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Artículo de método

Un microquirúrgica Modelo Novela de heterotópico, en bloque, pared torácica, el timo y el trasplante cardiaco en ratones

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DOI:

10.3791/53442

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23 de enero de 2016

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1Johns Hopkins University School of Medicine, 2Burn and Complex Wound Center, 3Section of Plastic and Reconstructive Surgery, University of Chicago Medical Center, 4Division of Plastic, Reconstructive, and Maxillofacial Surgery, R Adams Cowley Shock Trauma Center, 5Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Lab, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Para estudiar el alotrasplante combinado de órganos sólidos y compuesto vascularizado, describimos un nuevo modelo heterotópico de trasplante de pared torácica, timo y corazón heterotópico en bloque en ratones utilizando una técnica de manguito cervical sin sutura.

Resumen

Se debe continuar explorando nuevas estrategias en el trasplante de órganos para prolongar la supervivencia del injerto y minimizar la necesidad de inmunosupresión de mantenimiento a largo plazo. El empleo del trasplante de médula ósea vascularizada y el cotrasplante de timo se han mostrado prometedores en este sentido en varios modelos animales. 1-11 El trasplante de médula ósea vascularizada permite la transferencia ininterrumpida de células de médula ósea del donante dentro del microambiente del donante preservado, y se ha demostrado que la incorporación de tejido de timo con el trasplante de médula ósea vascularizada aumenta el quimerismo de las células T, lo que en última instancia desempeña un papel de apoyo en la inducción de la regulación inmunitaria. La combinación de alotrasplante de órganos sólidos y alotrasplante compuesto vascularizado puede combinar de manera única estas estrategias en forma de un nuevo modelo de trasplante. Los modelos murinos sirven como un excelente paradigma para explorar los mecanismos del rechazo agudo y crónico, el quimerismo y la inducción de tolerancia, proporcionando así la base para propagar estrategias superiores de supervivencia del injerto para modelos animales más grandes y futuras aplicaciones clínicas. En este trabajo, desarrollamos un nuevo modelo heterotópico heterotópico de trasplante de pared torácica, timo y corazón en ratones utilizando una técnica de manguito cervical sin sutura. La experiencia en trasplantes singénicos y alogénicos se describe para futuras investigaciones inmunológicas más amplias a través de un manuscrito instructivo y un suplemento de video.

Introducción

El trasplante cardíaco es el tratamiento de elección para la insuficiencia cardíaca terminal. Tanto los avances técnicos como las innovaciones farmacológicas han impulsado el campo a tasas de aceptación temprana del injerto superiores al 90%. 12,13 A pesar de ello, el 60-80% de la supervivencia del injerto a 5 años está estancada y el rechazo crónico, caracterizado por vasculopatía del trasplante, sigue siendo inevitable. 14-16 Además, los pacientes son sometidos a múltiples procedimientos quirúrgicos e inmunosupresión de por vida, que se asocian con deformidades de la pared torácica y secuelas médicas y toxicidades, respectivamente. La necesidad de enfoques innovadores para prolongar la supervivencia del aloinjerto, minimizar los requisitos inmunosupresores y ofrecer opciones reconstructivas para las deformidades anatómicas es apremiante.

El alotrasplante compuesto vascularizado ofrece una estrategia única para mejorar los resultados del trasplante de corazón tanto desde el punto de vista inmunológico como reconstructivo. 17 Los aloinjertos compuestos vascularizados también son únicos en el sentido de que tienen una fuente inherente de células madre hematopoyéticas derivadas de donantes que han demostrado una capacidad favorable para reducir la inmunosupresión e inducir y mantener el quimerismo mixto. 1-8 Además, se ha demostrado que el cotrasplante de timo prolonga la supervivencia tanto de los trasplantes de órganos sólidos como de los aloinjertos compuestos vascularizados. 2,9-11 La combinación de estas estrategias con el trasplante cardíaco ofrece una solución novedosa a los retos mencionados anteriormente a los que se enfrenta el trasplante cardíaco. 18

Los modelos murinos sirven como excelentes plataformas para la investigación mecanicista in vivo debido a la disponibilidad de anticuerpos y cepas endogámicas y knockout bien definidas. 19-21 Aunque el trasplante cardíaco en ratones se estudia comúnmente utilizando un modelo de trasplante de sutura microquirúrgico intraabdominal heterotópico22-25, un modelo heterotópico, cervical, sin manguito de sutura, ha demostrado ser extremadamente replicable, confiable y conlleva menos tasas de trombosis. 19,26,27 El objetivo de este estudio es desarrollar una técnica heterotópica en bloque de trasplante osteomiocutáneo de pared torácica, timo y corazón en ratones para estudiar los mecanismos inmunológicos del alotrasplante combinado de órganos sólidos y compuesto vascularizado utilizando una técnica de manguito cervical sin sutura. Este aloinjerto en racimo se perfunde a través de la anastomosis del donante, descendiendo la aorta hasta la arteria carótida común derecha y la arteria pulmonar del donante hasta la vena yugular externa derecha. La preservación de los vasos torácicos internos y las ramas del timo asociadas es primordial para la perfusión de la pared torácica (esternón, costillas, músculos y piel) y el timo.

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Protocolo

Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en cumplimiento de la Universidad Johns Hopkins y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y los requisitos del Servicio de Salud Pública. Este protocolo sigue el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Johns Hopkins, junta de revisión institucional aprobó directrices (número de protocolo M013M490). Datos de supervivencia final se registró durante los procedimientos quirúrgicos se describen a continuación. Tanto los animales donantes y receptores reciben anestesia preventivos utilizando buprenorfina a 0,1 mg / kg sc una hora antes de la cirugía y en el buprenorfina animal receptor es re-administrado a la misma dosis después del trasplante y re-dosifica según sea necesario en las primeras 48 horas después de cirugía.

1. Donantes aloinjerto Recuperación

Nota: Comience la porción donante del trasplante de 40 minutos antes que el beneficiario del trasplante para minimizar el tiempo de anestesia destinatario y para facilitar una hora de finalización simultánea o ligeramente oídohora de finalización lier frente a la preparación destinatario.

  1. Utilice instrumentos de microcirugía estériles estándar y guantes estériles para el procedimiento. Nuestro laboratorio utiliza la esterilización en autoclave de los instrumentos de microcirugía.
  2. Anestesiar el ratón donante (masculina) con vaporizador inducción isoflurano en el 4%. Uso de las podadoras mecánicas atraumáticos eliminar el pelo de la cervical, torácica y región abdominal. Colocar el animal en posición supina y mantener isoflurano en 1-2% a través de un cono de nariz. Asegurar una anestesia adecuada durante todo el procedimiento, mediante la evaluación periódica del reflejo de retirada pizca dedo del pie.
  3. Antes de la incisión en la piel, ampliamente preparar el operativo mediante la aplicación de povidona yodada antiséptico seguida por el alcohol isopropílico con un hisopo de algodón estéril.
  4. Comience con una incisión en la piel transverso superficial con unas tijeras a través de la piel cervical y abdominal. Conecte los dos incisiones de forma bilateral a lo largo de las líneas medioaxilares.
  5. Con unas pinzas de microcirugíadiseccionar la región cervical bilateral para identificar, ligar y dividir las venas yugulares externas con sutura de seda 6-0 y tijeras. Luego, utilizando electrocauterio dividir los músculos esternocleidomastoideo para exponer las venas yugulares internas y las arterias carótidas comunes, de forma bilateral. Pasar una sutura de seda 6-0 bajo la del lado izquierdo y el lado derecho de la carótida común y venas yugulares internas en la moda al por mayor.
    NOTA: Se les ataron y se dividen después en el paso 1.9.
  6. Bruscamente dividir a los músculos de la correa y el tejido areolar laxo asociado, situado por delante de la tráquea, utilizando tijeras para liberar a los apegos restantes de la región cervical.
  7. El uso de electrocauterio bipolar y disección cortante, dividir los músculos principales y las clavículas pectorales para exponer los vasos subclavia y ligar (6-0 sutura de seda) y dividir proximal.
  8. Luego, suavemente, agarre y retirar el pene del animal. A lo largo del dorso del pene visualizar la vena dorsal del pene, y desinfectar elregión con alcohol isopropílico. Usando una aguja 30 G, inyectar 30.000 unidades de heparina por vía intravenosa a través de la vena dorsal del pene y permiten a retroceder de nuevo a su posición original. Pueden producirse fugas parcial de la solución de heparina en el tejido circundante.
  9. El uso de los lazos a granel previamente colocados alrededor de la arteria carótida común y la vena yugular interna, ligar y dividir las estructuras, de forma bilateral.
  10. Uso de las tijeras Siguiente para hacer una incisión transversal intraabdominal. Eviscerar los intestinos para exponer la vena cava inferior infrahepática e inyectar 2 ml de solución fría cardioplegia Euro-Collins en el infrahepática vena cava inferior. Asegúrese de inyección adecuada mediante la visualización de la decoloración del hígado y el cese de los latidos del corazón antes de avanzar a la siguiente etapa.
    NOTA: la solución Euro-Collins es preparado en nuestro laboratorio, ver tabla de reactivos e instrumentos específicos.
  11. Con una tijera acceder a la cavidad intratorácica a través de un diaph bilateralragmatic incisión del abdomen expuesto. Extienda la incisión cefálica través de los músculos intercostales y las costillas. Representativas de la pared torácica exponer el corazón, el timo, y los grandes vasos garantizando al mismo tiempo la conservación de los vasos torácicos internos a lo largo de la pared torácica.
  12. Inyectar el suprahepática vena cava inferior con 4 ml de solución fría cardioplegia Euro-Collins.
  13. Identificar la raíz de la aorta y rastrear de manera distal a la aorta descendente. Bruscamente cortar la aorta descendente (preservando longitud máxima).
  14. Identificar el tronco pulmonar y dividir justo proximal a su punto de ramificación (preservación de longitud máxima). Luego, utilizando 2 ml de solución fría cardioplegia Euro-Collins, lave el tronco pulmonar y el corazón mediante la colocación de un catéter de punta de plástico blando en el lumen del tronco pulmonar.
  15. Usando una sutura de seda 6-0, ligar y dividir la vena cava inferior, confluencia de las venas pulmonares, y las ramas accesorias de la vena cava superior bilateral. Luego elevary diseccionar el cefálica corazón de los apegos a lo largo de la principal bronquios y la tráquea, con cuidado de no entrar en la vía aérea. El uso de electrocauterio bipolar aguda y diseccionar la pared torácica, el timo, y el corazón liberar completamente del ratón donante.
  16. Por último, recortar la pared torácica aloinjerto ex vivo a un tamaño más pequeño, con unas tijeras, a lo largo del esternón y costillas laterales, con cuidado de no romper los vasos torácicos internos (Figura 1A). Para minimizar la hemorragia después de la revascularización, utilice electrocauterio bipolar a lo largo de las fronteras del esternón osteomusculocutaneous.
  17. Coloque el aloinjerto en 10 ml de frío (4 ° Celsius) solución Euro-Collins si el destinatario no está preparado para la inserción. Sin embargo, si el receptor está listo para inserción, transferir el aloinjerto directamente al campo operatorio destinatario.

2. Destinatario Preparación

Nota: Para minimizar el tiempo de anestesia destinatario,comenzar la preparación receptor en una estación operativa separada aproximadamente 40 min antes de la finalización de la cosecha del injerto donante.

  1. Utilice un conjunto separado de instrumentos de microcirugía estériles estándar y guantes estériles para el procedimiento.
  2. Anestesiar el ratón receptor (hombre o mujer) con vaporizador inducción isoflurano en el 4%. El uso de las podadoras mecánicas atraumáticos quitar el pelo de la región cervical y torácica derecha.
  3. Coloque el ratón en la posición supina y el ángulo de la extremidad superior derecha ligeramente por abajo formando un ángulo de 110 grados entre la cabeza y el miembro superior derecho. Mantener la anestesia en el 1-2% isoflurano a través de un cono de la nariz.
  4. Coloque petróleo ungüento oftálmico en los ojos de ratón utilizando un aplicador con punta de algodón. Antes de la incisión de la piel, ampliamente preparar el sitio de la operación usando povidona yodada antiséptico seguido por alcohol isopropílico.
  5. Con unas tijeras, hacer una incisión en la piel de la línea media a lo largo del bor inferior derechoder de la mandíbula y extender la incisión infero-lateral a la región torácica derecha. Utilizando disección roma con pinzas microvasculares, movilizar a la vena yugular externa circunferencialmente libre del vaso de tejidos blandos y adventicia. Divida todas las ramas utilizando electrocauterio, y quitar el lóbulo derecho de la glándula submandibular mediante disección cortante y electrocauterio para liberar espacio para el aloinjerto.
  6. Asegurar suficientemente la longitud de la vena yugular externa para la eversión sobre un manguito, y se liga la vena yugular externa utilizando una sutura de seda 6-0. Inserte la vena a través del lumen de un manguito de poliimida de precorte y utilizar una pinza microvascular bulldog para fijar el complejo buque-manguito en su lugar. Luego, utilizando tijeras, proximal dividir la vena yugular externa, Evert sobre el brazalete, y fijar en su lugar con una sutura de nylon 10-0. (Figura 1B)
  7. Divida el músculo esternocleidomastoideo derecho con electrocauterio bipolar para exponer la arteria carótida común. Mafia circunferencialmenteilize la arteria cefálico al punto más distal dentro de la región cervical. Esto se logra utilizando disección roma del vaso con pinzas para eliminar el tejido blando y adventicia circundante.
  8. El uso de sutura de seda 6-0, ligar y dividir la arteria carótida común. Pase la arteria a través de la luz de un manguito de poliimida precortadas y fijarlo en su lugar con una pinza microvascular bulldog tan cerca de la entrada torácica posible. Divida el vaso distal, dilatar suavemente el recipiente usando un dilatador microquirúrgica, Evert sobre el brazalete, y fijar en su lugar con una sutura de nylon 10-0. (Figura 1B)
    NOTA: El dilatador microquirúrgica específica se describe en la tabla de reactivos e instrumentos específicos.

3. aloinjerto Inserción

  1. Mantener la instrumentación estéril estándar y guantes estériles para colocar el injerto dentro de la región cervical destinatario en un revés y la posición oblicua.
  2. A continuación, coloque el aor descendente donantelumen de tics más de la construcción del manguito arterial del receptor y fijarlo en su lugar con una sutura de nylon 10-0 (Figura 1C y 1D).
  3. Moda mismo anastomosis como en el paso 3.2 entre la arteria pulmonar donante y la eversión constructo yugular venosa-manguito exterior del ratón receptor (Figura 1C y 1D).
  4. Primero quite pinza microvascular venosa (pinza vena yugular externa) y luego liberar la pinza arterial (abrazadera de la arteria carótida común). Durante la reperfusión arterial, inspeccionar la totalidad del aloinjerto para abordar cualquier hemorragia. Si se visualiza la hemorragia, vuelva a aplicar la pinza arterial para minimizar la pérdida de sangre y mitigar la fuente de la hemorragia mediante electrocauterio bipolar.
  5. Inspeccione el injerto y asegurar la hemostasia. Suelte y retire completamente la pinza microvascular arterial. Observar el corazón a mostrar signos de reperfusión, que serán instantáneamente evidente con la expansión de volumen rápida de las cámaras del corazón, y esperar a que bcomer para comenzar dentro de 0,5 a 1 min. Utilice solución salina tibia (35 ° Celsius) para humedecer el corazón.
  6. Coloque la pared del pecho en una posición anatómica a fin de no inducir a cualquier formación de cocas o tensiones en las anastomosis. Cierre de la piel de la herida quirúrgica está utilizando 6-0 suturas de nylon continuo (Figura 1E).

4. Cuidado posoperatorio

  1. Administrar un bolo intraperitoneal 0,3 ml de solución salina normal inmediatamente después de la operación para la reposición de líquidos.
  2. Entonces inyectar subcutáneamente buprenorfina (0,1 mg / kg) y enrofloxacina (5 mg / kg) para la profilaxis de dolor y la infección, respectivamente.
  3. Colocar el animal bajo una lámpara de calor hasta que se despierta de la anestesia y volver al decúbito esternal. Durante la recuperación, inspeccione el cuello para visualizar el latido fibrilación del aloinjerto asegurar una adecuada perfusión del injerto.
  4. Una vez despierto y en la posición reclinada, devuelva el ratón a una jaula separada (sin la compañía de otros ratones) Donde pueda recibir alimentos y agua ad libitum. Debido a cualquier movimiento restrictiva menor temporal de la extremidad superior derecha, deje una fuente de alimento de gelatina en el suelo de la jaula.
  5. Observe el ratón receptor durante 1 hora después de la operación y luego regresar a su centro de la jaula donde pueda recibir alimentos y agua ad libitum y se inspeccionados tres veces al día durante las primeras 24 horas para la actividad y la ingesta nutricional. Monitorear los ratones para detectar signos de dolor y angustia y re-dosis con buprenorfina (0,1 mg / kg) por vía subcutánea dos veces al día según sea necesario para las primeras 72 horas. Examine los animales todos los días a partir de entonces y les pesan cada semana.
  6. Consulte con un miembro del personal veterinario, si alguna ratones muestran signos de dolor, angustia, o disminución de la ingesta de alimento. Considere la eutanasia precoz (en nuestro protocolo de la técnica de la eutanasia emplea CO 2 sobredosis de 7 min, seguido por dislocación cervical).
  7. El cese de los latidos del corazón del aloinjerto se define como un parámetro específico que provocó el ratón para ser sacrificed.

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Resultados

Singénica C57BL / 6 trasplantes logra la supervivencia a largo plazo. El diseño del aloinjerto (Figura 1) demostró ser un éxito desde una perspectiva supervivencia de los animales y la capacidad de evaluar la supervivencia del aloinjerto en curso. Esto fue demostrado a través de la piel suprayacente seguir siendo viable, crecimiento activo aloinjerto permanente del cabello, y los latidos del corazón pudieron ser evaluados con la visualización y palpación del dedo. Los datos de supervivencia se represent...

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Discusión

Hay una multitud de fenómenos que un factor en la investigación inmunológica de alotrasplante, que incluyen pero no se limitan a los mecanismos de rechazo agudo y crónico, la presentación directa e indirecta antígeno, la sensibilización destinatario, o la inducción de quimerismo mixto. 19 Los modelos animales se han convertido el estándar de oro para el estudio de la inmunología del trasplante y modelos de ratón se implementan popularmente debido a su bajo costo, la disponibilidad de ratones transgénicos y kn...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses o divulgación financiera que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Premio Académico 2014 de la Asociación Americana de Cirujanos Plásticos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Euro-CollinsLa solución no se compra comercialmente, sino que se prepara en el laboratorio. Para hacer una solución de 500 ml, agregue el ingrediente que se enumera a continuación a 330 ml de agua destilada doble. Mezcle bien y luego llene el resto de los 170 ml de agua bidestilada en la solución hasta un volumen final de 500 ml.
Ingredientes: 1,02 g KH2PO4, 3,66 g K2HPO4, 0,56 g de KCl, 0,42 g de NaHCO3 y 17,52 g de glucosa.
SuturaEthilonMWI 726676-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Suministros Veterinarios)
Vena de manguito de poliimida (21G)Vention Medical141-0043http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Arteria de manguito de poliimida (24G)Vention Medical141-0027http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Catéter de punta de plástico blandoTerumoSR*OX2419CA24G x 3/4" 
dilatador microquirúrgicoS& TD-5a.1Dilatador, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d
Solución

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Trasplante heterotópico en bloquealotrasplante compuesto vascularizadotrasplante cardíaco murinotimo y corazón de la pared torácicatécnica de manguito sin suturaanastomosis vascular microquirúrgicatejido hematopoyético derivado del donantetrasplante de tejido linfoide primarioinducción de tolerancia inmunitariamodelo de supervivencia de aloinjertos
Un microquirúrgica Modelo Novela de heterotópico, en bloque, pared torácica, el timo y el trasplante cardiaco en ratones
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