blanca murina. Este modelo murino de enfermedad humana permite el estudio específico de la respuesta a la lesión axonal al accidente cerebrovascular y cómo los elementos celulares de la sustancia blanca, a saber, oligodendrocitos y astrocitos junto con los axones, responden y se reparan después del accidente cerebrovascular.

Informes anteriores han descrito un modelo de accidente cerebrovascular de materia blanca subcortical utilizando endotelina-1 (ET-1) ⁶ que es similar al descrito aquí. Se han realizado varios cambios clave en el protocolo experimental, por lo que los usos potenciales de este modelo se han ^ampliado.7,8. Este protocolo proporciona una estrategia fiable y modificable para producir un trazo focal dentro de la materia blanca del cerebro del ratón.

Las principales ventajas de este modelo son el uso de un inhibidor químico del óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) N(5)-(1)-iminoetil-L-ornitina HCl (L-Nio) ⁹ sin efectos paracrinos conocidos sobre los elementos celulares de la sustancia blanca, lo que había sido una complicación de los modelos que utilizaban endotelina-1 ¹⁰. Además, la focalización estereotáctica de la materia blanca en el ratón permite el uso de cualquier variedad de cepas transgénicas o knockout, ampliando en gran medida las herramientas disponibles para determinar el efecto del ictus en la materia blanca del cerebro. Aquí, se describen dos variaciones de esta técnica y se demuestran algunas de las variaciones adicionales que se pueden utilizar para mejorar la comprensión del daño axonal y de la sustancia blanca y la reparación después de un accidente cerebrovascular.

Protocolo

El uso de animales en este protocolo se ha realizado de acuerdo con los procedimientos aprobados por la Universidad de California en Los Ángeles Cuidado de Animales y el empleo.

Nota: Comience por identificar la población objetivo murino. En estudios anteriores, de tipo salvaje ratones C57 / Bl6 solamente masculinas se han utilizado, sin embargo varios ratones transgénicos o knockout también se pueden utilizar. Tenga en cuenta que las coordenadas estereotácticas se basan en C57 / Bl6 anatomía. Se recomienda que cada usuario verificar inicialmente la localización de la carrera a la sustancia blanca.

1. Sustancia Blanca carrera de inducción - Aproximación oblicua medial

1. Comience por la preparación de una pipeta de vidrio tirado usando tubo capilar 0,5 mm de tal manera que el diámetro distal es de entre 15 a 25 micras ^11.
2. Preparar una alícuota de 10 l estéril de L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornitina HCl) a 27,4 mg / ml (130 mM) en solución salina normal estéril al 0,9%.
3. Pre-llenar la pipeta de vidrio tiradocon un pequeño volumen de L-Nio (2-5 l) fijando el pipeta de vidrio a un tubo conectado a una línea de vacío. Acostar a la pipeta sobre la mesa de trabajo e introduzca el extremo tirado en la solución de L-Nio.
   1. Aplicar el vacío hasta que al menos 2 mm de la porción de 0,5 mm de la pipeta se llena. Apague el vacío y retirar la pipeta. Coloca a un lado hasta Paso 1.12.
4. Coloque el ratón en una cámara de inducción e inducir anestesia del ratón usando estándar de 32% de isoflurano fluía a través de un vaporizador (5 L / min inhalado con 5 L / min de oxígeno y 0,5 L / min N ₂₎ durante 1 min o hasta que profundamente anestesiados. Transferir el ratón para un aparato estereotáxico equipado con un microscopio estereotáctica. Proporcionar anestesia de mantenimiento utilizando 32% de isoflurano fluido a través de un vaporizador (2 L / min inhalado con 5 L / min de oxígeno y 0,5 L / min N ₂₎ y un cono de nariz. Comprobar la profundidad de la anestesia con una pizca dedo del pie.
5. Ajuste el brazo de la inyección de 36 °.
6. Affixa sacó titular de la pipeta de vidrio al extremo distal de un sistema de inyección a presión de bajo volumen y adjuntarlo al brazo de la inyección de la configuración estereotáctica.
7. Escudo bigotes del animal anestesiado con vaselina y lugar artificial ungüento de lágrimas sobre ambos ojos. Preparar un campo quirúrgico estéril mediante la colocación de un campo estéril sobre la cabeza del animal con una abertura de 5 a 10 cm sobre la cabeza. Preparar una superficie quirúrgica aspetic por el afeitado de la piel que recubre el cráneo. Limpiar el cuero cabelludo con la alternancia de betadine y el 70% algodones con alcohol.
8. Hacer una incisión media de 1,5 cm del cuero cabelludo con unas tijeras finas estériles para exponer la superficie del cráneo. Se seca el cráneo con un hisopo de algodón estéril y usando un microscopio estereotáctica en 1-3x magnificación, retirar cualquier tejido del periostio que recubre el uso de una herramienta de punto de micro estéril.
9. Marcar el bregma como punto de referencia con un marcador de punta fina.
10. Perforar una craneotomía ellipitical 2 mm con una broca quirúrgica estéril fina stip0; comenzando posterior al bregma y que se extiende hacia delante justo a la izquierda de la línea media. Eliminar fragmentos de hueso y el tejido superior de blando, de manera que la corteza cerebral puede ser visualizado.
11. Mantenga el campo quirúrgico y la superficie cortical húmedo aplicando intermitentemente gotas de solución salina estéril.
12. Colocar una pipeta de vidrio tirado al brazo inyector del aparato estereotáxico. Alinear el extremo distal de la pipeta con la Bregma y poner a cero las coordenadas estereotácticas.
13. Avanzar en la pipeta a la primera anterior / posterior (A / P) y medial / lateral (M / L) coordenadas proporcionadas en la Tabla 1.
14. Avanzar en la pipeta a la superficie cortical y cero el ventral (V D /) medición dorsal /.
15. Pasar lentamente la pipeta en el cerebro hasta llegar a la primera D / V de coordenadas en la Tabla 1.
16. El uso de un sistema de inyección de baja presión de volumen ajustado a 20 psi durante 20 ms pulsos, inyectar 100 nl de L-Nio en el cerebro y esperar 5 minutos para prevenir el reflujohasta la pista de la pipeta.
    1. Utilizar una retícula calibrada en el ocular del microscopio estereotáctica y un aumento de 3 veces.
    2. Por consiguiente, desplazar a un total de 0,100 mm ³ (0,5 mm de longitud en una pipeta 0,5 mm de diámetro, que corresponde a 100 nl) de la pipeta de vidrio tirado para cada conjunto de coordenadas. Mediante el uso de una retícula, medir y estandarizar ya que cada organizadas varía según la ampliación y las escalas utilizadas.
    3. Para la medición exacta del volumen durante cada inyección, el enfoque de la pipeta en ángulo con el microscopio de un lado para que el menisco aire-líquido tiene una vista sagital. El menisco debe aparecer en el mismo plano focal, tanto de la pared interior y exterior de la pipeta.
17. Retire lentamente la pipeta y repita los pasos 1.13-1.16.3 en el segundo y tercer conjunto de coordenadas que figuran en la Tabla 1.
18. Después de la inyección final, retire la pipeta y colocar la cera suficiente hueso para llenar el sitio de la craneotomía. UNpproximate los bordes de la herida del cuero cabelludo y se unen con adhesivo dérmico.
19. Inyectar 0,1 ml de 0,5% bupivacaína en los márgenes de la herida utilizando un 30 G aguja estéril para evitar para prevenir el dolor local asociado con la incisión del cuero cabelludo.
20. Devolver el animal a la vivienda y suministro de antibióticos postoperatorios (0,48 mg / ml de trimetoprim-sulfametoxazol, o 0,5 mg / ml levofloxacino) en el agua de bebida durante 5 días.

2. Sustancia Blanca carrera de inducción - Aproximación oblicua posterior

1. Realice los pasos 1.1 a 1.12 como en el protocolo de enfoque en ángulo medial, excepto ajustar el brazo de la inyección de la configuración estereotáctica a 45 grados orientados anterior a la posterior.
2. Avanzar en la pipeta a la primera A / P y M / L de coordenadas que figuran en la Tabla 2.
3. pasos restantes completos 1.14-1.20 como en el protocolo de enfoque en ángulo lateral.

3. El etiquetado neuronal retrógrada

1. Preparar una estéril 10alícuota l de L-Nio a 54,8 mg / ml en solución salina normal al 0,9%.
2. Preparar una alícuota estéril de 20% Fluororuby (o 20% de amina de dextrano biotinilado o 2% Fluorogold) en solución salina normal al 0,9%.
3. Diluir juntos 1: 1 para concentraciones finales de 27,4 mg / ml L-Nio y 10% Fluororuby.
4. Realizar el protocolo de ACV como anteriormente en las etapas 1.3-1.23.
5. Visualizar el trazador fluorescente de forma nativa en la sección de tejido mediante fijación por perfusión, cryosectioning y microscopía como se ha descrito previamente ^8.

4. Procesamiento de tejidos para la inmunofluorescencia

1. En un intervalo posterior al accidente cerebrovascular adecuada que varía de 3 horas a 14 días después del accidente cerebrovascular, la eutanasia a los ratones a través de la sobredosis de isoflurano o CICUAL local aprobó procedimiento.
2. Abrir la cavidad torácica con unas tijeras en ángulo e insertar una aguja 23 G de la mariposa en el ventrículo izquierdo.
3. Coloque una pequeña incisión en la aurícula derecha con unas tijeras finas para permitir una vía de salida para el líquido de perfusión.
4. Transcardially perfundir con 30-40 ml de solución salina tamponada con fosfato fría, seguido de 30 a 40 ml de paraformaldehído al 4% frío a una velocidad de 10 ml / min a TA.
5. Decapitar al ratón y eliminar el cerebro con unas tijeras estériles para abrir el cráneo por detrás y luego retire con cuidado el cráneo recubre con una espátula, colocar el cerebro en frío PFA al 4% durante 24 horas, y luego se transfieren a un 30% de sacarosa en PBS durante 48 horas .
6. Preparar cuarenta secciones micras flotantes usando un criostato y realizar el procesamiento de anticuerpo como se describe anteriormente ^6-8. En este estudio, utilice los siguientes anticuerpos: (: 500 dilución 1); de conejo anti-neurofilamentos 200 conejo anti-vimentina (1: 500); de cabra anti-GFAP (1: 500); conejo anti-Iba-1 (1: 1.000).

5. Procesamiento de tejidos para la proteína o el análisis de ARN

1. En un intervalo posterior al accidente cerebrovascular adecuada que varía de 3 horas a 14 días después del accidente cerebrovascular, la eutanasia mediante sobredosis de isoflurano o CICUAL local aprobó procedimiento.
2. decapitar alratón y eliminar el cerebro con unas tijeras estériles para abrir el cráneo posterior y retire suavemente el cráneo recubre con una espátula.
3. Insertar un 4 mm espátula estéril en la parte delantera del cerebro para cortar el bulbo olfatorio y los nervios ópticos. Levante suavemente el cerebro fuera de la bóveda craneal y el lugar en tampón de disección enfriado con hielo (solución salina equilibrada de 1x Hank, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, glucosa 35 mM, bicarbonato de sodio 4 mM, y 0,01 mg / ml ciclohexamida).
4. El uso de un bloque de cerebro y cuchillas de afeitar estériles nuevas, preparar losas 2-3 mm que contienen la carrera y el lugar en el tampón de disección fría.
5. Bajo un microscopio de disección, identificar la materia blanca de la corteza motora subyacente en el hemisferio inyectado. A intervalos post-carrera más larga, la región puede ser identificado visualmente por necrosis focal y la palidez de la mielina.
   Nota: A intervalos post-ictus anteriores, la inyección de L-Nio mezcla con 1 l de 10% Fast Green puede permitir la identificación visual de la carrera ( Figura 4A).
6. Bajo la guía de un microscopio de disección y el uso de un bisturí fresca, diseccionar cuidadosamente la región de la sustancia blanca que contiene el accidente cerebrovascular, identificado por cualquiera de etiquetado verde rápida o pérdida de tejido. Retirar la corteza suprayacente y el cuerpo estriado subyacente si lo deseas.

Resultados

Usando el modelo presentado, la sustancia blanca subyacente extremidad anterior corteza sensoriomotora fiable puede ser objetivo. Este modelo accidente cerebrovascular inducida químicamente produce axonal focal y la pérdida de mielina, astrocitosis y microgliosis (Figura 1), como se ve típicamente en infartos lacunares humanos. Mediante el uso de tres inyecciones, un modelo de utilidad clínica se establece con deterioro temprano en las tareas motoras miembro delantero

Discusión

Un número de modelos anteriores de accidente cerebrovascular subcortical se han descrito incluyendo inyecciones focales de endotelina-1 en la cápsula interna, materia blanca subcortical y el cuerpo estriado en la rata y el ratón ^{12 a 14 6,15.} Los modelos más recientes de pequeños accidentes cerebrovasculares focales han utilizado la inyección microembolias colesterol en la arteria carótida y la oclusión ¹⁶ photothrombotic de una sola de las arteriolas penetrantes ^17. Cada uno ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
L-N5-(1-iminoetil)ornitina, diclorhidrato	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurano	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Tubos capilares	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Configuración estereotáctica	Kent Scientific	KSC51725
Extractor de pipetas	KOPF	Modelo 720
Microscopio estereoscópico SZ51	Olympus	88-124
Tijeras finas	Fine Scientific Tools	14084-08
Pinzas	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Pinzas curvas	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Herramienta de disección roma	Fine Scientific Tools	10066-15
Taladro	Dremel	8220-1/28
Brocas	Fine Herramientas científicas	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimetoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30 mg
Paraformaldehído	Fisher	O4042-500
Sacarosa	Fisher	BP220-10
Criostato	Leica CM3050 S
Toboganes de vidrio	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Microscopio de disección	Nikon	SMZ1500
23 G aguja de mariposa	Fisher	14-840-35
10x Solución salina equilibrada de Hank	Life Technologies	14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucosa	Sigma	G8270
Bicarbonato de sodio	Sigma	S5761
Ciclohexamida	Sigma	01810