Artículo de método

Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

DOI:

10.3791/53433

⸱

13 de julio de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, National Chiayi University, 2Department of Microbiology and Immunology/Graduate Institute of Biomedical and Biopharmaceutical Sciences, National Chiayi University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe el desarrollo de dos anticuerpos monoclonales (mAb) de clase IgG fuertemente reactivos a la mioglobina de los cetáceos. Estos mAbs se aplican en una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal basada en el formato sándwich para diferenciar el Mb de los cetáceos de la foca y otros animales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe el desarrollo de una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal basada en el formato sándwich que se puede utilizar para diferenciar la mioglobina (Mb) de los cetáceos de la de las focas y otros animales. La franja permite un cribado rápido y sobre el terreno de la carne de cetáceos, restringiendo así su comercio y consumo ilegales. Se desarrollaron dos anticuerpos monoclonales (mAb) con reactividad frente al Mb de cetáceos. Se analizaron las secuencias de aminoácidos de las regiones reactivas antigénicas Mb de varios animales con el fin de diseñar dos péptidos sintéticos (un péptido general y un péptido específico) y posteriormente elevar los mAbs (subclase IgG1). Los mAbs se seleccionaron a partir de hibridomas cribados por ELISA indirecto, Western blot y dot blot. CGF5H9 fue específico para los Mbs de conejos, perros, cerdos, vacas, cabras y cetáceos, mientras que mostró una afinidad débil o nula con los Mbs de pollos, atunes y focas. CSF1H13 pueden atar a focas y cetáceos con fuerte afinidad, pero no mostraron afinidad con otros animales. En este estudio se utilizaron muestras de cetáceos de cuatro familias (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae y Kogiidae), y los resultados indicaron que estos dos mAbs tienen una amplia capacidad de unión a Mbs de diferentes cetáceos. Estos mAbs se aplicaron en una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal tipo sándwich. CGF5H9, que reconoce muchas especies, fue marcado con oro coloidal y se utilizó como anticuerpo de detección. CSF1H13, que se recubrió en la zona de ensayo, detectó la presencia de cetáceos y focas Mbs. Se analizaron por triplicado muestras de músculo de atún, pollo, foca, cinco especies de mamíferos terrestres y 15 especies de cetáceos. Todas las muestras de cetáceos mostraron resultados positivos y todas las demás muestras mostraron resultados negativos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Históricamente, la carne de cetáceo se ha consumido en muchas partes del mundo y este consumo continúa hoy en día1. Debido al nivel trófico de los cetáceos, se sabe que hay altos niveles de mercurio y otras toxinas en su carne2. Por lo tanto, el consumo de carne de cetáceo podría generar un problema de salud no solo para los grupos de alto riesgo, como las mujeres embarazadas, sino también para la población en general3. Además, la contaminación de la carne de cetáceo con patógenos zoonóticos o potencialmente zoonóticos también puede ocurrir durante su procesamiento y almacenamiento4. Es difícil, incluso para los agentes experimentados, identificar las carnes de cetáceos solo por su apariencia. Por lo tanto, se requiere un método científico confiable de identificación para diferenciar la carne de cetáceo de otras carnes. Esto ayudaría a limitar el consumo de carne de cetáceo.

Los métodos actuales de identificación de especies incluyen técnicas moleculares y métodos inmunológicos. Las técnicas moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciación del ADN, pueden utilizarse para identificar muestras no solo de carne cruda5 y muestras descompuestas6, sino también de alimentos procesados como salchichas cocidas y piensos7,8. Los métodos inmunológicos, como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), se aplican comúnmente en la producción de alimentos para detectar el contenido de carne de, por ejemplo, cerdo9, carne de res10 y bagre11. El análisis de ADN basado en PCR para la identificación de carne de cetáceoestá disponible 12 y ha ayudado a prevenir el comercio internacional ilegal de carne de cetáceo en Japón, Corea del Sur, Filipinas, Taiwán, Hong Kong, Rusia, Noruega y Estados Unidos1. Estos métodos son efectivos y confiables, pero pueden tardar horas o días en completarse e implicar pasos laboriosos. La identificación de las carnes de cetáceos suele basarse en técnicas moleculares y actualmente no se dispone de ningún método inmunológico. Para las agencias reguladoras, es muy deseable desarrollar una técnica confiable y rápida que pueda usarse en el campo para identificar carnes de cetáceos.

Las tiras inmunocromatográficas se utilizan como herramientas de detección con la ventaja de producir resultados rápidos a través de un protocolo simple que es adecuado para su uso en el campo. Los principios de la tira inmunocromatográfica y el ELISA son muy similares, e incluyen anticuerpos, antígenos y marcadores. En el desarrollo de las tiras inmunocromatográficas se han utilizado muchas etiquetas diferentes, como el oro coloidal, el carbono y el látex. En la actualidad, este método es comúnmente utilizado para la detección de antibióticos, toxinas, bacterias y virus13, pero raramente se utiliza para la identificación de proteínas en la carne14,15. En este trabajo proponemos un inmunoensayo enzimático cromatográfico de flujo lateral para la detección rápida de mioglobina (Mb) de cetáceos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Declaración de Ética: El estudio se realizó de acuerdo con las directrices internacionales y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad Nacional de Chiayi, aprobación ID: 99022. El uso de la muestra de cetáceos fue permitido por el Consejo de Agricultura de Taiwán (Permiso de Investigación 100M-02.1-C-99).

1. Preparación de la muestra del músculo y SDS-PAGE

Nota: Las muestras de músculo de 23 especies, incluyendo 16 especies de mamíferos marinos, 5 especies de mamíferos terrestres, el atún y el pollo se utilizaron en este estudio (Tabla 1). Las muestras de músculo de cetáceos se obtuvieron de individuos varados, la captura incidental de la pesca, y la confiscación. Conejo, rata, perro, y los tejidos musculares de pollo se obtuvieron a partir del Centro de Diagnóstico de Enfermedades Animales de la Universidad Nacional de Chiayi. Las muestras de carne de res, cerdo, cordero, y el atún se adquirieron en un supermercado local. La muestra de músculo de foca común (Phoca vitulina ) fue proporcionado por Farglory Ocean Park. se utilizó dodecil de sodio electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para separar las proteínas solubles con diferentes pesos moleculares en muestras de músculo.

  1. Almacenar todas las muestras a -20 ° C hasta su uso.
  2. Mortero pre-enfriamiento a -20 ° C. A continuación, poner 3 g de muestra de músculo congelado en él.
  3. Homogeneizar la muestra con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría utilizando un homogeneizador de tejidos.
  4. Centrifugar la muestra homogeneizada a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Recoger los sobrenadantes y almacenarla a -20 ° C hasta su uso.
  5. Preparar 5 ml de 5% gel de apilamiento (3,07 ml de agua destilada, 1,25 ml de tampón de gel superior 4x de pH 6,8, 625 l de 40% de acrilamida, 50 l de 10% de persulfato de amonio (APS), y 5 l de tetrametiletilendiamina ( TEMED)) y 10 ml de 15% de gel de separación (3,65 ml de agua destilada, 2,5 ml de 4x inferior tampón de gel de pH 8,8, 3,75 ml de 40% de acrilamida, 100 l de 10% de APS,y 4 l de TEMED).
    1. En la celda de electroforesis, se vierte gel de apilamiento (5% de acrilamida) en la parte superior del gel de separación (15% de acrilamida) después de que éste se haya solidificado. Inserte un peine de gel en el gel de apilamiento.
  6. Realizar PAGE de acuerdo con las siguientes condiciones: condición inicial de ejecución: 100 voltios, 20 min y la condición final: 120 voltios, 40 min.
  7. Tinción del gel con azul brillante de Coomassie a temperatura ambiente durante 30 min hasta que el gel es uniformemente de color azul.
    Nota: La tinción se completa cuando el gel ya no es visible en la solución de colorante.
  8. Destain con solución de ácido acético (10%) a temperatura ambiente durante 1 hr. Bandas comenzarán a aparecer. Continuar la decoloración se deben a 4 ° C durante la noche hasta que el fondo es claro.

2. Síntesis de péptidos y Producción de anticuerpos monoclonales

  1. Recuperar las secuencias de aminoácidos de Mb de GenBank incluyendo el atún, pollo, avestruz, mamíferos domésticos, sello y 18 especiesde los cetáceos (Tabla 2).
  2. Alinear las secuencias utilizando el software adecuado 16:
    1. Iniciar el explorador de alineación seleccionando la Align: Editar / Construir alineación en la barra de inicio; seleccione Crear nueva alineación y haga clic en OK. Aparecerá un cuadro de diálogo preguntando "¿Está construyendo un alineamiento de secuencias de ADN o proteínas?"
    2. Haga clic en el botón "proteína"; seleccione Datos: Open: Recuperar secuencias de archivo y seleccione el archivo de secuencias; seleccione Editar: Seleccionar todo comando de menú para seleccionar todos los sitios para cada secuencia en el conjunto de datos para crear un alineamiento de secuencias múltiples.
    3. Seleccione Alineación: Alinear por ClustalW en el menú principal para alinear las secuencias de datos seleccionados utilizando el algoritmo ClustalW; seleccione "BLOSUM" como el peso de proteínas de matriz a continuación, haga clic en el botón OK.
  3. Analizar la alineación de la secuencia:
    1. Concéntrese en 5 SI reactivo antigénicoTES 17: 1 sitio (AKVEADVA, 15-22), el sitio 2 (KASEDLK, 56-62), el sitio 3 (ATKHKI, 94-99), el sitio 4 (HVLHSRH, 113-119) y el sitio 5 (KYKELGY, 145- 151) y encontrar el fragmento conservado entre los cetáceos. Un * (asterisco; símbolo de consenso en la alineación (Protocolo 2.2.3)) indica las posiciones que tienen un único residuo, totalmente conservada. Se encontraron las siguientes fragmentos conservados en los cetáceos: secuencia KASEDLKKHG (que incluye el sitio 2) y la secuencia HVLHSRHP (que incluye el sitio 4).
  4. Sintetizar fragmentos de secuencia candidatos de acuerdo con el análisis de la secuencia, y el conjugado con una proteína de ovoalbúmina (OVA) como proteína portadora usando servicios comerciales.
    1. Añadir aminoácidos hidrófobos (por ejemplo, metionina) a la N-terminal de sitio reactivo antigénico para prevenir el péptido de la descomposición (por ejemplo, M-KASEDLKKHG).
    2. Alargar el C-terminal de sitio reactivo antigénico para exponer el sitio antigénico núcleo a la de inmunocitos. Además, conjupuerta del péptido con OVA mediante la adición de una cisteína (Cys, C) a la C-terminal (por ejemplo, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
  5. Emulsionar adyuvante completo de Freund para inmunógeno 1 o adyuvante incompleto de Freund para inmunógeno 2 con un volumen igual de cada péptido sintético en PBS (3 ml, concentración final de 30 a 50 g / 100 l).
  6. Inocular inmunógeno 1 (0,1 mg) por vía subcutánea en cada uno de los ratones 5 hembras BALB / c.
  7. Realizar inyecciones de refuerzo subcutáneas cinco veces usando inmunógeno 2 en intervalos de dos semanas y recoger los sueros de ensayo por muestreo clip de la cola de los ratones antes de cada refuerzo.
  8. Determinar el título de los sueros para la primera proyección.
    1. Disolver 100 g de péptido libre en 25 ml de tampón de reacción y parte alícuota de 50 l de la solución en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Añadir solución de reactivo de acoplamiento 10 l en cada pocillo y mezclar la placa. Incubar la placa durante 2 horas a temperatura ambiente.
    2. Retire el contenido del pozo,lavar cada pocillo 3 veces con agua destilada, y bloquear la placa mediante la adición de 200 l de solución de bloqueo. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Retire el contenido y lavar cada pocillo 3 veces con agua destilada.
    3. Realizar ELISA indirecto (Protocolo de 5.1 a 5.7) para determinar el título de los sueros para la primera proyección. Elige el ratón con el título más alto (el más alto de la densidad óptica) para la recolección del bazo.
  9. Tres días antes de la recolección del bazo, inocular 0,1 mg de inmunógeno 1 por vía subcutánea en el ratón presentar el título más alto.
  10. Recoger las células del bazo de los ratones inmunizados seleccionados y se fusionan con células de mieloma murino F0 (SP2 / 0-Ag14) para obtener células de hibridoma para la generación de mAb 18.
  11. 14 días después de la fusión, seleccionar los clones positivos mediante el cribado de la reactividad de los sobrenadantes de hibridoma hacia péptido sintético sin el uso de ELISA indirecto (Protocolo de 05.01 a 05.07).
  12. Diluir las células con un número apropiado por pocillo durante maximizing la proporción de los pozos que contienen sólo un clon único (clonación de dilución).
    1. Añadir 100 l de medio de cultivo celular a todos los pocillos de la placa de 96 pocillos, excepto A1 así que se deja vacía.
    2. Añadir 200 l de la suspensión celular a bien A1. A continuación, traslado rápido 100 l de A1 a B1 y mezclar suavemente con la pipeta. Repita estos 1: 2 diluciones por toda la columna, y luego descarta 100 l de H1 de manera que termina con el mismo volumen que los pozos por encima de ella.
    3. Añadir un 100 l adicionales de medio a la columna 1 con una micropipeta de 8 canales. Entonces transferir rápidamente 100 l de cada uno de los pocillos de la columna 1 a los de la columna 2 utilizando la misma pipeta, y se mezcla pipeteando suavemente.
    4. Con las mismas puntas, repita estos 1: 2 diluciones en toda la placa. Desechar 100 l de cada uno de los pocillos en la última columna.
    5. Llevar el volumen final de todos los pozos a 200 l mediante la adición de 100 l de medio a cada pocillo. incubar plate reposo a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado.
    6. Compruebe cada pocillo y marcar todos los pocillos que contienen sólo una sola colonia. Llevar a cabo dos o más clonaciones hasta> 90% de los pocillos que contienen clones individuales son positivos para la producción de anticuerpos.
  13. Se tamizan los clones mediante western blot y dot blot (protocolo de 3.1 a 4.6). A continuación, las colonias de subcultivo de los pozos en los vasos más grandes para expandir las células para la obtención del MAB. Por lo general, cada clon se transfiere en un solo pocillo en una placa de 12 o 24 pocillos.
  14. Medir la afinidad entre los anticuerpos monoclonales y los extractos de músculo de vaca, cabra, cerdo, perro, conejo, atún, pollo, sello, y cuatro especies de cetáceos representativos de western blot y dot blot (protocolo de 03.01 a 04.06).
  15. Inocular células de hibridoma seleccionadas (hasta 3 x 10 6) por vía intraperitoneal en ratones para inducir la ascitis. hinchazón abdominal suele ser evidente dentro de los 7-10 días después de la inyección de hibridoma. Recoger líquido mediante una aguja hipodérmica(Menos de 20 gauge).
  16. fluido de ascitis Se centrifuga (10.000 xg durante 10 min) para eliminar las células y los desechos. Filtrar a través de un filtro de 0,45 micras. Añadir 1 a 20 ml de la muestra de tampón de unión, 15 ml, y de 3 a 5 ml de tampón de elución en la columna G Sepharose la proteína. Recoger la fracción de elución que contiene el anticuerpo se purificó del fluido ascítico de ratones.
  17. Determinar el isotipo de anticuerpos por kit Isotipificación de anticuerpos utilizando las instrucciones del fabricante.

3. Western Blot

  1. Preparar tampón de carga 2x que contiene β-mercaptoetanol (BME) mediante la mezcla de 950 l de tampón de muestra 2x Laemmli con 50 l de BME. Diluir los sobrenadantes musculares (protocolo de 1/1 a 1/4) en tampón de carga con una relación adecuada para la obtención de buenas señales: 1:50 (cetáceos y sello) y 1: 5 (animales domésticos y de atún) utilizando anticuerpo Mb policlonal de conejo anti-humano, y 1: 1 (cerdo, conejo, pollo y atún), 1: 5 (vaca, cabra y el perro) y 1:25 (cetáceos y el sello) cuando unantibody es de sobrenadante de hibridoma.
  2. muestra de calor a 95 ° C durante 5 min. Cargar las muestras en los pocillos de gel SDS-PAGE (4% de apilamiento de acrilamida y 12% de separación de acrilamida), junto con marcadores de peso molecular. Ejecutar el gel durante 5 min a 50 V a continuación, aumentar el voltaje a 150 V para terminar la carrera en aproximadamente 1 hr.
  3. Colocar el gel en tampón de transferencia 1x durante 15 minutos. Transferir la proteína separada a nitrocelulosa (NC) membranas después de que se separaron mediante PAGE. Puede realizar la transferencia a 100 V durante 60 a 90 min.
  4. Preparar la solución de bloqueo: 1x PBS que contiene 0,1% de Tween 20 con leche descremada en polvo 5%. Bloquear la membrana NC en 25 ml de solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora. Lavar tres veces durante 5 minutos cada uno con 15 ml de solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (PBST).
  5. Incubar la membrana y el anticuerpo primario (líquido ascítico o sobrenadante de hibridoma) en 10 ml de tampón de dilución de anticuerpo diluido con solución de bloqueo 5% a 4 ° C durante la noche.
  6. Lavar el Membranase nuevo tres veces con PBST para limpiar anticuerpo excesiva.
  7. Incubar la membrana con alcalina de cabra conjugada con fosfatasa anti-IgG de ratón a 1: 1250 en solución bloqueante con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente.
  8. Se lava la membrana de nuevo y se incuba en el cloruro de fosfato / p-nitroazul tetrazolio 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP / NBT) fosfatasa mezcla de sustrato para 10 a 20 min hasta que el desarrollo de color.
  9. Detener la reacción por lavado de la membrana en varios cambios de agua destilada.

4. Dot Blot

  1. Diluir los sobrenadantes musculares (protocolo de 1.1 a 1.4) en 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBST con relación apropiada para la obtención de buenas señales: 1: 5 para los animales domésticos y el atún, y 01:25 para los cetáceos y sello. Punto 5 l de las muestras sobre una membrana. Reducir al mínimo el área que la solución penetra (por lo general 3-4 mm de diámetro) mediante la aplicación lentamente.
  2. Secar la membrana a temperatura ambiente (por ejemplo, </ Em> en un flujo laminar de 30 a 60 min), bloquearla con la solución en una placa de Petri de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lava con PBST.
  3. Incubar la membrana con anticuerpo primario (mAb de sobrenadante de hibridoma en 1: 10.000 o fluido de ascitis en 1: 100 000 diluido en solución de bloqueo 5%) durante 1 hora a temperatura ambiente.
  4. Uso PBST para lavar la membrana tres veces durante 5 minutos cada uno para eliminar el exceso de anticuerpo, y luego se incuba con el anticuerpo secundario (alcalina de cabra conjugada con fosfatasa anti-IgG de ratón a 1: 1250 en 5% de solución de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente .
  5. Se lava la membrana de nuevo y se incuba en la mezcla de sustrato de fosfatasa BCIP / NBT dentro de 10 a 20 min hasta que el desarrollo de color.
  6. Detener la reacción por lavado de la membrana en varios cambios de agua destilada.

5. ELISA indirecto

  1. Preparar tampón de lavado (0,002 M imidazol solución salina tamponada con 0,02% de Tween 20). Lavar la placa 3 veces con el lavadoamortiguador entre cada paso siguiente (protocolo 5.2-5.5).
  2. Preparar una dilución 1:25 de sobrenadantes musculares (protocolo 1.1-1.4) en tampón de recubrimiento. Escudo una placa de ELISA de 96 pocillos con 100 l sobrenadantes diluidos en 4 ° C durante la noche y bloquear con tampón de bloqueo (1% BSA en PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente.
  3. Preparar una dilución 1: 2000 del mAb purificado con tampón diluido y añadir 100 l de mAb diluido a cada pocillo. Incubar la placa durante 1 hora a temperatura ambiente.
  4. Agregar de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilución 1: 200 en tampón diluido) para una incubación adicional.
  5. Añadir sustrato de peroxidasa a cada pocillo (100 l / pocillo) y se incuba durante 10 a 15 min.
  6. Detener la reacción enzimática por la solución de parada peroxidasa (100 l / pocillo), cuando se observa el desarrollo de color.
  7. Leer la densidad óptica a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas.

6. Preparación del anticuerpo monoclonal marcado con oro coloidal

Nota: El color de la solución de oro coloidal y la mezcla siempre debe ser de color rojo. Ajustar el pH, la concentración de mAb, la velocidad centrífuga cuando se observa precipitado negro. Los pasos 6.1 y 6.2 son pasos de optimización.

  1. Añadir purificada detección de mAb (50 mg / ml, 3 l) a 100 l de solución de oro coloidal con valores de pH que varían de 5-9. El pH mínimo que mantiene el color rojo durante dos horas se considera como el pH óptimo. Nota: En este estudio, se utilizó 0,1 M de carbonato de potasio para ajustar el oro coloidal (40 nm) solución a pH 8,0 (pH óptimo).
  2. Añadir diversas cantidades de purificados detección de mAb (500 g / ml, 1 a 20 l) a 100 l de solución de oro coloidal a un pH de 8,0. Nota: La concentración óptima en este estudio es de 6 g / ml (sin precipitado negro).
  3. De acuerdo con los resultados anteriores, añadir 60 g de la detección de mAb purificado gota a gota a 10 ml de solución de oro coloidal. Emulsionar la mezcla suavemente a temperatura ambiente durante 10 min. Anunciod 2 ml de solución de 5% de BSA en PBS (pH 7,4) a la mezcla y emulsionar suavemente a temperatura ambiente durante 15 min para reducir la interferencia de fondo.
  4. Se centrifuga la mezcla a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
  5. Eliminar el sobrenadante con anticuerpo no conjugado con cuidado y suspender los sedimentos resultantes en 4 ml de PBST que contenía 1% de BSA y 0,1% de Tween 20, y repetir la centrifugación y la suspensión varias veces.
  6. Suspender los precipitados finales en 1 ml de PBST y almacenarla a 4 ° C hasta su utilización.

7. Construcción de Inmune Strip

Nota: La Figura 1 muestra el diseño de la tira inmune. Preparar y montar las tiras en un laboratorio las condiciones ambientales de humedad baja (<20% de humedad relativa) durante el período de conservación prolongado (> 1 año). Las dimensiones de las almohadillas y membranas son: compresa de conjugado 300 mm x 10 mm, 300 mm almohadilla absorbente x 24 mm, 300 mm almohadilla de la muestra x 24 mm, Carolina del Norte membrana de 300 mm x 25 mm, mesa de trabajo 300mm x 80 mm.

  1. Añadir la solución coloidal marcado con oro mAb desde el paso 6.6 con una micropipeta para saturar la almohadilla de conjugado y luego se seca a 37 ° C durante 1 hora antes de montar.
  2. Distribuir el antígeno específico de captura de mAb (500 g / ml) en la zona de ensayo, y de conejo anti-IgG de ratón (500 mg / ml) en la zona de control para la detección de mAb sobre la membrana NC utilizando una impresora pipeta o immunostrip. Mantener una distancia (> 5 mm) entre las dos zonas para evitar interferencias.
  3. Pegar la almohadilla conjugada, almohadilla absorbente y la membrana de Carolina del Norte en la mesa de trabajo con cinta de doble cara.
    Nota: La superposición de las pastillas en cada lado de la membrana de NC en alrededor de 2 mm. construcción tira inapropiado resultará en una prueba incompleta.
  4. Coloque la almohadilla de la muestra sobre la almohadilla de conjugado (2 mm) y pegarlo en el área de trabajo.
  5. Crear tiras de 6 mm de ancho con un cortador de papel. Empacar las tiras en la bolsa de papel de aluminio con desecante, y almacenar a 4 ° C hasta su utilización.

8. Prueba de reactividad cruzada

  1. Homogeneizar 0,03 g de muestra de músculo crudo con 1 ml de PBS (que contiene 0,1% de BSA) en un tubo de centrífuga de 1.5 ml utilizando una vara de bambú o de molienda varilla.
  2. Mantenga la tira por el extremo opuesto a las áreas de prueba y sumergir la parte de la almohadilla de la muestra en la muestra durante 5-10 minutos y observar el resultado directamente.
    1. Opcional: Recoger 500 l sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo de centrífuga.
      Nota: Este paso se sugiere si la señal no es obvia cuando la tira se sumerge directamente en el sobrenadante.
  3. Probar varias muestras de músculo por triplicado.
    Nota: Aquí hemos probado el atún, pollo, sello, 15 especies de cetáceos y 5 especies de mamíferos terrestres.
  4. Tienen cinco inspectores independientes repiten 8,3 por cinco veces, es decir, utilizan tiras 575 en total.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Características de anticuerpos monoclonales

Hemos desarrollado dos IgG 1 mAb (CGF5H9 y CSF1H13) que reconocen dos péptidos sintéticos (MKASEDLKKHGNTVLC y AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivamente, de los cetáceos Mb, y éstos se utilizaron para construir una tira de prueba inmunocromatográfica de oro coloidal de tipo sándwich para la detección rápida de Mb de cetáceos. Figura 2 muestra que CGF5H9 detecta cetáceos y otros mamíferos como una sola banda teñi...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El uso de un péptido sintético conjugado con la proteína portadora es notablemente más eficaz en comparación con su proteína afín. Para una técnica basada en sándwich, debido a que el MAB se desarrolla utilizando epítopos con ubicaciones relativas conocidas, los dos anticuerpos monoclonales en este estudio no pueden interferir con la interacción de cada uno con el epítopo del antígeno diana. Además, la reactividad entre la proteína nativa y el anticuerpo de ratones inmunizados con el conjugado de péptido sintético puede...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a los colegas de la Sociedad de Cetáceos de Taiwán, el Centro de Investigación de Biología Marina y Cetáceos de la Universidad Nacional Cheng Kung, el Parque Oceánico Farglory y el Centro de Diagnóstico de Enfermedades Animales de la Universidad Nacional de Chiayi por la recolección de muestras. Este proyecto fue financiado por una subvención del Consejo de Agricultura de Taiwán (100AS-02.1-FB99) a WCY.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina tamponada con fosfatoAMRESCOJ373
Proteína G HP SpinTrap GE  Healthcare28-9031-34 Columna decentrifugación que contiene proteína G Sepharose
IsoStrip Kit de isotipado de anticuerpos monoclonalesde ratón Roche11493027001Tiras de isotipado, prerrecubiertas con anticuerpos anti-Ig de ratón específicos de subclases y cadenas ligeras
Mini Trans-BlotBio-Rad170-3935
Membrana de nitrocelulosaAnticuerpo WhatmanZ613630
solución de bloqueo LTK BioLaboratoriesPara minimizar las interacciones de unión inespecíficas de IgG inespecífica en las muestras
de sustrato de fosfatasa BCIP/NBT KPL50-81-00
Detector de proteínas HRP Microwell Kit, Anti-RatónKPL54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp Placa ELISAThermo  Fisher ScientificEW-01928-08
Multiskan  Lector EX ELISA Termo  Electrón  Corporation51118170
Solución de oro coloidal (40 nm) REGA biotecnología Inc.40-50 nm es apropiado para immunostrip
albúmina sérica bovina,Gibco15561-020
Impresora de prueba rápida immno-stripREGA biotechnology Inc.AGISMART RP-1000 Solo apto para la producción a pequeña escala de inmunotiras con fines de investigación y desarrollo
Componentes de la tira (membranas NC, almohadillas de muestra (vidrio #33, S& S), almohadillas conjugadas (#16S, S& S) y almohadillas absorbentes (CF6, Whatman))REGA biotechnology Inc.
Freund' s adyuvante e incompleto Freund' s adyuvante Sigma-AldrichF5881, F5506Se utiliza para producir emulsiones de agua en aceite de inmunógenos
Acrilamida, tampón de gel, persulfato de amonio (APS), tetrametiletilendiamina (TEMED) ProtechPreparación de gel para SDS-PAGE
Coomassie azul brillante R-250Bio-Rad1610436Tinción de proteínas en geles SDS-PAGE
tampón de muestra Laemmli y β-mercaptoetanolBio-Rad1610737, 1610710Diluir muestras de proteínas antes de cargarlas en geles SDS-PAGE
, , ,

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
  2. Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
  3. Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
  4. Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
  5. Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
  6. Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
  7. Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
  8. Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
  9. Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
  10. Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
  11. Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
  12. Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
  13. Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
  14. Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
  15. Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
  16. Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
  17. Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
  18. Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
  19. Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
  20. Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
  21. Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704(2013).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Colloidal Gold Immunochromatographic Test StripCetacean Myoglobin DetectionMonoclonal Antibody DevelopmentPeptide Sequence AnalysisWestern Blot AnalysisDot Blot AnalysisIndirect ELISA ScreeningMuscle Sample HomogenizationNitrocellulose Membrane AssemblyRapid Field Detection

Artículos relacionados