Se describe un protocolo para la preparación de distribuciones de cromosomas de plantas mitóticas de alta calidad mediante un método rápido de secado al aire adecuado para la detección FISH de sondas de ADN de copia única y alta.
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Artículo de método
Una caída Cromosoma Aire seco Rápido Método de preparación adecuados para FISH en Plantas
En este artículo
Resumen
Resumen
Preparación de extensiones de cromosomas es un requisito previo para el buen desarrollo de la hibridación in situ fluorescente (FISH). Preparación de alta calidad extensiones de cromosomas planta es un reto debido a la pared celular rígida. Uno de los métodos aprobados para la preparación de cromosomas de la planta es una preparación gota llamada, también conocido como gota de dispersión o la técnica de secado al aire. A continuación, presentamos un protocolo para la preparación rápida del cromosoma mitótico extiende adecuado para la detección FISH de sondas de ADN individuales y altos de copia. Este método es una variante mejorada del método de la gota de secado al aire se realiza bajo una humedad relativa de 50% -55%. Este protocolo se compone de un número reducido de etapas de lavado que hace su aplicación fácil, eficiente y reproducible. Obvios beneficios de este enfoque son bien extendidas, metafase los cromosomas intactos y numerosos que sirven como requisito previo perfecto para el análisis FISH éxito. El uso de este protocolo se obtuvo chrom de alta calidadOsome márgenes y resultados de FISH reproducibles para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum y Secale cereale.
Introducción
Hibridación in situ fluorescente (FISH) es una herramienta eficaz para el mapeo físico de las secuencias de copia única y altas a nivel cromosómico. Requisito previo es la preparación de extensiones de cromosomas de alta calidad. No hay cromosoma protocolo general de preparación que sería igualmente adecuado para células animales y vegetales. Preparación de cromosomas de la planta es particularmente difícil debido a la pared celular rígida y varios consistencia citoplasma dentro de diferentes especies. Uno de los métodos favorables para la preparación de cromosomas de la planta es una técnica de caída de llamada también conocida como técnica de la gota de di....
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Protocolo
1. Cromosoma Preparación
- La germinación de semillas y fijación de puntas de las raíces
- 10-20 germinar semillas de cebada en dos capas de papel de filtro húmedo en una placa de Petri bajo condiciones de oscuridad durante 2 días a 22-24 ° C. Cortar las raíces vigorosas con la longitud de 1-2 cm de la semilla mediante el uso de una cuchilla de afeitar.
- Preparar agua helada mediante la colocación de una botella de vidrio de 500 ml que contiene agua fría del grifo en agua con hielo picado. Airear el agua helada y se sumerja puntas de las raíces durante 20 horas para aumentar la frecuencia de las células en metafase.
- Transferencia de....
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Resultados
Diapositivas microscópica con los diferenciales en metafase de la mitosis se prepararon por el método de preparación rápida secar al aire el cromosoma de goteo descrita anteriormente (Suppl. Figura 1). FISH análisis se llevó a cabo utilizando tanto, secuencias repetitivas y de una sola copia. Las imágenes se obtuvieron por un microscopio de epifluorescencia con un conjunto de filtros que permite la excitación de los fluoróforos correspondientes y capturados por una cámara CCD monocromo de alta sensibili.......
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Discusión
El experimento preparación cromosoma se ha llevado a cabo utilizando las raíces jóvenes de cereales pertenecientes a la familia de las gramíneas (Poaceae). Todas las especies analizadas tienen 14 cromosomas en metafase relativamente largo mitótico (11 a 15 micras) en el conjunto del genoma diploide y pertenecen a especies de gran genoma (05.01 a 07.09 GBP).
Longitud de raíces germinadas no era más de 2 cm para obtener un máximo de tejido meristemático. La sincronización de las células en div.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a la DFG por su apoyo financiero (HO 1779/21-1), así como a Katrin Kumke y al Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) por su asesoramiento técnico.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa caliente | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Celulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Celulasa | CalBioChem | 219466 | |
| Pectoliasa | Sigma | P3026 | |
| Citohelicasa | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | fluorocromo directo |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | fluorocromo directo |
| Microscopio de fluorescencia | Olympus BX61 | BX61 | |
| Cámara CCD | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Vector Laboratories | Colorante fluorecsent | H-1200 |
Referencias
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al.
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Reimpresiones y permisos
