Artículo de método

Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

DOI:

10.3791/53433

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13 de julio de 2016

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1Department of Veterinary Medicine, National Chiayi University, 2Department of Microbiology and Immunology/Graduate Institute of Biomedical and Biopharmaceutical Sciences, National Chiayi University

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe el desarrollo de dos anticuerpos monoclonales (mAb) de clase IgG fuertemente reactivos a la mioglobina de los cetáceos. Estos mAbs se aplican en una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal basada en el formato sándwich para diferenciar el Mb de los cetáceos de la foca y otros animales.

Resumen

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Este protocolo describe el desarrollo de una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal basada en el formato sándwich que se puede utilizar para diferenciar la mioglobina (Mb) de los cetáceos de la de las focas y otros animales. La franja permite un cribado rápido y sobre el terreno de la carne de cetáceos, restringiendo así su comercio y consumo ilegales. Se desarrollaron dos anticuerpos monoclonales (mAb) con reactividad frente al Mb de cetáceos. Se analizaron las secuencias de aminoácidos de las regiones reactivas antigénicas Mb de varios animales con el fin de diseñar dos péptidos sintéticos (un péptido general y un péptido específico) y posteriormente elevar los mAbs (subclase IgG1). Los mAbs se seleccionaron a partir de hibridomas cribados por ELISA indirecto, Western blot y dot blot. CGF5H9 fue específico para los Mbs de conejos, perros, cerdos, vacas, cabras y cetáceos, mientras que mostró una afinidad débil o nula con los Mbs de pollos, atunes y focas. CSF1H13 pueden atar a focas y cetáceos con fuerte afinidad, pero no mostraron afinidad con otros animales. En este estudio se utilizaron muestras de cetáceos de cuatro familias (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae y Kogiidae), y los resultados indicaron que estos dos mAbs tienen una amplia capacidad de unión a Mbs de diferentes cetáceos. Estos mAbs se aplicaron en una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal tipo sándwich. CGF5H9, que reconoce muchas especies, fue marcado con oro coloidal y se utilizó como anticuerpo de detección. CSF1H13, que se recubrió en la zona de ensayo, detectó la presencia de cetáceos y focas Mbs. Se analizaron por triplicado muestras de músculo de atún, pollo, foca, cinco especies de mamíferos terrestres y 15 especies de cetáceos. Todas las muestras de cetáceos mostraron resultados positivos y todas las demás muestras mostraron resultados negativos.

Introducción

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Históricamente, la carne de cetáceo se ha consumido en muchas partes del mundo y este consumo continúa hoy en día1. Debido al nivel trófico de los cetáceos, se sabe que hay altos niveles de mercurio y otras toxinas en su carne2. Por lo tanto, el consumo de carne de cetáceo podría generar un problema de salud no solo para los grupos de alto riesgo, como las mujeres embarazadas, sino también para la población en general3. Además, la contaminación de la carne de cetáceo con patógenos zoonóticos o potencialmente zoonóticos también puede ocurrir durante su procesamiento y almacenamiento4. Es difícil, incluso para los agentes expe....

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Protocolo

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Declaración de Ética: El estudio se realizó de acuerdo con las directrices internacionales y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad Nacional de Chiayi, aprobación ID: 99022. El uso de la muestra de cetáceos fue permitido por el Consejo de Agricultura de Taiwán (Permiso de Investigación 100M-02.1-C-99).

1. Preparación de la muestra del músculo y SDS-PAGE

Nota: Las muestras de músculo de 23 especies, incluyendo 16 especies de mamíferos marinos, 5 especies de mamíferos terrestres, el atún y el pollo se utilizaron en este estudio (Tabla 1)....

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Resultados

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Características de anticuerpos monoclonales

Hemos desarrollado dos IgG 1 mAb (CGF5H9 y CSF1H13) que reconocen dos péptidos sintéticos (MKASEDLKKHGNTVLC y AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivamente, de los cetáceos Mb, y éstos se utilizaron para construir una tira de prueba inmunocromatográfica de oro coloidal de tipo sándwich para la detección rápida de Mb de cetáceos. Figura 2 muestra que CGF5H9 detecta cetáceos y otros mamíferos como una sola banda teñi.......

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Discusión

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El uso de un péptido sintético conjugado con la proteína portadora es notablemente más eficaz en comparación con su proteína afín. Para una técnica basada en sándwich, debido a que el MAB se desarrolla utilizando epítopos con ubicaciones relativas conocidas, los dos anticuerpos monoclonales en este estudio no pueden interferir con la interacción de cada uno con el epítopo del antígeno diana. Además, la reactividad entre la proteína nativa y el anticuerpo de ratones inmunizados con el conjugado de péptido sintético puede.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Agradecemos a los colegas de la Sociedad de Cetáceos de Taiwán, el Centro de Investigación de Biología Marina y Cetáceos de la Universidad Nacional Cheng Kung, el Parque Oceánico Farglory y el Centro de Diagnóstico de Enfermedades Animales de la Universidad Nacional de Chiayi por la recolección de muestras. Este proyecto fue financiado por una subvención del Consejo de Agricultura de Taiwán (100AS-02.1-FB99) a WCY.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina tamponada con fosfatoAMRESCOJ373
Proteína G HP SpinTrap GE  Healthcare28-9031-34 Columna decentrifugación que contiene proteína G Sepharose
IsoStrip Kit de isotipado de anticuerpos monoclonalesde ratón Roche11493027001Tiras de isotipado, prerrecubiertas con anticuerpos anti-Ig de ratón específicos de subclases y cadenas ligeras
Mini Trans-BlotBio-Rad170-3935
Membrana de nitrocelulosaAnticuerpo WhatmanZ613630
solución de bloqueo LTK BioLaboratoriesPara minimizar las interacciones de unión inespecíficas de IgG inespecífica en las muestras
de sustrato de fosfatasa BCIP/NBT KPL50-81-00
Detector de proteínas HRP Microwell Kit, Anti-RatónKPL54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp Placa ELISAThermo  Fisher ScientificEW-01928-08
Multiskan  Lector EX ELISA Termo  Electrón  Corporation51118170
Solución de oro coloidal (40 nm) REGA biotecnología Inc.40-50 nm es apropiado para immunostrip
albúmina sérica bovina,Gibco15561-020
Impresora de prueba rápida immno-stripREGA biotechnology Inc.AGISMART RP-1000 Solo apto para la producción a pequeña escala de inmunotiras con fines de investigación y desarrollo
Componentes de la tira (membranas NC, almohadillas de muestra (vidrio #33, S& S), almohadillas conjugadas (#16S, S& S) y almohadillas absorbentes (CF6, Whatman))REGA biotechnology Inc.
Freund' s adyuvante e incompleto Freund' s adyuvante Sigma-AldrichF5881, F5506Se utiliza para producir emulsiones de agua en aceite de inmunógenos
Acrilamida, tampón de gel, persulfato de amonio (APS), tetrametiletilendiamina (TEMED) ProtechPreparación de gel para SDS-PAGE
Coomassie azul brillante R-250Bio-Rad1610436Tinción de proteínas en geles SDS-PAGE
tampón de muestra Laemmli y β-mercaptoetanolBio-Rad1610737, 1610710Diluir muestras de proteínas antes de cargarlas en geles SDS-PAGE
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Referencias

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  1. Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
  2. Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implic....

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