Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA<em&gt; En Vivo</em

Resumen

Inmunoprecipitación de la cromatina es una técnica poderosa para la identificación de ADN sitios de las proteínas de Arabidopsis unión in vivo. Este procedimiento incluye la cromatina entrecruzamiento y la fragmentación, inmunoprecipitación con anticuerpos selectivos contra la proteína de interés, y el análisis qPCR de ADN unido. Se describe un chip de ensayo sencilla optimizada para plantas de Arabidopsis.

Resumen

Las intrincadas redes reguladoras de genes orquestan los procesos biológicos y las transiciones de desarrollo en las plantas. La activación transcripcional selectiva y el silenciamiento de genes median la respuesta de las plantas a las señales ambientales y las señales de desarrollo. Por lo tanto, los conocimientos sobre los mecanismos que controlan la expresión génica de las plantas son esenciales para obtener una comprensión profunda de cómo se regulan los procesos biológicos en las plantas. La técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) descrita aquí es un procedimiento para identificar los sitios de unión al ADN de proteínas en genes o regiones genómicas de la especie modelo Arabidopsis thaliana. Las interacciones con el ADN de proteínas de interés como factores de transcripción, proteínas de cromatina o versiones postraduccionales modificadas de histonas pueden analizarse de manera eficiente con el protocolo ChIP. Este método se basa en la fijación de interacciones proteína-ADN in vivo, la fragmentación aleatoria de la cromatina, la inmunoprecipitación de complejos proteína-ADN con anticuerpos específicos y la cuantificación del ADN asociado a la proteína de interés mediante técnicas de PCR. El uso de esta metodología en Arabidopsis ha contribuido significativamente a revelar mecanismos reguladores transcripcionales que controlan una variedad de procesos biológicos de plantas. Este enfoque permitió la identificación de los sitios de unión de la proteína de cromatina EBS de Arabidopsis a las regiones reguladoras del gen maestro de la floración FT. El impacto de esta proteína en la acumulación de marcas de histonas particulares en la región genómica de FT también se reveló a través del análisis de ChIP.

Introducción

Durante los últimos años una amplia gama de herramientas genéticas, moleculares y genómicos se han desarrollado en la especie modelo Arabidopsis thaliana. Esta tecnología ha facilitado enormemente el progreso en la comprensión de cómo se regula el desarrollo de la planta. Entre los procesos de desarrollo estudiados usando Arabidopsis como modelo, el control genético de la época de floración ha sido ampliamente analizado. Estos estudios han demostrado que las plantas modulan de forma muy precisa el momento de la floración en respuesta a las señales endógenas como las hormonas y la edad de la planta, y también a las señales ambientales como el fotoperiodo y te....

Protocolo

1. La reticulación del material vegetal (1 hora)

1. Crecer las líneas de Arabidopsis utilizados en el experimento (de tipo salvaje - WT - frente a los mutantes, y / o líneas que expresan la versión etiquetada de su proteína de interés en comparación con las líneas que expresan la etiqueta no fusionados a cualquier proteína) durante 12-18 días en grandes placas de Petri (150 mm) con medio MS-agar (1 L: Sales de Murashige & Skoog 1x, 10 g de sacarosa, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% de agar). Alternativamente, cultivar plantas en macetas que contenían 3: 1 mezcla de suelo y vermiculita.
   ¡ATENCIÓN! El formaldehído es tóxico por inhalación, co....

Resultados

Ocho pasos principales pueden señalarse en este protocolo chip para la identificación de in vivo proteína-DNA, incluyendo cultivo y la recolección de material vegetal, el entrecruzamiento de la cromatina, el aislamiento de la cromatina, la fragmentación de la cromatina, aislamiento selectivo de los complejos entre ADN y la proteína de interés mediante inmunoprecipitación, la digestión de proteínas, purificación de ADN, y análisis de qPCR (Figura 1). Un paso crucial en el chip de protocolo es la.......

Discusión

El chip de protocolo descrito aquí es una técnica reproducible y potente para analizar las interacciones entre proteínas y secuencias específicas de ADN in vivo en plantas de Arabidopsis. Una identificación exitosa de sitios de unión para las proteínas de interés requiere una adecuada selección de órganos de la planta o etapas de desarrollo, donde las interacciones relevantes en realidad están teniendo lugar. Además, es crítico para obtener una fijación adecuada del material vegetal y un óptimo de corte de la c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MES	Sigma	M8250
MS (Mezcla de sales basales de Murashige y Skoog)	Sigma	M5524
Formaldehído 37%	Sigma	F8775-25	Uso bajo la campana
extractora Mezcla de inhibidores de proteasa cOmplete ULTRA Comprimidos, Mini, sin EDTA, EASYpack	Roche	5892791001
Bioruptor Dispositivo de sonicación estándar	Diagenode	B01010002 (UCD200TO)
Glycine	Sigma	50046
QIAquick PCR Kit de purificación	Qiagen	28104
Perlas magnéticas Dynabeads acopladas a proteína A o proteína G	Life Technologies	10003D/10001D	Comprobar fabricante' s manual de afinidad de anticuerpos
Miracloth	Merck Millipore	475855
Triton X-100 Surfact-Amps Detergente	Solution Life Technologies	85112
(ratón, rata, conejo …)-IgG	Diagenode	C15400001, C15420001, C15410206
Rack magnético - Anticuerpo policlonal DynaMag-2	Life Technologies	12321D
H3K9/14ac - Premium	Diagenode	C15410200-10
Chelex 100 Resina	Bio-Rad	142-2832
Proteinasa K	Life Technologies	17916
Anticuerpo anti-Myc Tag, clon 4A6	Millipore	05-724
LightCycler 480 SYBR Verde I Master	Roche	4707516001